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在 E. coli 中进行蛋白质定向进化的诱变与功能筛选方案

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DOI：

10.3791/2505

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2011年3月16日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Microbiology & Environmental Toxicology, University of California Santa Cruz - UCSC

本文内容

摘要

本文演示了一种针对特定目标序列构建随机突变文库的简单方案。我们展示了该方法如何在大肠杆菌（Escherichia coli）体内进行，并可与功能性筛选相结合，以进化出新的酶活性。

摘要

高效产生遗传多样性是一种极为宝贵的分子工具，可用于标记DNA合成、创建独特的分子标签，或在实验室中实现蛋白质的定向进化。本文介绍一种可针对特定目标序列构建大规模（>1011）突变体文库的实验方案。该方法基于携带目标序列的ColE1质粒在DNA聚合酶I低保真突变体（LF-Pol I）作用下的复制过程。将目标质粒转化至一种突变菌株的E. coli中，并在固体培养基上培养，可获得每千碱基（kb）0.2至1个突变的频率，具体数值取决于目标基因在质粒上的位置。通过重复此诱变过程，可进一步提高突变频率。与其他诱变方法相比，本方案的优势在于操作简便，无需进行克隆或PCR扩增。因此，该方法特别适用于对质粒或其他Pol I模板进行突变标记，或用于探索原始目标序列中不存在的新功能的广阔序列空间。若需实现PCR或基于随机寡核苷酸方法所具备的精确区域控制，可通过后续克隆文库中的特定片段来达成。本文同时提供了构建随机突变体文库以及在E. coli中建立基于药物筛选的方法，以鉴定具有新生物化学活性的突变体。

方案

I. 随机突变文库的构建

Pol I 介导 ColE1 质粒复制的起始（综述见 (1-3）。我们的诱变方法基于将目标序列插入至一个ColE1质粒中，位于复制起点附近，并在表达低保真DNA聚合酶I（LF-Pol I）的细胞中进行扩增。LF-Pol I是一种突变型DNA聚合酶I，包含三个降低复制保真性的突变，分别为I709N（位于A模体）、A759R（位于B模体）和D424A（失活校对功能）。 4,5. LF-Pol I 在一种 E. coli 菌株 JS200 携带 DNA 聚合酶 I 的温度敏感等位基因（polA12）(6)，使得在高温下 LF-Pol I 成为主要的活性形式 37 °C在限制性条件下，目标序列在polA12细胞中的复制可产生随机突变文库。在饱和培养物中，诱变效率更高。 4原因尚不明确，诱变并非持续进行，即当培养物达到饱和后，即使将细胞转移至新鲜培养基中继续扩增，突变频率也不会随传代次数呈线性增加。因此，若要进一步提高文库的突变负荷，需要进行多轮重复的诱变与质粒回收。本文提供了LF-Pol I诱变的实验方案。需注意的是，相较于我们最初的描述，此处呈现的方案已大幅简化 4 以便促进实现所需突变负荷的流程迭代（图 1）。

材料

  • 细胞：JS200 recA718 polA12 (ts) uvrA155 trpE65 lon-11 sulA
    • JS200 WT-Pol I：表达野生型（WT）Pol I 的 JS200 细胞
    • JS200 LF-Pol I：表达低保真度（LF）Pol I 的 JS200 细胞
    • 报告菌株：JS200 WT-Pol I，或（用于互补实验）缺失特定活性的菌株
  • 靶质粒
    • 含有 ColE1 复制起始位点并克隆有目标基因的质粒

