黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）的早期发育过程以一系列适合成像研究的细胞形态变化为特征。本文将介绍对黑腹果蝇胚胎进行活体共聚焦成像所需的基本工具和方法，并重点描述一种称为细胞化（cellularization）的细胞形态变化过程。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
发育中的Drosophila melanogaster胚胎会经历一系列细胞形态变化，这些变化非常适合进行活体共聚焦成像观察。果蝇中的细胞形态变化与高等生物中的类似，并驱动组织形态发生。因此，在许多情况下，对其研究可直接帮助理解人类疾病（表1）1-5。在亚细胞水平上，这些细胞形态变化是基因表达、信号转导、细胞极性、细胞骨架重塑以及膜运输等多种生物学活动共同作用的结果。因此，Drosophila胚胎不仅为研究细胞形态变化与组织形态发生之间的关系提供了合适的生物学背景，同时也为研究调控细胞形态的亚细胞活动提供了一个完全生理性的环境。
本文所述方案旨在对一种称为细胞化（cellularization）的特定细胞形态变化进行成像。细胞化是一个质膜剧烈生长的过程，最终将合胞体胚胎转化为细胞化囊胚层。具体而言，在第14次有丝分裂周期的间期，质膜同时在约6000个皮层锚定的细胞核周围内陷，形成一层初级上皮细胞。与先前的观点相反，细胞化并非由肌球蛋白-2（Myosin-2）的收缩力驱动6，而是主要依赖于细胞内储存膜的胞吐作用来提供动力7。因此，细胞化是研究在需要质膜内陷或扩张的细胞形态变化过程中膜运输机制的理想体系，这类过程包括胞质分裂或肌肉细胞中横小管（T-tubule）的形态发生。
需要注意的是，本方案可轻松应用于果蝇胚胎中其他细胞形态变化的成像，仅需进行轻微调整，例如改变胚胎收集的发育阶段，或使用“胚胎胶”将胚胎以特定方向固定（表1）8-19。在所有情况下，实验流程基本相同（图1）。通过标准的克隆和Drosophila转基因技术，构建稳定表达目标蛋白与绿色荧光蛋白（GFP）或其变体融合的果蝇品系，这些果蝇可作为胚胎的可再生来源。 alternatively，可通过简单的显微注射技术将荧光蛋白/探针直接导入果蝇胚胎9-10。随后，根据需要成像的发育事件和细胞形态变化，利用体视显微镜通过形态学特征对胚胎进行收集和分期，最终将其定位并固定，用于共聚焦显微镜下的延时成像。
方案
1. 组装胚胎收集杯
- 用剃刀将一个100 mL三口烧杯的底部切下，尽量使边缘平滑。虽然并非绝对必要，但若将顶部的三个角也一并剪去，烧杯会更易于操作。
- 剪取一块6 cm × 6 cm的金属丝网。在通风橱内，将金属丝网平铺在一张加厚铝箔上，并置于预热的加热板上。将已切去底部的烧杯边缘用力压在加热的金属丝网上。等待数秒钟后，取下烧杯，此时金属丝网应已附着在杯底。若铝箔也粘附在上，将其轻轻剥离即可。
- 将烧杯静置过夜冷却。用剪刀去除多余的金属丝网，并用细粒砂纸打磨掉任何锋利的边缘。
2. 制备苹果汁琼脂平板
- 在6L锥形瓶中，加入100 g BD Bacto琼脂和3L蒸馏水。在慢速排气模式下，将琼脂高压灭菌30分钟。
- 在带有搅拌子的2L锥形瓶中，加入100 g蔗糖、1L苹果汁和6 g对羟基苯甲酸。在加热板上边搅拌边加热至沸腾。沸腾时间不得超过2分钟。待苹果汁混合物冷却后，连同搅拌子一起加入琼脂中，充分混匀。
- 将混合溶液置于60°C水浴中冷却，然后倒入60×15 mm的培养皿中。也可使用蠕动泵分装琼脂。让平板在室温下冷却至少4小时。将平板叠放在Rubbermaid容器中，中间夹一层湿润的纸巾，并于4°C保存。
注意事项：
- 在秋季或冬季，可能需要向琼脂中额外添加 100 mL 水。
- 培养皿的品牌非常重要！只有 BD Falcon 培养皿可适配 Tri-corn 烧杯。具体的订购信息见下文材料表。
3. 将GFP果蝇加入胚胎收集杯
- 根据您的收集需求，在成像前约两周建立果蝇培养瓶以扩增GFP品系。通常一个培养瓶的果蝇数量已足够填满一个胚胎收集杯，其中至少包含50只雌蝇和30只雄蝇。为获得最佳产卵效果，果蝇应为新羽化的（即孵化后少于5天）。
