使用C2C12成肌细胞的生物能量谱分析实验

摘要

提供了一种用于分析细胞线粒体功能的方法描述。该方法生成的线粒体功能谱可在一次实验中测量四个线粒体功能参数：基础呼吸速率、ATP偶联呼吸、质子漏和备用呼吸能力。

摘要

测量细胞代谢并理解线粒体功能障碍的能力，使全球科学家能够推进其研究，以深入认识线粒体功能在肥胖、糖尿病、衰老、癌症、心血管功能及安全性毒性中的作用。

细胞代谢是指细胞摄取底物（如氧气、葡萄糖、脂肪酸和谷氨酰胺），并通过一系列酶促控制的氧化还原反应将底物转化为能量的过程。这些细胞内生化反应可生成ATP，并向胞外环境释放热量以及乳酸和CO₂等化学副产物。

通过测量细胞消耗氧气的速率，可以深入了解细胞的生理状态及其状态变化，该速率是线粒体呼吸的指标，即氧气消耗速率（OCR）。细胞还通过糖酵解产生ATP，即在不依赖氧气的情况下将葡萄糖转化为乳酸。在培养孔中，乳酸是质子的主要来源。通过检测细胞周围细胞外环境因释放质子而引起的酸化，间接测量所产生的乳酸，可得到细胞外酸化速率（ECAR）。

在本实验中，将C2C12成肌细胞以特定密度接种于Seahorse细胞培养板中。测定基础氧消耗率（OCR）和细胞外酸化率（ECAR），以建立基础代谢速率。随后通过依次加入三种不同的化合物，对细胞进行代谢干扰，从而改变细胞的生物能量特征。

该检测方法源自一种经典的线粒体评估实验，可作为构建更复杂实验的基础框架，用于研究线粒体的生理与病理生理功能，并预测细胞对各种应激和/或损伤的响应能力。

方案

在本实验中，将C2C12成肌细胞以特定密度接种于Seahorse细胞培养板中。通过测定基础氧消耗率（OCR）和细胞外酸化率（ECAR），建立基础速率。

1. 细胞注射

通过连续三次添加不同的化合物，细胞的代谢受到干扰，从而改变其生物能量特征。其中一组作为对照组，加入运行培养基作为对照“化合物”。

1. 首次注射为寡霉素。寡霉素通过阻断F₀部分的质子通道来抑制ATP合成_o 部分ATP合酶（复合物V）。在线粒体研究中，它用于抑制状态3（磷酸化）呼吸。在细胞中，可用于区分用于ATP合成的氧气消耗百分比与为克服线粒体内膜天然质子漏所需消耗的氧气百分比。
2. 第二次注射的试剂是FCCP。FCCP（羰基氰化对-三氟甲氧基苯腙）是一种离子载体，属于可移动的离子转运体。它是一种解偶联剂，通过跨线粒体膜转运氢离子，绕过ATP合酶（复合体V）的质子通道，从而破坏ATP的合成。这种线粒体膜电位的崩溃导致能量和氧气被迅速消耗，而无法生成ATP。在此情况下，OCR和ECAR均会升高：OCR升高是由于解偶联作用，而ECAR升高则是由于细胞试图通过糖酵解途径生成ATP以维持其能量平衡。
   FCCP 处理可用于计算细胞的“备用”呼吸能力，该能力定义为最大非受控耗氧率（OCR）与初始基础耗氧率之间的定量差值。已有研究提出，即使在最大生理或病理生理刺激条件下仍维持一定水平的备用呼吸能力，是决定细胞活力和/或存活的重要因素。细胞在能量需求增加的情况下应对压力的能力，在很大程度上受线粒体生物能量能力的影响。这种生物能量能力由多种因素决定，包括细胞向线粒体递送底物的能力以及参与电子传递的酶的功能活性。
3. 在第三次注射中，向细胞中加入复合体 I 抑制剂鱼藤酮。这将抑制线粒体呼吸，从而能够分别计算出线粒体和非线粒体成分对呼吸的贡献。由于线粒体功能受损，可观察到氧耗率（OCR）下降，同时细胞为维持能量平衡转向更依赖糖酵解的状态，导致细胞外酸化率（ECAR）相应升高。
   鱼藤酮是一种线粒体抑制剂，可阻止电子从复合体I中的铁硫中心（Fe-S）向泛醌（辅酶Q）的转移。复合体I受到抑制后，NADH中的势能无法转化为ATP形式的可利用能量。
   

2. 试剂与材料

1. 寡霉素、FCCP 和鱼藤酮溶液（Seahorse 线粒体应激测试试剂盒）
2. DMEM 运行培养基（Seahorse #100965-000）
3. DMSO（Sigma D8418）
4. 蒸馏水（Gibco 15230-170）
5. 校准缓冲液（Seahorse Bioscience）

3. 培养基

1. 500 mL DMEM (Gibco 11965-092)
2. 10% FBS (Hyclone SH90070.03)
3. 5 mL 青霉素-链霉素溶液 (Gibco 15140-122)
4. 5 mL 丙酮酸钠 (Sigma S8636)
5. 5 mL 谷氨酰胺最大补充液 (Glutamax) (Gibco 35050-061)

4. 接种方案

1. 将细胞以每孔 10,000 个细胞 的密度接种于 XF96 细胞培养板中，每孔加入 100 μL 培养基，置于 37°C、含 10% CO₂ 的培养箱中培养。
2. 细胞在接种后 1 小时内即可贴附于 XF96 细胞培养板。
3. 接种后 24 小时，使用 XF96 对细胞进行检测。