1. 定点突变前：制备电转感受态 JS200 LF-Pol I 细胞

  1. 从含有适当抗生素选择（用于携带 LF-Pol I 的质粒，0.03 mg/mL 氯霉素）并在 30°C（允许条件）下过夜培养的 LB 平板上，挑取单个 JS200 LF-Pol I 菌落，将该菌落放入含有 8 mL LB 培养基（含氯霉素）的试管中。在 30°C、250 rpm 振荡条件下过夜培养。
  2. 次日早晨，将 8 mL JS200 LF-Pol I 培养物倒入含有 400 mL LB 培养基（含氯霉素）的锥形瓶中进行扩增培养。在 30°C、250 rpm 振荡条件下培养，直至培养物的 A600 达到 0.4–0.7（通常需 3–4 小时）。
  3. 当 A600 达到 0.4–0.7 时，将培养物置于湿冰上冷却 15 分钟。
  4. 将预冷的培养物转移至适合离心的容器中，在 4°C 下离心收集细胞。倒去上清液，向容器中加入 10 mL 无菌且预冷（置于湿冰上）的 10% 甘油，使用血清移液管重悬细胞。
  5. 将重悬的细胞转移至 50 mL 离心管中，加 10% 甘油至液面达 45 mL 刻度线，然后在 4°C、4000 rpm 条件下离心 15 分钟。
  6. 倒去上清液，再次向离心管中加入 10 mL 10% 甘油，使用血清移液管或普通移液管重悬细胞。再次加 10% 甘油至 45 mL 刻度线，于 4°C、4000 rpm 离心 15 分钟。重复此步骤两次，以彻底去除残留盐分。
  7. 最后一次离心后，用等体积的 10% 甘油重悬细胞沉淀（例如，2 mL 细胞沉淀用 2 mL 10% 甘油重悬）。
  8. 将重悬的细胞分装至多个储存管中，每管分装体积为 100 μL 至 500 μL。在干冰上快速冷冻后，于 -80°C 保存。
  9. 在用于电转化制备感受态细胞前，将细胞置于冰上缓慢解冻。

2. 诱变：转化目标质粒

  1. 将40 μL电感受态JS200 LF-Pol I细胞和30–250 ng的目标质粒DNA移液至2 mm间隙的电穿孔比色皿中。
    注释 #1：可将含有GFP的ColE1质粒作为对照，与目标基因同时进行诱变。在完成读出步骤后，可将GFP涂布于LB琼脂平板上并观察其诱变情况。呈现暗色或荧光减弱的菌落含有失活突变。
  2. 在电穿孔仪中以1800 V对混合物进行电击。检查时间常数（TC），以确保每个样品的电穿孔条件一致；理想情况下TC = 5–6秒。
  3. 将细胞/DNA混合物在1 mL LB液体培养基中，于37°C（限制性条件）下以250 rpm振荡培养40分钟，进行复苏。
  4. 将50 μL复苏培养物涂布于预热至37°C、含有氯霉素及适当浓度筛选目标质粒抗生素的100 mm LB琼脂培养皿上。
    注释 #2：应使涂布的细胞浓度接近“菌苔”水平。“接近菌苔”浓度定义为菌落数量明显但不可计数（>1000个菌落/100 mm培养皿）。涂布时是否需要稀释取决于细胞的电感受态水平。若细胞电感受态较低，直接涂布复苏培养物无法达到“接近菌苔”浓度，则将复苏培养物在4000 rpm下离心2分钟，弃去上清液，用50 μL LB液体培养基重悬细胞，然后涂布培养物。
  5. 将培养皿在37°C下过夜培养。

3. 诱变：质粒回收

  1. 第二天，用移液器将 2 mL LB 肉汤加入培养皿中清洗细胞。使用灭菌的三角形玻璃棒在平板上“刷洗”菌落，将 LB 琼脂培养皿中的细菌菌落转移至 LB 肉汤中。先加入 1 mL LB 肉汤，收集洗液，再用第二份 1 mL LB 肉汤重复该操作。
  2. 从平板洗液中提取质粒 DNA。（此质粒 DNA 构成文库）。
    注意 #3：从 LB 平板收集的洗液可能过于浓稠，无法全部用于质粒小提。若如此，可使用质粒小提试剂盒允许的最大量进行小提（通常需将洗液稀释至 OD=1，并对约 3 mL 稀释后的菌液进行提取），或升级为质粒大提。