- 制备酵母糊：取少量容器，加入等量的Red Star活性干酵母与蒸馏水，搅拌至酵母完全溶解。酵母糊的稠度应类似于湿润的花生酱。可根据需要添加更多酵母或水以调节稠度。酵母糊可在数日内使用，需加盖后于4°C保存。
- 酵母糊准备好后，将苹果汁培养板从4°C冰箱中取出。用酵母糊在苹果汁培养板表面划线涂布，并使其升温至22–25°C，以促进果蝇产卵。
- 将一张圆形滤纸对折一次，再对折一次。修剪至直径8–9 cm，并将四分之一圆形部分折叠成手风琴状褶皱。展开成完整圆形后将其翻面，放入收集杯中，直至滤纸接触到底部金属网。确保滤纸在杯内固定稳妥，以免脱落压伤果蝇。滤纸为可选材料，但可为果蝇交配提供适宜环境，并维持杯内湿度。
- 用品系名称和日期标记收集杯。将果蝇从培养瓶轻柔地振入收集杯（将培养瓶倒置于杯口上方），并立即用已准备好的苹果汁培养板盖住杯口，再用橡皮筋固定。将收集杯网面朝上放置于有直射光的区域。确保无阴影落在杯上，因为果蝇在黑暗环境中产卵效率较低。
- 根据需要更换苹果汁培养板。在室温下进行两小时的胚胎收集，适用于细胞化过程的成像观察。
4. 准备封片腔室
- 为胚胎制备封片腔，取一段2-3 cm长的双面胶带，将其放置在载玻片上，使胶带的长轴与载玻片的长轴对齐。再取另一段2-3 cm长的双面胶带，叠加在前一段胶带上，确保两段胶带边缘对齐。
- 使用剃刀刀片，在胶带中心位置垂直于载玻片长轴方向进行两次相距约3 mm的切割。移除两道切口之间的胶带，形成一个通道。用移液器向该通道中加入一滴卤碳油27（Halocarbon 27 Oil）。此通道即为放置胚胎的位置。
注意事项：
- 只有½英寸的Scotch双面胶带厚度适合容纳胚胎。
- 卤碳27油具有透氧性，可实现氧气交换，同时防止胚胎脱水。由于其折射率特性，卤碳27油也适用于胚胎的分期和成像。
5. 去除胚胎的卵膜
- 收集并去除胚胎的卵膜：将足量的50%次氯酸钠溶液倒入苹果汁琼脂平板，使其完全浸没整个表面。使用解剖显微镜（例如配备透射光的Zeiss Discovery V8），观察胚胎从其卵膜中释放的过程。一旦卵膜开始松动并有少量胚胎（30–60秒内）脱离，立即将次氯酸钠溶液和胚胎倒入细胞滤筛中。
- 立即使用滴瓶中的蒸馏水在滤筛中快速冲洗胚胎。将滤筛轻压在纸巾上吸去多余水分。若轻压后纸巾上出现粉红色残留，需继续用水冲洗胚胎直至无色。
- 用湿润的画笔将10–50个胚胎转移至干净的苹果汁平板（无酵母糊）。用撕开边缘的纸巾吸去多余水分，随后立即用少量Halocarbon 27油覆盖胚胎。
注意事项：
- 请勿使用Clorox漂白剂。应使用Austin's A-1 Commercial Bleach等品牌，其成分为<6%次氯酸钠。
- 过度漂白或冲洗不充分将导致胚胎软化，并出现细胞化不规则现象。
6. 固定并安装胚胎
- 使用透射光解剖显微镜，依据 Bownes20 提供的形态学标准对培养皿中的胚胎进行分期。用镊子将 5 个处于有丝分裂周期 11 或 12（对应 Bownes 4 期）的胚胎转移至封片腔的通道中。将胚胎排成一行，使其背侧和腹侧可见，而侧面朝下。仅使用油即可轻松完成此方向的排列。切勿将胚胎摆放过密，否则在盖玻片置于下方后，胚胎会因缺氧而影响邻近胚胎。（胚胎之间应至少保留约半个胚胎长度的间距）。
- 将一块 25×25 mm 盖玻片的一边放置在通道一侧的双面胶带上，然后放下盖玻片以覆盖整个通道。若盖玻片下方滞留气泡，可在其边缘滴加少量卤碳油 27（Halocarbon 27 Oil），毛细作用会将油吸入通道并排出空气。
注意事项：
- 另一个用于胚胎分期的优秀资源如下：Campos-Ortega, J. A. 和 Hartenstein, V. (1985). Drosophila melanogaster的胚胎发育. Springer-Verlag, Berlin. 尽管此书目前已不再出版，但在Amazon.com上经常可以找到二手书。
- 务必少量使用Halocarbon 27油。这将使样品的封片更加容易，同时也能防止在后续成像步骤中油意外渗漏到显微镜物镜上。
7. 成像胚胎