5. 检测模板的制备

1. 使用检测向导（附录 I），生成具有以下分组布局的模板：
   
   图 1. 显示列与分组分配的孔板布局图

6. 化合物制备

1. 按如下方法在XF DMEM检测培养基中配制以下化合物：
   10 µM 寡霉素，30.0 µM FCCP，20.0 µM 鱼藤酮。
   上述浓度为化合物注入孔中时形成的10倍稀释液。实际工作浓度为：
   1 µM 寡霉素，3.0 µM FCCP，2.0 µM 鱼藤酮

7. 培养基更换与细胞准备

1. 将细胞板放置在 XF 样品制备仪上
2. 设定每孔培养基的终体积为 160 μL。
3. 在 37°C 培养箱中孵育 60 分钟（无需 CO₂），使细胞与检测培养基预先平衡。

8. 加载传感器盒

1. 在将化合物加入传感器微孔板之前，先将其预热至 37°C，并按以下方式将化合物加入加样孔中：
   1. 第 1–4 列：分别在 A、B 和 C 孔中加入 16、18 和 20 μL XF 检测培养基（DMEM）。
   2. 第 5–12 列：
      在 A 孔中加入 16 μL 寡霉素
      在 B 孔中加入 18 μL FCCP
      在 C 孔中加入 20 μL 鱼藤酮

9. 实验方案命令

命令	时间（分钟）	端口
校准
平衡
循环开始	3X
混合	3
等待	2
测量	3
循环结束
注入		A
循环开始	2X
混合	3
等待	2
测量	3
注入		B
循环开始	2X
混合	3
等待	2
测量	3
注入		C
循环开始	2X
混合	3
等待	2
测量	3
结束

表1. 实验方案命令

讨论

该实验源自经典的线粒体功能检测方法，可作为研究细胞代谢、线粒体功能及整体生物能量学各种变化的复杂实验设计的基础框架。

本实验中使用的所有化合物均应优化至产生最大效应的浓度，即必须通过单独的滴定实验来确定这些数值。这一点对于 FCCP 尤为重要，因为其滴定曲线通常非常陡峭，过量的 FCCP 反而会降低氧消耗率（OCR）的响应。建议测试的典型范围（终浓度）如下：

• 0.1 - 1.0 µg/mL 寡霉素
• 0.1 - 5.0 µM FCCP
• 0.1 - 1.0 µM 鱼藤酮

请注意，每种化合物（尤其是 FCCP）的反应会受到检测培养基成分（基础类型、[葡萄糖]、[丙酮酸]、BSA 的有无等）的影响。此外，如果改变了 XF 检测培养基的成分，则需要重新进行优化。由于 FCCP 的存在，丙酮酸的存在及其浓度对于获得最大呼吸能力尤为重要。Seahorse Bioscience 在多种细胞系中观察到，缺乏丙酮酸会消除细胞对 FCCP 产生最大反应（高于基础水平）的能力。通常应测试 1–10 mM 的丙酮酸浓度，以确定获得最大呼吸作用所需的最优丙酮酸浓度。请注意，可能需要对 [丙酮酸] 和 [葡萄糖] 进行“交叉滴定”，以获得实验的最佳培养基条件。

本实验的典型结果如下图所示，分别为氧耗率（OCR）随时间变化的曲线图和细胞外酸化率（ECAR）随时间变化的曲线图：

图 2. 耗氧率随时间变化

图 3. ECAR 与时间关系图

在此，我们观察到细胞依次经各化合物处理后，OCR 和 ECAR 出现预期的反应。对于寡霉素，由于其阻断线粒体复合体 V 的 ATP 合成，导致 OCR 降低。由于细胞无法通过氧化磷酸化（OXPHOS）合成 ATP，转而依赖糖酵解以满足 ATP 需求，因此我们观察到 ECAR 升高。如前所示，FCCP 作为一种解偶联剂发挥作用。由于细胞必须克服线粒体内膜的质子泄漏，因此需要消耗更多的 O₂ 将过量质子泵回线粒体膜内，导致 OCR 显著升高。最后，鱼藤酮分别抑制线粒体复合体 I 和复合体 III，导致电子传递链中的电子流动停止，从而 O₂ 的消耗急剧减少。

图 4. 呼吸参数

除了呼吸和ECAR的预期变化外，还可从这些数据中获得多种呼吸参数。这在上图中进行了总结：

在此，我们可以获得有关细胞基础呼吸的信息，包括用于ATP生成的氧气消耗百分比，以及用于维持质子梯度（由H+泄漏引起）的氧气消耗量。此外，我们还可以获得解偶联呼吸条件下的最大呼吸速率（有时称为备用呼吸能力），最后，我们能够确定非线粒体过程所导致的氧气消耗量。

越来越多的研究正在采用这种线粒体谱型来评估细胞生物能量学、识别线粒体功能障碍，并预测细胞对压力和/或损伤的响应能力。有关该实验方法及备用呼吸能力概念的更多详细信息，请参见以下文献^1-8。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
寡霉素、FCCP、鱼藤酮和抗霉素 A 溶液	Seahorse Bioscience		Seahorse 线粒体应激测试试剂盒
DMEM 运行培养基	Seahorse Bioscience	100965-000
二甲基亚砜（DMSO）	Sigma-Aldrich	D8418
蒸馏水	GIBCO，由 Life Technologies 生产	15230-170
校准缓冲液	Seahorse Bioscience