4. 迭代

  1. 限制 1μg 用一种限制性内切酶消化分离得到的质粒DNA，该酶可线性化LF-Pol I质粒，但不会切割目标质粒（补充图1）。
  2. 使用DNA纯化试剂盒纯化限制性消化产物。
    注释 #4：此步骤可去除限制性内切酶及其缓冲液的所有残留。此步骤对于保持后续电转化感受态细胞的低盐浓度至关重要。
  3. 将30–250 ng经限制性处理的目标质粒文库重新转化至新鲜的JS200 LF-Pol I细胞中，以使文库进入下一轮诱变循环。
    注释 #5：使用限制性内切酶线性化 Pol I 质粒可确保仅有目标质粒被转化。
  4. 重复第2和第3步。

5. 检测信号

  1. 使用一种限制性内切酶对分离的质粒 DNA 进行酶切，使目标质粒和 Pol I 质粒均线性化。将酶切产物在 1% 琼脂糖凝胶上电泳，以检测质粒的数量和质量。通常，用于分析的分离质粒 DNA 约需 400 ng。
  2. 使用一种限制性内切酶对 1 μg 分离的质粒 DNA 进行酶切，该酶可线性化 LF-Pol I 质粒，但不切割目标质粒。
  3. 使用 DNA 纯化试剂盒对酶切产物进行纯化。
  4. 将经酶切处理的目标质粒文库转化至报告菌株中，以表征突变。

II. 利用梯度生长平板进行突变体筛选与性状分析。

为了说明如何将文库中存在的巨大遗传多样性与功能性筛选相结合，本文提供了一种基于药物的功能性筛选方案。 体内 在 E. coli该方法基于在固体琼脂上的药物浓度梯度中进行细胞生长。它能够在一系列浓度范围内同时表征多个（最多12个）样本，相比单一药物处理具有更宽的动态范围。另一优势在于，该检测的非线性读数可缓冲存活性在2倍范围内的中等差异。因此，该细胞毒性抗性检测为筛选突变体文库及确定单个突变体的表型特征提供了稳健且快速的手段。图2展示了这些应用的示例：图A显示从人源氧化性去甲基化酶ABH2文库中筛选单个突变体的结果，生长于野生型（WT）阈值以上的菌落被选中，表明其对甲基化试剂甲基甲烷磺酸酯（MMS）引起的细胞毒性具有更强的保护能力。 7图B展示了用于单个克隆表征的梯度示例。在琼脂梯度上显示了野生型β-内酰胺酶以及两种扩展谱突变体R164H和E104K R164S G267R对第三代头孢菌素类抗生素头孢噻肟的耐药水平。 4注意，根据所观察效应的强弱，可能需要使用不止一个平板以实现充分的定量：虽然0.4 mg/mL的浓度梯度可用于与对照克隆进行直接比较，但只有使用更高浓度的头孢噻肟（4 mg/mL）才能确定最强突变体的抗性水平。

材料

  • 仪器
    • 100x100x15mm 方形培养皿（Fisher Sci #0875711A）
    • 100mm 圆形培养皿
    • 25x75x1mm 玻璃显微镜载玻片（Fischer Sci #1255015）
    • 50 mL 带刻度离心管
  • 培养基
    • LB 琼脂：在 56°C 水浴中融化并平衡温度
      注意 #6：培养基的温度可能影响被测药物或化合物的稳定性及其活性。
    • 软琼脂：在 42°C 水浴中融化并平衡温度