- 您在此处的操作将取决于所观察的细胞形态变化以及您要解决的科学问题。对于任何形态变化，将样品腔室置于正置或倒置显微镜上，先使用透射光找到胚胎，然后切换至共聚焦成像模式，聚焦于感兴趣的区域。请遵循共聚焦显微镜的最佳实践操作规范，例如 Nikon's MicroscopyU 网站所讨论的相关技术要点http://www.microscopyu.com/articles/confocal）。在暴露活体胚胎时，应特别严格地使用尽可能低的激光功率，以防止光漂白和光毒性。
- 对于细胞化过程，我们在蔡司710激光扫描共聚焦显微镜上进行成像，使用C-Apochromat物镜。 40x/1.2W Corr物镜。该显微镜置于温度可控的房间内，温度范围为18-20°C虽然温度控制并非绝对必要，但对显微镜更为有利，并可使成像结果更加一致。我们通常在接近胚胎中段的单一平面上进行成像，以观察细胞膜内陷的横截面（图2）。若仅需追踪内陷动态，时间推移成像的时间间隔设置为30至60秒即可，胚胎在此条件下应能耐受较长时间的成像过程 >90分钟内无明显缺氧迹象。
- 获取图像后，可使用多种图像分析软件包进行分析，包括美国国立卫生研究院提供的免费软件 ImageJ（http://rsbweb.nih.gov/ij）。随后，数据可以电影（Movie 1）、序列图像（图2）或线扫图（kymograph）的形式呈现。21.
注意：
- 水浸式C-Apochromat 40x/1.2W Corr物镜因其高数值孔径而非常适合对胚胎中段附近进行成像，该孔径可减少在水性样品中对深层组织成像时的像差，从而提供高分辨率和强荧光信号。此外，该物镜具有很长的工作距离（220 μm）。然而，其他水浸或甘油浸物镜也能表现良好，特别是当感兴趣的目标细胞形态变化可在胚胎表面附近成像时。
8. 替代方法：使用“胚胎胶”封片胚胎
- 若要观察除细胞化以外的细胞形态变化，可能需要以特定方向固定胚胎，而该方向仅靠油难以维持。此时应采用与前述方法不同的固定方式。首先，通过将20 cm双面胶带与250 μL正庚烷加入闪烁瓶中混合，制备“胚胎胶”。将闪烁瓶置于振荡器或旋转平台上，过夜混合。
- 将黄色移液器吸头浸入胚胎胶中，然后沿载玻片表面划过，留下一条胶迹。在正庚烷挥发的同时，将已分期的胚胎按所需方向排列在琼脂块上。（请注意，待成像的胚胎表面应朝向琼脂。例如，若要观察腹沟形成过程中的细胞形态变化，应使胚胎的腹侧朝向琼脂。）
- 将带有胶迹的载玻片翻转，轻轻将胶迹压在琼脂块上的胚胎上。随后再次翻转载玻片，胚胎即以合适的方向粘附于载玻片上。在胚胎两侧各添加两层双面胶带，滴加Halocarbon 27油，盖上盖玻片。随后按照上述方法进行成像。
9. 代表性结果：
如果胚胎健康且成像条件理想，则细胞化过程应持续50至60分钟，质膜内陷深度应接近40微米。然而，若胚胎过度漂白、缺氧或受到光毒性损伤，则内陷过程会减缓甚至停止，尤其在成像区域更为明显。胚胎健康状况的此类恶化常导致发育异常，并无法孵化为幼虫。因此，为严格检测成像后胚胎的健康状况，应将载玻片置于湿润培养盒中，并于次日观察其孵化情况。
图1. 从胚胎收集到成像的工作流程。 本实验方案的工作流程可分为四个主要阶段。第一阶段为各项单独耗材和组分的准备工作，随后将胚胎收集杯、苹果汁琼脂平板和GFP果蝇组装在一起，构建胚胎产卵环境。第二阶段，收集产在苹果汁琼脂平板上的卵和胚胎。第三阶段，将胚胎从平板上取出，进行分期鉴定并转移至封片腔室。第四阶段，将已固定的胚胎置于共聚焦显微镜下进行成像。
图2. 细胞化过程延时成像的代表性数据。 胚胎以背侧（D）和腹侧（V）清晰可见的方式固定，并在其中部附近进行成像，以在横截面中追踪质膜内陷的情况。此处所示胚胎表达GFP-Myosin-2探针6，该探针富集于质膜内陷的尖端。因此，通过随时间追踪该前沿的内陷进程，可获得质膜内陷的速率。0:00时间点对应细胞化的起始。在56:00时间点 shortly 之后，胚胎腹侧开始原肠作用。标尺为40微米。
视频 1. 细胞化过程延时成像的代表性视频。 本视频对应图 2。为记录细胞化的完整过程，成像始于前一个有丝分裂周期 13，捕捉伪裂沟回缩现象，并持续至胚胎腹侧出现原肠胚运动。图像以每分钟一次的间隔采集。采集后增强了信号强度，以便更清晰地观察原肠胚运动。
