在牙面形成的生物膜具有高度复杂性，并持续暴露于各种内在和外源性的环境挑战中，这些挑战会调控其结构、生理状态及转录组。我们开发了一套工具箱，用于研究口腔生物膜的组成、结构组织及基因表达，该工具箱亦可适用于其他生物膜研究领域。
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摘要
摘要
生物膜是由微生物细胞构成的高度动态、有序且结构化的群落，这些细胞被包裹在密度和成分各异的胞外基质中1, 2。通常情况下，生物膜的形成始于微生物在表面的初始附着，随后形成细胞簇（或称微菌落），并进一步发展和稳定，这一过程发生在复杂的胞外基质环境中。大多数生物膜基质中含有胞外多糖（EPS），口腔生物膜也不例外；尤其是与龋病相关的生物膜，主要由变异链球菌介导3。这些EPS由微生物（如关键贡献者S. mutans）通过胞外酶合成，例如以蔗糖为主要底物的葡萄糖基转移酶3。
由于牙齿表面形成的生物膜持续暴露于口腔内复杂的饮食-宿主-微生物相互作用所带来的环境挑战中，对其开展研究尤为困难。深入理解生物膜基质的结构组织与成分、细胞生理学以及转录组/蛋白质组特征在应对这些复杂相互作用时发生的动态变化，将有助于进一步推动当前关于口腔生物膜如何调控致病性的认知。因此，我们开发了一套分析工具箱，通过结合常用和新型技术以及自主开发的数据分析软件，从结构、生化和分子水平上促进生物膜的分析。我们将标准分析方法（比色法检测、实时定量PCR和微阵列）与新型荧光技术（用于同时标记细菌和胞外多糖）相结合，并配套特定的数据分析软件，以应对口腔生物膜研究的复杂性。
该工具箱包含四个不同但相互关联的步骤（图1）：1）生物测定，2）原始数据输入，3）数据处理，以及4）数据分析。我们采用体外（in vitro）生物膜模型和特定实验条件，以展示该工具箱的实用性与灵活性。该生物膜模型简单、可重复，并可在同一实验中同时进行多个重复4, 5。此外，该模型支持时间序列评估、多种微生物物种的共培养5，以及不同实验条件的影响分析（例如处理干预6；敲除突变株与亲本菌株的比较5；碳水化合物的可利用性7）。本文中，我们介绍工具箱的两个具体组成部分：（i）用于微阵列数据挖掘/整理（MDV）和荧光成像分析（DUOSTAT）的新软件，以及（ii）原位（in situ）胞外多糖（EPS）标记技术。同时，我们提供一个实验案例，展示该工具箱如何辅助生物膜的分析、数据的组织、整合与解释。
方案
1. 步骤 1 - 生物测定
生物膜法使用羟基磷灰石（HA）圆片作为牙齿替代物（Clarkson Chromatography Products, Inc., South Williamsport, PA, USA；表面积 = 2.7±0.2 cm2），其表面涂覆唾液（模拟获得性膜的存在），并将圆片垂直放置4, 5, 8。
- 生化检测
- 生物膜可通过(i)超声处理进行均质化 9 或 (ii) 保持完整以用于生化检测 8均质化的生物膜悬液可用于测定生物量（干重）、总蛋白、无机物以及胞外和胞内多糖的组成/含量（详见Lemos） 等研究口腔生物膜生理学的实验方案 8）。可采用标准的糖酵解pH下降、酸致杀伤、质子通透性和F-ATP酶活性检测方法对完整生物膜的生理反应进行分析（详见Lemos 等研究口腔生物膜生理学的实验方案 8).