1. 梯度的构建

  1. 在方形培养皿底部的一条边上，均匀标记十条泳道。
  2. 将培养皿倾斜放置，使标有记号的底部边缘抬高 7 mm；
    可使用较厚的玻璃片或其他平整物体作为支撑来抬高培养皿。向倾斜的培养皿中倒入 25 mL 温热（约 56°C）的 LB 琼脂，并已与适当浓度的筛选剂充分混合。此为梯度的底层。确保 LB 琼脂均匀覆盖培养皿，使抬高并标记的一端含有约 1 mm 的 LB 琼脂，而较低的一端含有约 8 mm 的 LB 琼脂。随后静置 10–15 分钟，使琼脂凝固。
    注意 #7：对于疏水性筛选剂，可在 LB 琼脂中添加 0.1% 表面活性剂（抗泡沫 B 乳剂），以促进药物的悬浮和均匀分布。在加入筛选剂之前，将表面活性剂加入温热的无菌 LB 琼脂中，并剧烈振荡。表面活性剂应形成细小液滴的微浊悬浮液；若出现大液滴，表明培养基温度过高，可能影响测试药物的均匀分布。
  3. 待第一层 25 mL LB 琼脂凝固后，将培养皿移至水平台面。随后，倒入 25 mL 不含筛选剂的 LB 琼脂，覆盖于第一层 LB 琼脂表面，形成梯度的上层。确保 LB 琼脂完全覆盖底层表面。将皿盖稍倾斜以利于通风，静置 10–15 分钟使琼脂凝固。
    注意 #8：注意测试化合物可能产生的气溶胶危害及挥发风险；若化学品安全要求规定，应在化学或生物安全柜内制备梯度平板。
    注意 #9：梯度平板应在 4 小时内使用，以保持药物或测试化合物浓度梯度的稳定性。

2. 细菌的印迹转移

  1. 软琼脂应平衡至 42°C。将 2 mL 液体软琼脂转移至 100 mm 圆形培养皿的皿盖或底部。用移液器吸取 40 μL 菌液加入软琼脂中，然后通过轻轻摇动培养皿混匀。
    注意 #10：细菌培养物的生长阶段可能影响其对药物或待测化合物的反应。为获得一致的结果，应始终使用对数生长期或处于稳定期的过夜培养物。细胞密度也可能导致相对结果偏差，因此所有培养物均应稀释至相同的 A600 密度值。过夜培养物应稀释至 A600 密度低于 1.0
  2. 用软琼脂混合物涂布载玻片的长边。然后将载玻片的涂布边缘与梯度培养皿上的底部标记（从低浓度到高浓度）对齐，轻轻接触琼脂表面。轻微接触即可将一条软琼脂转移至梯度表面。随后将载玻片放置一旁以待清洗和重复使用。
  3. 对剩余的细菌样品重复此操作。若同时运行多个梯度实验，每个梯度培养皿上均应包含参比样品。
  4. 将梯度培养皿倒置，在 37°C 下过夜培养。不同检测用细菌菌株的培养时间和温度可能有所不同，但通常在 37°C 下过夜培养足以观察到明显生长。

3. 成像与生长分析

  1. 成像：经过过夜培养后，可直接对梯度进行成像，或使用含有0.2 mg/mL吖啶橙的95%乙醇溶液固定并染色，以增强对比度。将平板在染色液中室温孵育5分钟，随后用95%乙醇洗涤，然后置于紫外光灯箱上成像。
    注意 #11：操作时注意不要将菌落冲离平板，应轻轻晃动染色液和洗涤液覆盖平板表面，并从平板角落小心移除液体。
  2. 对于单个突变质粒的表型分析，将菌落在浓度梯度上的生长距离相对于每个梯度上的标准参照进行归一化处理。这些相对值可在不同梯度之间进行比较。
    注意 #12：根据细胞毒效应的性质不同，可观察到清晰锐利的边界或更为弥散的边界（例如，比较图2中的A和B图）。在边界弥散的情况下，建议测量连续生长区域的边界，因为单个菌落往往表现出更高的变异性。
  3. 对于文库筛选，挑选在浓度高于亲本野生型对照条件下仍能生长的单个菌落，进行分离和测序，以鉴定出有助于增强保护作用的突变。

三、代表性结果：

诱变过程示意图；液体培养与直接涂板方法；转化、DNA提取、结果读取。
图1. 液体培养与直接涂板诱变方法的比较。 本文展示的直接涂板诱变方法（底部）比原有的液体诱变方法（顶部）更快，且所需步骤更少。当使用GFP作为报告基因时，荧光强度的变化可反映文库中存在的遗传多样性。通常，一个诱变循环后，约有12-18%的菌落表现出明显降低的荧光水平。