点击此处观看视频
| 发育事件及时间* | 相关的细胞形态变化 | 与疾病或人类健康的关联 | 包含活体成像的近期参考文献 |
| 伪裂沟形成 (4；90 分钟 pf) | 胞质分裂 | 多倍体与癌症进展1 | Mavrakis et al., 20098 Cao et al., 20109 |
| 细胞化 (5；130 分钟 pf) | 胞质分裂 | 多倍体与癌症进展1 | Cao et al., 200810 Sokac & Wieschaus, 200811 |
| 腹侧沟形成；中胚层内陷 (6；180 分钟 pf) | 顶端收缩；上皮-间充质转化 | 癌症转移2 | Fox & Peifer, 200712 Martin et al., 200913 |
| 胚带延伸 (7；195 分钟 pf) | 汇聚延伸 | 神经管缺陷3 | Bertet et al., 200414 Blankenship et al., 200615 |
| 气管发生 (11；320 分钟 pf) | 上皮管形成与分支 | 血管生成4 | Caussinus et al., 200816 Gervais & Casanova, 201017 |
| 背侧闭合 (14；620 分钟 pf) | 顶端收缩 | 伤口愈合5 | Gorfinkiel et al., 200918 Solon et al., 200919 |
表1. 在活体果蝇胚胎中观察到的细胞形态变化示例
*每个事件开始时的Bownes分期编号及受精后时间（pf）依据Campos-Ortega, 1985列出。
| 果蝇品系 | 标记 | 原始参考文献 |
| Spider-GFP (95-1) | 质膜 | Morin et al., 200122 |
| Resille-GFP (117-2) | 质膜 | Morin et al., 200122 |
| GAP43-Venus | 质膜 | Mavrakis et al., 20098 |
| Spaghetti Squash-GFP (Sqh-GFP) | 肌球蛋白-2 | Royou et al., 20026 |
| E-cadherin-GFP (Ecad-GFP) | 细胞间连接 | Oda et al., 200123 |
| GFP-Moesin | F-肌动蛋白 | Kiehart et al., 200024 |
| Utrophin-Venus (Utro-Venus) | F-肌动蛋白 | Sokac et al., 未发表结果 |
表2. 用于成像果蝇胚胎细胞形态变化的有用品系
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
本文所述方案将允许对发育中果蝇胚胎的多种细胞形态变化进行活体共聚焦成像。用于成像的GFP品系可由各个实验室自行构建（表2），但许多此类品系也可从公共机构获得，例如印第安纳大学的Bloomington Drosophila Stock Center（http://flystocks.bio.indiana.edu）和耶鲁大学的FlyTrap Stock Center（http://flytrap.med.yale.edu）。获得这些活体成像数据后，可结合定量分析，全面界定驱动细胞形态变化和组织形态发生的蛋白质功能、亚细胞活动以及生物物理参数。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
未声明任何利益冲突。
致谢
我们衷心感谢 Eric Wieschaus，本实验方案的建立基于他所提供的基础。我们的工作得到了贝勒医学院生物化学与分子生物学系 Verna & Marrs McLean 创立启动奖的支持。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 载玻片 | Fisher Scientific | 12-550-343 | |
| 盖玻片 25x25 | Fisher Scientific | 1 2-524C | |