- 转录组分析
- 标准cDNA微阵列和RT-qPCR实验方案（如http://pfgrc.jcvi.org/index.php/microarray/protocols.html）可联合用于确定特定病原体的转录组响应（例如 S. mutans在不同发育阶段，生物膜中的微生物对各种环境和治疗挑战的响应 6, 7, 10, 11在工具箱中，我们包含了两种对牙菌斑生物膜转录组分析至关重要的方法：1）RNA质量控制（由于生物膜群落的异质性以及胞外多糖基质的存在）；2）数据挖掘与解读（由于微阵列产生大量数据）。
- RNA提取 为解决从生物膜中提取RNA的质量问题，我们采用了一种专门优化的实验方案，用于从富含胞外多糖基质包裹的细菌细胞中分离和纯化RNA 12 （http://dx.doi.org/10.1016/j.ab.2007.03.021）。本方案获得的RNA完整性数（RIN）高于8.5，被认为适用于RT-qPCR和微阵列进行转录组分析（示例见 6, 11).
- 标准cDNA微阵列和RT-qPCR实验方案（如http://pfgrc.jcvi.org/index.php/microarray/protocols.html）可联合用于确定特定病原体的转录组响应（例如 S. mutans在不同发育阶段，生物膜中的微生物对各种环境和治疗挑战的响应 6, 7, 10, 11在工具箱中，我们包含了两种对牙菌斑生物膜转录组分析至关重要的方法：1）RNA质量控制（由于生物膜群落的异质性以及胞外多糖基质的存在）；2）数据挖掘与解读（由于微阵列产生大量数据）。
- 荧光成像。生物膜的结构组织。
- 文献中大多数共聚焦荧光成像方案均集中于微生物标记。在涉及荧光成像的口腔生物膜研究中，作为生物膜主要组分的胞外聚合物基质（EPS）的分析在很大程度上被忽视，仅有少数例外。 5, 13, 14我们开发了一种新型标记技术及专用软件，可对完整生物膜中的胞外聚合物（EPS）和细菌细胞进行可重复的同步可视化与定量分析。采用Amira 5（Visage Imaging GmbH，Berlin，Germany）对生物膜进行三维重建，而定量分析则由COMSTAT（可从http://www.imageanalysis.dk获取）和DUOSTAT（http://www.imageanalysis.dk）完成。
- 生物膜中胞外多糖-细菌结构组织的成像。使用 Alexa Fluor 647 标记的葡聚糖偶联物对胞外多糖基质进行可视化。荧光标记的葡聚糖可作为链球菌葡萄糖基转移酶-Gtfs（特别是 GtfB 和 GtfC）的引物，并可在生物膜发育过程中伴随胞外多糖基质的合成被同时整合进去 11.
EPS标记：- 按照“生物膜制备”方案，将经滤膜除菌的唾液覆盖于羟基磷灰石圆片上，孵育1小时 8.
- 在24孔板的每个孔中加入2.8 mL培养基，然后置于暗室中。
- 添加 1 μM 将葡聚糖偶联Alexa Fluor加入培养基中，通过上下吹打（约10次）混匀染料与培养基。
- 将唾液包被的羟基磷灰石（sHA）圆片（经1小时孵育后）在无菌AB缓冲液中浸洗两次，随后放入含有葡聚糖偶联Alexa Fluor的培养基中。
- 用铝箔覆盖培养板，并在 37°C，5% CO₂2孵育时间的长短取决于具体的实验设计。在本实验所用浓度下，荧光标记的葡聚糖不会对细菌细胞产生染色。 11. 其他EPS染色技术，例如使用Calcofluor 14可联合使用。
- 细菌标记：
- 使用标准荧光核酸染料（如 SYTO 9）在生物膜形成结束时对生物膜中的细菌组分进行标记；其他荧光技术（如物种特异性荧光标记抗体） 15 或 gfp表达细胞 16当然可用于检测生物膜中的一种或多种细菌。图2显示了24小时生物膜三维图像中胞外聚合物（EPS，红色）与细菌/微菌落（绿色）的同步标记 S. mutans 在sHA圆盘表面形成的生物膜
- 图像采集：采用激光扫描共聚焦显微镜，根据标准操作流程，对每个生物膜在5至10个随机选定的位置进行扫描，并在每个位置通过光学切片生成z轴系列图像。我们使用配备x10（Carl Zeiss；数值孔径0.45；工作距离3-4 mm）或x25（Olympus LPlan N；NA 1.05；WD 2 mm）水浸物镜的Olympus FV 1000双光子显微镜（Olympus，东京，日本）。激发波长为810 nm，SYTO 9（细菌）的发射波长滤光片为495/540 OlyMPFC1滤光片，Alexa Fluor 647（EPS）的滤光片为HQ655/40M-2P滤光片。保存并存储原始图像。
- 生物膜中胞外多糖-细菌结构组织的成像。使用 Alexa Fluor 647 标记的葡聚糖偶联物对胞外多糖基质进行可视化。荧光标记的葡聚糖可作为链球菌葡萄糖基转移酶-Gtfs（特别是 GtfB 和 GtfC）的引物，并可在生物膜发育过程中伴随胞外多糖基质的合成被同时整合进去 11.