细菌生长抑制实验、药物梯度效应、突变体比较、凝胶电泳结果。
图2. 梯度抗性实验。图A 对甲基磺酸甲酯（MMS）抗性增强的筛选。 对人源氧化去甲基化酶 ABH2 的质粒文库进行筛选，以获得对 MMS 抗性增强的克隆。图中展示了经过两次和四次诱变流程迭代的两个文库，与亲本野生型（WT）及空载体（Δ）对照比较。白色线条标示出用于挑选单个突变菌落进行进一步表型分析的阈值界限。图B 头孢他啶保护作用，提示具有广谱β-内酰胺酶活性。 R164H 和 E104K R164H G267R 是两种先前通过LF-Pol I诱变结合氨曲南筛选鉴定出的β-内酰胺酶突变体4，其在0.4μg/mL 和 4μg/mL 头孢他啶梯度平板上的表现如图所示。需要注意的是，相对于表达空载体（Δ）的细胞，野生型β-内酰胺酶未显示出任何保护作用。因此，这些突变体代表了一种新生物化学活性的演化结果8,9。

RNA/DNA突变频率图；以距起点的距离对突变率作图。
图3. 突变频率随复制起点（ori）距离（d）的变化关系。 显示了在ColE1复制起点的RNA/DNA转换位点附近，每100 bp区间在单轮直接涂板诱变后的突变频率。由于β-内酰胺酶不是一个中性靶标，因此1600至2400区间未予表示。β-内酰胺酶以外区域的数据显示为每200 bp区间，因为该区域整体突变频率较低。趋势线采用二项式方程拟合（R2=0.41），并以直线形式展示。

琼脂糖凝胶电泳图显示Pol I和目标质粒的分离条带。
补充图1. 含LF Pol I的Pol I质粒。A 序列（FastA格式）。该序列信息用于确定线性化Pol I质粒时所需的合适限制性内切酶，适用于迭代步骤（随机突变文库构建，步骤4）或读出步骤（步骤5）。B 质粒的一般特征及限制性酶切图谱。 图中展示了pSC101复制起点、氯霉素抗性标记（CAT）以及LF-Pol I基因的位置，并标明了各单一限制性酶切位点的位置。

文库 直接涂板液体培养
（1天）		液体培养
（3天）
突变数（#） 9540142
测序克隆数28896190
总覆盖度（bp）182,000102,000213,000
突变频率（×103 bp）0.520.390.67
频率 d<1000（×103 bp）0.920.410.70

表1. 突变频率。 三种诱变方法（直接涂布、液体饱和（1天）和液体超饱和（3天））在 d<1000（即RNA/DNA转换位点相邻1000 bp范围内）的突变频率（表示为每碱基对的突变数，# of mutations/bp）。

  直接涂布液体培养
突变数 (#) 95182
突变谱 (%)   
A 到 GA 到 G6.319.2
 T 到 C4.23.8
    
C 到 TG 到 A27.413.7
 C 到 T35.835.2
    
A 到 TA 到 T5.38.2
 T 到 A5.37.1
    
T 到 GT 到 G1.11.1
 A 到 C0.02.2
    
G 到 TG 到 T1.12.7
 C 到 A2.12.7
    
C 到 GC 到 G2.11.1
 G 到 C5.32.7
    
插入缺失插入3.20.0
 缺失1.10.0
    
 A 到 N11.629.7
 G 到 N33.719.2
 T 到 N10.512.1
 C 到 N40.039.0
    
 转换 (Ts)73.772.0
 颠换 (Tv)22.128.0
 插入缺失4.20

表2. 直接涂布法与液体诱变法的突变指标。 该表格展示了经过一个诱变周期后观察到的突变数量（以数值表示）以及突变谱（以百分比表示）。突变谱按互补碱基对、核苷酸变化类型以及突变类型进行分类。