| 冲洗瓶（H2O） | Fisher Scientific | 02-897-11 | |
| 50 ml Falcon 离心管 | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| 1 mL 微量移液器用吸头球 | Fisher Scientific | 03-448-21 | |
| 带盖闪烁瓶 | VWR international | 66021-533 | |
| Tri-Corn 型烧杯，100 mL | Electron Microscopy Sciences | 60970 | |
| BD Falcon 培养皿 60x15 mm | Fisher Scientific | 08757 100B | |
| BD Falcon 细胞筛 | Fisher Scientific | 08-771-2 | |
| 黄色移液器吸头 | Rainin | L200 | |
| 不锈钢网，304 型，12x24 | Small Parts, Inc. | CX-0150-F-01 | |
| 玻璃巴斯德移液管，5¾ 英寸 | Fisher Scientific | 13-678-20B | |
| P4 滤纸 | Fisher Scientific | 09-803-6F | |
| 橡胶圈 | Office Max | A620645 | |
| Scotch 双面胶带，½ 英寸 | Office Max | A8137DM-2 | |
| Robert Simmons Expression 圆头画笔 E85 #2 | Jerry’s Artarama | 56460 | |
| Dumont #5 高精度不锈钢镊子 | Electron Microscopy Sciences | 72701-DZ | |
| 剃须刀片 | VWR international | 55411-050 | |
| 卤代烃油 27 | Sigma-Aldrich | H 8773 | |
| 庚烷 | Fisher Scientific | H360-1 | |
| BD Bacto 琼脂 | VWR international | 90000-760 | |
| 蔗糖 | Sigma-Aldrich | S7903 | |
| 对羟基苯甲酸 | Sigma-Aldrich | H5501 | |
| Red Star 活性干酵母 | LeSaffre | 15700 | |
| 纸巾，C 折型 | Kleenex | ||
| 重型铝箔 | Reynolds Wrap | ||
| 漂白剂 | Austin’s A-1 Commercial | ||
| 100% 苹果汁 | Ocean Spray 或 Tree Top |
参考文献
- Sagona, A. P., Stenmark, H. Cytokinesis and cancer. FEBS Lett. 584, 2652-2661 (2010).
- Baum, B., Settleman, J., Quinlan, M. P. Transitions between epithelial and mesenchymal states in development and disease. Semin Cell Dev Biol. 19, 294-308 (2008).
- Kibar, Z., Capra, V., Gros, P. Toward understanding the genetic basis of neural tube defects. Clin Genet. 71, 295-310 (2007).
- Jazwinska, A., Ribeiro, C., Affolter, M. Epithelial tube morphogenesis during Drosophila tracheal development requires Piopio, a luminal ZP protein. Nat Cell Biol. 5, 895-901 (2003).