- 文献中大多数共聚焦荧光成像方案均集中于微生物标记。在涉及荧光成像的口腔生物膜研究中，作为生物膜主要组分的胞外聚合物基质（EPS）的分析在很大程度上被忽视，仅有少数例外。 5, 13, 14我们开发了一种新型标记技术及专用软件，可对完整生物膜中的胞外聚合物（EPS）和细菌细胞进行可重复的同步可视化与定量分析。采用Amira 5（Visage Imaging GmbH，Berlin，Germany）对生物膜进行三维重建，而定量分析则由COMSTAT（可从http://www.imageanalysis.dk获取）和DUOSTAT（http://www.imageanalysis.dk）完成。
2. 第2步 - 原始数据输入
将生化实验和RT-qPCR实验的原始数据直接输入原始数据文件（RDF-MS Excel文件）中。 对于微阵列数据，将扫描玻片的单通道图像载入JCVI Spotfinder软件（http://pfgrc.jcvi.org/index.php/bioinformatics.html）或类似软件。根据JCVI规范创建点阵网格，然后手动调整以使所有斑点均位于网格内。测量每个斑点的强度值，并保存为“.mev”文件，存储至“原始微阵列数据”文件夹中。
3. 第3步 - 数据处理
将原始数据（生化数据和RT-qPCR数据）整理至RDF中，用于统计分析。将这些数据转入“数据处理文件”（DPF，即Microsoft Excel文件）。对于微阵列和荧光成像分析，使用特定软件（包括现有软件和定制软件）进行数据处理。
- 基因芯片数据：
- 将步骤2中生成的原始数据（存储于“原始基因芯片数据”文件夹中）提交至数据标准化步骤，并使用特定软件进行处理。采用JCVI开发的基因芯片数据分析软件MIDAS（http://www.tm4.org/midas.html）对数据进行标准化处理，使用LOWESS方法及标准差正则化，默认参数设置，随后进行片内重复分析。保存包含标准化后数据的文件。在此阶段（原始数据文件和标准化数据文件均已准备就绪），应将基因芯片数据存入公共访问数据库（例如NCBI基因表达综合数据库GEO，网址为http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo），并记录登录号以供后续参考。
- 荧光成像数据
- 生物膜结构的定量分析。
- 生物膜各结构组分（如胞外基质EPS和细菌）对应的定量数据通过COMSTAT以及新开发的DUOSTAT程序计算获得，这两个程序均以脚本形式编写于MATLAB 5.1中。将原始荧光图像上传至软件后按以下方式分析：
- 使用COMSTAT计算生物量、厚度、层状分布及其他参数，用于量化并表征生物膜的三维结构（参见http://www.imageanalysis.dk 上的手册）。
- 使用DUOSTAT计算两种生物膜组分（如EPS与细菌，或不同微生物种类和/或胞外组分）之间的共定位：
- 在MATLAB 5.1中设置DUOSTAT程序路径，并打开包含两种生物膜组分图像的文件夹。
- 选择需要进行相关性分析的两个通道。两个图像堆栈在三个维度（x、y、z）上的像素尺寸必须完全相同，且每个堆栈中的图像数量也需一致。
- 根据COMSTAT手册为每个通道设置阈值，遵循软件操作界面中的指示（参见视频文章；DUOSTAT手册见http://www.imageanalysis.dk）。将获得的数据输入DPF。示例见图4.4。
- 三维生物膜结构重建。