讨论

本文介绍了一种诱变方案，可在无需克隆或PCR的情况下生成大规模的随机突变文库。该方法基于编码目标序列的质粒进行易错复制。理论上，突变应主要局限于RNA/DNA转换位点下游紧邻的100-300 bp区域内，该区域长度与Pol I产生的前导链中间体大小一致2,10。我们发现，在本方案所述实验条件下，Pol I引发的突变在整个质粒中均有发生，尽管突变频率随着与质粒复制起点（ori）距离的增加而逐渐降低（图3）。这一结果表明，在ColE1质粒复制过程中，Pol I向Pol III的转换或“切换”比先前报道的更为渐进，至少在我们的实验条件下如此2，并且与早期研究提出的Pol I与Pol III之间存在功能冗余的观点一致11。

我们最初的方案描述了在液体培养物中进行的诱变（4）。该方案在距离RNA/DNA转换位点1000 bp以内（d<1000）的区域产生0.41个突变/kb（见表1）。若将液体培养物在摇床中继续培养3天而不添加任何新鲜培养基，会导致过度饱和，使突变频率提高至0.70个突变/kb，但质粒得率极低（不足第1天的1%；数据未显示）（表1）。本文提出一种简化方案，即直接将目标质粒转化产物涂布于37 °C的固体琼脂平板上（图1）。该方法可获得最高的每轮诱变突变频率（d<1000范围内为0.92个突变/kb），并显著提高了迭代效率。将培养条件改为固体培养基也影响了突变谱（表2）。直接涂板诱变减少了液体培养中观察到的互补碱基替换之间的显著不对称性（比较C→T与G→A，以及A→G与T→C）。另一方面，直接涂板导致插入缺失（indel）比例上升（从不足0.5%增至4%），同时使A→G突变数量减少至原来的1/3，从而导致G/C位点突变比例过高（占74%）。总体而言，我们认为，与液体诱变相比，本文所提出的直接涂板方案在操作简便性和效率上的显著优势，超过了其在突变谱均衡性方面的轻微不足。

在目标质粒中，本方法产生的突变不仅局限于目标序列。然而，新生物化学活性的进化应依赖于目标基因内部的突变，因为这代表了一种定性而非定量的变化。因此，将本研究的质粒诱变技术与梯度平板上的突变体筛选相结合，可充分利用本系统的优势（构建大规模文库及具备筛选条件），以实现新生物化学特性的进化。随机诱变的其他应用，例如优化已有的酶活性或对基因的特定区域进行随机化，确实在随机诱变后需要克隆步骤。在这种情况下，将文库构建于质粒中，而非PCR扩增产物中，可通过便于扩增和限制性酶切，提高克隆效率。

总之，我们展示了一种用于构建特定目标基因随机突变文库的简单方案，该方案以操作简便和所产生文库的多样性为显著优势。我们说明了该方法如何与功能性筛选相结合，以高效地进化出新的生化功能。此外，我们通过体内（in vivo）生成的文库可轻松进行克隆，从而实现位点特异性突变或对已有功能的优化。

致谢

本工作获得了针对MC的K08奖CA116429-04以及Conquer Cancer Now（CONCERN）基金会资助项目#8501的支持

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
羧苄青霉素Cellgro46100R6终浓度 0.1mg/ml
四环素Fisher ScientificBP7640终浓度 0.05mg/ml
氯霉素GenlantisM120100终浓度 0.03mg/ml
LB 琼脂（Miller）Fisher ScientificBP1425
LB 肉汤（Miller）Difco Laboratories244620
软琼脂Difco Laboratories214580实验室自制
吖啶橙Sigma-AldrichA38401-1
消泡剂 B 乳液Sigma-AldrichA5757
甘油Acros Organics332030025
100x100x15mm 方皿Fisher Scientific0875711A
100mm 圆皿Fisher Scientific0875712A
显微镜载玻片 25x75x1mmGold Seal3048
电穿孔仪 2510Eppendorf
电穿孔仪 2510Eppendorf
2mm 间隙电转杯Molecular BioProducts5520
Zippy 质粒小提试剂盒Zymo Research Corp.D4020

参考文献

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