- Martin, P., Parkhurst, S. M. Parallels between tissue repair and embryo morphogenesis. Development. 131, 3021-3034 (2004).
- Royou, A., Field, C., Sisson, J. C., Sullivan, W., Karess, R. Reassessing the role and dynamics of nonmuscle myosin II during furrow formation in early Drosophila embryos. Mol Biol Cell. 15, 838-850 (2004).
- Lecuit, T., Wieschaus, E. Polarized insertion of new membrane from a cytoplasmic reservoir during cleavage of the Drosophila embryo. J Cell Biol. 150, 849-860 (2000).
- Mavrakis, M., Rikhy, R., Lippincott-Schwartz, J. Plasma membrane polarity and compartmentalization are established before cellularization in the fly embryo. Dev Cell. 16, 93-104 (2009).
- Cao, J., Crest, J., Fasulo, B., Sullivan, W. Cortical Actin Dynamics Facilitate Early-Stage Centrosome Separation. Curr Biol. , (2010).
- Cao, J., Albertson, R., Riggs, B., Field, C. M., Sullivan, W. N. uf a Rab11 effector, maintains cytokinetic furrow integrity by promoting local actin polymerization. J Cell Biol. 182, 301-313 (2008).
- Sokac, A. M., Wieschaus, E. Local actin-dependent endocytosis is zygotically controlled to initiate Drosophila cellularization. Dev Cell. 14, 775-786 (2008).
- Fox, D. T., Peifer, M. Abelson kinase (Abl) and RhoGEF2 regulate actin organization during cell constriction in Drosophila. Development. 134, 567-578 (2007).
- Martin, A. C., Kaschube, M., Wieschaus, E. F. Pulsed contractions of an actin-myosin network drive apical constriction. Nature. 457, 495-499 (2009).
- Bertet, C., Sulak, L., Lecuit, T. Myosin-dependent junction remodelling controls planar cell intercalation and axis elongation. Nature. 429, 667-671 (2004).
- Blankenship, J. T., Backovic, S. T., Sanny, J. S., Weitz, O., Zallen, J. A. Multicellular rosette formation links planar cell polarity to tissue morphogenesis. Dev Cell. 11, 459-470 (2006).
- Caussinus, E., Colombelli, J., Affolter, M. Tip-cell migration controls stalk-cell intercalation during Drosophila tracheal tube elongation. Curr Biol. 18, 1727-1734 (2008).
- Gervais, L., Casanova, J. In vivo coupling of cell elongation and lumen formation in a single cell. Curr Biol. 20, 359-366 (2010).
- Gorfinkiel, N., Blanchard, G. B., Adams, R. J., Arias, M. artinez, A, Mechanical control of global cell behaviour during dorsal closure in Drosophila. Development. 136, 1889-1898 (2009).
- Solon, J., Kaya-Copur, A., Colombelli, J., Brunner, D. Pulsed forces timed by a ratchet-like mechanism drive directed tissue movement during dorsal closure. Cell. 137, 1331-1342 (2009).
- Bownes, M. A photographic study of development in the living embryo of Drosophila melanogaster. J Embryol Exp Morphol. 33, 789-801 (1975).
- Sokac, A. M., Wieschaus, E. Zygotically controlled F-actin establishes cortical compartments to stabilize furrows during Drosophila cellularization. J Cell Sci. 121, 1815-1824 (2008).
- Morin, X., Daneman, R., Zavortink, M., Chia, W. A protein trap strategy to detect GFP-tagged proteins expressed from their endogenous loci in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 15050-15055 (2001).
- Oda, H., Tsukita, S. Real-time imaging of cell-cell adherens junctions reveals that Drosophila mesoderm invagination begins with two phases of apical constriction of cells. J Cell Sci. 114, 493-501 (2001).
- Kiehart, D. P., Galbraith, C. G., Edwards, K. A., Rickoll, W. L., Montague, R. A. Multiple forces contribute to cell sheet morphogenesis for dorsal closure in Drosophila. J Cell Biol. 149, 471-490 (2000).
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
标签
