活细胞中细胞形态变化的成像 果蝇 胚胎

摘要

黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）的早期发育过程以一系列适合成像研究的细胞形态变化为特征。本文将介绍对黑腹果蝇胚胎进行活体共聚焦成像所需的基本工具和方法，并重点描述一种称为细胞化（cellularization）的细胞形态变化过程。

摘要

发育中的Drosophila melanogaster胚胎会经历一系列细胞形态变化，这些变化非常适合进行活体共聚焦成像观察。果蝇中的细胞形态变化与高等生物中的类似，并驱动组织形态发生。因此，在许多情况下，对其研究可直接帮助理解人类疾病（表1）^1-5。在亚细胞水平上，这些细胞形态变化是基因表达、信号转导、细胞极性、细胞骨架重塑以及膜运输等多种生物学活动共同作用的结果。因此，Drosophila胚胎不仅为研究细胞形态变化与组织形态发生之间的关系提供了合适的生物学背景，同时也为研究调控细胞形态的亚细胞活动提供了一个完全生理性的环境。

本文所述方案旨在对一种称为细胞化（cellularization）的特定细胞形态变化进行成像。细胞化是一个质膜剧烈生长的过程，最终将合胞体胚胎转化为细胞化囊胚层。具体而言，在第14次有丝分裂周期的间期，质膜同时在约6000个皮层锚定的细胞核周围内陷，形成一层初级上皮细胞。与先前的观点相反，细胞化并非由肌球蛋白-2（Myosin-2）的收缩力驱动⁶，而是主要依赖于细胞内储存膜的胞吐作用来提供动力⁷。因此，细胞化是研究在需要质膜内陷或扩张的细胞形态变化过程中膜运输机制的理想体系，这类过程包括胞质分裂或肌肉细胞中横小管（T-tubule）的形态发生。

需要注意的是，本方案可轻松应用于果蝇胚胎中其他细胞形态变化的成像，仅需进行轻微调整，例如改变胚胎收集的发育阶段，或使用“胚胎胶”将胚胎以特定方向固定（表1）^8-19。在所有情况下，实验流程基本相同（图1）。通过标准的克隆和Drosophila转基因技术，构建稳定表达目标蛋白与绿色荧光蛋白（GFP）或其变体融合的果蝇品系，这些果蝇可作为胚胎的可再生来源。 alternatively，可通过简单的显微注射技术将荧光蛋白/探针直接导入果蝇胚胎^9-10。随后，根据需要成像的发育事件和细胞形态变化，利用体视显微镜通过形态学特征对胚胎进行收集和分期，最终将其定位并固定，用于共聚焦显微镜下的延时成像。

方案

1. 组装胚胎收集杯

1. 用剃刀将一个100 mL三口烧杯的底部切下，尽量使边缘平滑。虽然并非绝对必要，但若将顶部的三个角也一并剪去，烧杯会更易于操作。
2. 剪取一块6 cm × 6 cm的金属丝网。在通风橱内，将金属丝网平铺在一张加厚铝箔上，并置于预热的加热板上。将已切去底部的烧杯边缘用力压在加热的金属丝网上。等待数秒钟后，取下烧杯，此时金属丝网应已附着在杯底。若铝箔也粘附在上，将其轻轻剥离即可。
3. 将烧杯静置过夜冷却。用剪刀去除多余的金属丝网，并用细粒砂纸打磨掉任何锋利的边缘。

2. 制备苹果汁琼脂平板

1. 在6L锥形瓶中，加入100 g BD Bacto琼脂和3L蒸馏水。在慢速排气模式下，将琼脂高压灭菌30分钟。
2. 在带有搅拌子的2L锥形瓶中，加入100 g蔗糖、1L苹果汁和6 g对羟基苯甲酸。在加热板上边搅拌边加热至沸腾。沸腾时间不得超过2分钟。待苹果汁混合物冷却后，连同搅拌子一起加入琼脂中，充分混匀。
3. 将混合溶液置于60°C水浴中冷却，然后倒入60×15 mm的培养皿中。也可使用蠕动泵分装琼脂。让平板在室温下冷却至少4小时。将平板叠放在Rubbermaid容器中，中间夹一层湿润的纸巾，并于4°C保存。

注意事项：

• 在秋季或冬季，可能需要向琼脂中额外添加 1....

讨论

本文所述方案将允许对发育中果蝇胚胎的多种细胞形态变化进行活体共聚焦成像。用于成像的GFP品系可由各个实验室自行构建（表2），但许多此类品系也可从公共机构获得，例如印第安纳大学的Bloomington Drosophila Stock Center（http://flystocks.bio.indiana.edu）和耶鲁大学的FlyTrap Stock Center（http://flytrap.med.yale.edu）。获得这些活体成像数据后，可结合定量分析，全面界定驱动细胞形态变化和组织形态发生的蛋白质功能、亚细胞活动以及生物物理参数。

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材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
载玻片	Fisher Scientific	12-550-343
盖玻片 25x25	Fisher Scientific	1 2-524C
冲洗瓶（H2O）	Fisher Scientific	02-897-11
50 ml Falcon 离心管	Fisher Scientific	14-432-22
1 mL 微量移液器用吸头球	Fisher Scientific	03-448-21
带盖闪烁瓶	VWR international	66021-533
Tri-Corn 型烧杯，100 mL	Electron Microscopy Sciences	60970
BD Falcon 培养皿 60x15 mm	Fisher Scientific	08757 100B
BD Falcon 细胞筛	Fisher Scientific	08-771-2
黄色移液器吸头	Rainin	L200
不锈钢网，304 型，12x24	Small Parts, Inc.	CX-0150-F-01
玻璃巴斯德移液管，5¾ 英寸	Fisher Scientific	13-678-20B
P4 滤纸	Fisher Scientific	09-803-6F
橡胶圈	Office Max	A620645
Scotch 双面胶带，½ 英寸	Office Max	A8137DM-2
Robert Simmons Expression 圆头画笔 E85 #2	Jerry’s Artarama	56460
Dumont #5 高精度不锈钢镊子	Electron Microscopy Sciences	72701-DZ
剃须刀片	VWR international	55411-050
卤代烃油 27	Sigma-Aldrich	H 8773
庚烷	Fisher Scientific	H360-1
BD Bacto 琼脂	VWR international	90000-760
蔗糖	Sigma-Aldrich	S7903
对羟基苯甲酸	Sigma-Aldrich	H5501
Red Star 活性干酵母	LeSaffre	15700
纸巾，C 折型	Kleenex
重型铝箔	Reynolds Wrap
漂白剂	Austin’s A-1 Commercial
100% 苹果汁	Ocean Spray 或 Tree Top