- 使用Amira软件可视化生物膜的三维结构。将存储于“原始图像文件夹”中的荧光图像导入软件，利用voltex和等值面渲染（iso-surface rendering）方法，分别对生物膜中各组分生成三维渲染图像（参见Amira手册：http://www.amira.com/documentation/manuals-and-release-notes.html）。示例见图4.4。
- 生物膜各结构组分（如胞外基质EPS和细菌）对应的定量数据通过COMSTAT以及新开发的DUOSTAT程序计算获得，这两个程序均以脚本形式编写于MATLAB 5.1中。将原始荧光图像上传至软件后按以下方式分析：
- 生物膜结构的定量分析。
4. 第4步 - 数据分析
DPF 中的生化、RT-qPCR 和 COMSTAT-DUOSTAT 检测所产生的定量数据已可用于统计分析。完成统计分析后，可绘制图表和/或表格（参见“代表性结果”部分）。
1. 使用软件 Microarray Data Visualizer (MDV) 进行微阵列数据整理。
由于使用微阵列和多种实验条件时数据复杂且产出大量数据集，我们设计了一款名为微阵列数据可视化工具（Microarray Data Visualizer, MDV）7的数据挖掘与组织软件（可从 http://www.oralgen.lanl.gov/ 获取）。
使用 BRB-ArrayTools（http://linus.nci.nih.gov/BRB-ArrayTools.html）进行统计分析后，若用于类别预测和类别比较的显著性阈值设定为 P 值小于 0.001，则所获得的数据可按以下方式提交至 MDV：
- 使用 Excel 将 BRB 数据转换为 MDV 制表符分隔的文本文件。删除基因座标签编号中附带的所有字母；例如：SMU.1423c，删除字母“c”。
- 打开 MDV。依次点击“文件”和“选择注释源”，选择“Flat File”。在弹出的对话框中，使用“浏览”按钮选择包含基因名称、基因本体（GO）编号、通路及功能分类数据注释信息的文件。
- 转到“文件”，导入第1项中的每个文件。每个文件代表一个用于分析的实验条件。如果存在多个待分析条件，例如两种不同处理（处理1和处理2）以及对照（溶剂），请转至第4项。
- 在此情况下，可能的比较包括：（A）处理组1与对照组（用于筛选因处理组1而差异表达的基因）；（B）处理组2与对照组；以及（C）处理组1与处理组2。根据研究假设的不同，可选择不同的基因集合。
- 仅选择在比较 A 中差异表达的基因（仅受处理 1 影响的独特基因）。此时，使用“集合功能”菜单中的“相减”（Subtract）功能，将比较 B 中的基因从 A 中减去，并保存结果；随后，从所得数据中再减去比较 C 中的基因。同样地，可通过相同操作获得仅存在于 B 中的基因（仅受处理 2 影响的独特基因）。
- 仅选择在 A 和 B 中均被检测到的基因，使用“集合功能”菜单中的并集（Union）函数合并 A 和 B 比较的结果，并保存结果。然后从结果数据中减去 C。
- 这些操作可以通过MDV中提供的维恩图进行可视化，这种方式更加直观，并有助于基于假设的数据组织。维恩图的数据输出结果将直接显示在屏幕上（参见图3中的屏幕视图及视频文章）。
- 要将数据保存为制表符分隔的文本文件，请转到“文件”菜单并选择“导出”。
- 导出制表符分隔的文本文件，使用 Excel 打开，并将 MDV 输出的数据整理为表格形式和/或转换为图形显示（见图 4.2、4.3 及视频文章）。
5. 代表性结果
本文提供了一个示例，说明分析工具箱如何将具有多个变量和实验条件的生物膜研究中的各种检测方法进行整合。
实验案例：
动态 Streptococcus mutans 生物膜发育过程中对淀粉和蔗糖的转录组响应 7.
背景：
膳食淀粉和蔗糖与宿主唾液淀粉酶及链球菌葡萄糖基转移酶的相互作用可能通过增加胞外多糖的合成、糖代谢以及产酸性，增强生物膜中S. mutans的形成及其毒力11。这种复杂的宿主-病原体-饮食相互作用可能调控与龋齿疾病相关的致病性生物膜的形成。我们在淀粉酶存在的条件下，对S. mutans在生物膜发育不同阶段对淀粉和蔗糖的响应机制进行了全面的生物化学与转录组学分析（包括全基因组表达谱分析）7。
分析工具箱被用于协助我们整合在不同实验条件和时间点下形成的生物膜的生化与分子检测结果。使用该分析工具箱获得的整体数据输出以顺序方式展示于图4（4.1至4.4）。值得注意的是，此处的重点在于展示该工具箱的应用价值，而非对数据进行解释与讨论。
- 结合生化实验与RT-qPCR检测，筛选用于后续微阵列分析的实验条件。 最初，我们测试了6种不同的蔗糖浓度以及5种不同的淀粉与蔗糖组合，以筛选出促进生物膜发育的最佳碳水化合物浓度 S. mutans 使用我们的 体外 模型。通过同时检测生物测定的数据输出，我们得以根据不溶性胞外多糖的含量（升高）以及基因表达的增强情况，筛选出三个特定浓度（如图4.1所示）。 gtfB （负责生物膜中不溶性葡聚糖的合成）
- 微阵列分析 所选的三种膳食碳水化合物浓度用于形成生物膜，并在反映生物膜发育不同阶段的特定时间点取样。这些生物膜分为3个实验组和4个时间点，通过整合全基因组表达谱（cDNA 微阵列）、BRB-Array Tools 与 MDV 进行转录组分析。
采用生物膜特异性方案提取并纯化 RNA 12，然后通过分析工具箱的四步流程进行微阵列分析。图4.2展示了MDV如何根据我们的工作假设筛选出目标基因，即蔗糖与淀粉的组合会触发与增强毒力（致龋潜力）相关的特定转录反应 S. mutans 在生物膜内。由BRB-ArrayTools生成的原始数据（图4.2a）通过MDV软件使用维恩图进行处理（图4.2b）。在本研究中，与我们假设相关的基因组是指在比较A（0.5%蔗糖 + 1%淀粉 vs. 1%蔗糖）和比较B（0.5%蔗糖 + 1%淀粉 vs. 0.5%蔗糖）中差异表达的基因，但不包括在比较C（0.5%蔗糖 vs. 1%蔗糖）中差异表达的基因（图4.2a和4.2b）。如图4.2c所示，MDV显著减少了需要分析的基因总数，同时过滤掉那些不直接与蔗糖和淀粉联合作用相关的基因。MDV的数据输出还被转化为图形化展示，显示在4个时间点上，淀粉+蔗糖生物膜（相对于蔗糖培养的生物膜）中差异表达（上调和下调）的基因按其功能类别分类组织的数据（图4.3）。MDV软件操作简便，有助于对微阵列实验产生的大规模复杂数据集进行挖掘和整理。 - 生物膜成像 同时，使用工具箱中包含的COMSTAT-DUOSTAT-Amira对生物膜的结构组织进行分析（见图4.4中淀粉+蔗糖培养生物膜的三维重建与定量分析示例；亦见视频文章）。利用Amira的三维表面渲染可直观展示胞外聚合物（EPS）与微菌落的形态、分布及其结构关系。可生成选定区域的放大视图，以揭示微生物与EPS在微米尺度下的特定结构关系（图4.4）。此外，同一组共聚焦图像可通过COMSTAT-DUOSTAT进行处理，同步获得生物量/微菌落测量、细菌细胞与EPS的空间分布及共定位信息。例如，使用COMSTAT-DUOSTAT从三维共聚焦生物膜图像的每一光学切片中计算EPS与细菌自圆盘表面至液相的垂直分布情况（图4.4中的图表；见视频文章）。数据显示，在生物膜深度范围内，EPS的比例（红线）高于细菌（绿线）。此外，大部分细菌细胞与EPS相关联（蓝线），尤其是在生物膜的中层和外层。该观察结果表明，在淀粉和蔗糖条件下生长的生物膜富含胞外多糖，这些胞外聚合物与大多数细菌细胞紧密接触并将其包裹；此类结构特征增强了生物膜的稳定性和内聚性。 13三维重建和共聚焦图像的定量测量提供了有关生物膜结构的附加信息，这些信息补充了生化和基因表达数据（GtfB型不溶性葡聚糖合成增加） S. mutans 在淀粉+蔗糖培养的生物膜中）（更多示例参见 5, 6 ,11 ,13).
分析工具箱帮助我们获取、整理和整合来自不同生物测定的数据，从而对以下方面进行了全面分析 S. mutans 可能由于口腔中饮食与宿主相互作用的影响，对复杂的环境变化产生响应（详见 Klein） 等, 2009 11；Klein 等, 2010 7).
图 1. 生物膜分析分析工具箱的流程图。
图2. 生物膜中胞外多糖基质（EPS）与细菌的共聚焦荧光成像。在sHA圆盘表面形成的变异链球菌（Streptococcus mutans）生物膜三维重建图中，同时显示了EPS（红色）和细菌/微菌落（绿色）。
图3. 使用微阵列数据可视化软件（MDV）进行微阵列数据挖掘与整理。利用维恩图功能筛选目标基因，并随后添加基因名称及功能分类注释。
图 4.1 生物膜形成的评估 S. mutans 使用生化分析法（A）和实时定量 PCR（B）。不溶性胞外多糖（INS）数据与该模式高度一致 gtfB 表达量以及生物膜的生物量。1% 蔗糖为胰岛素样物质（INS）形成的最适浓度， gtfB 在sHA表面的表达和生物膜积聚，而0.5%蔗糖是我们实验条件下实现生物膜最佳发育所需的最低浓度 体外 模型 S. mutans 在含有0.5%蔗糖和1%淀粉的培养条件下生长的细胞产生的生物量最高，并且表现出比其他生物膜更多的INS，这与增强的 gtfB 表达（B2）。选择这些碳水化合物浓度进行进一步的转录组分析。
图 4.2. 使用 BRB-ArrayTools 软件结合 MDV 软件进行基因芯片数据分析。a) 显示使用 BRB-ArrayTools 分析得到的在各组比较（A、B 或 C）及各时间点中差异表达的基因数量。b) 利用维恩图在微阵列数据可视化工具（MDV）中筛选目标基因。c) 根据 MDV 分析结果所选出的基因。
图 4.3. S. mutans 基因在不同时间点于淀粉+蔗糖生物膜（相对于仅含蔗糖的生物膜）中按功能类别分类的差异表达情况。基因注释信息来源于洛斯阿拉莫斯国家实验室（www.oralgen.lanl.gov）或该网站提供的已发表文献。
图 4.4. 淀粉+蔗糖生物膜的三维渲染及COMSTAT-DUOSTAT分析。
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讨论
在本研究中，我们展示了分析工具箱（EPS/细菌成像与微阵列数据挖掘/处理）的两个关键组成部分，以及该系统所整合的多种检测方法的多功能性与实用性。显然，该工具箱有助于在不同实验条件下，对生物膜的生化特性、结构特征和基因表达等多个方面进行综合（比较性）和同步分析，所采用的方法基于一种 体外 模型7 考虑到结构组织、生理反应和转录组响应的动态而复杂的变化， S. mutans （以及其他病原体）在生物膜中的作用，整合性分析有助于进一步理解生物膜如何调节口腔内的致病性。我们目前正在将物种特异性标记以及宏基因组学/宏蛋白质组学分析整合到分析工具箱中，这将增强我们深入研究多物种生物膜模型中复杂生态相互作用和结构变化的能力。5
此外，该工具（以及所有生物测定方法）具有灵活性，可通过附加组件（如宏蛋白质组和硬表面分析；正在进行中）进行升级，并可针对口腔生物膜研究以外的应用进行调整或修改。例如，MDV 可能对其他使用全基因组分析以比较多种实验条件的生物膜相关领域特别有帮助，例如不同（突变）菌株之间的比较转录组分析，或...
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致谢
作者谨感谢 Gary Xie 博士和 Herbert Lee 在 MDV 开发方面的贡献。我们还感谢 Simone Duarte 博士、Ramiro Murata 博士、Jae-Gyu Jeon 博士、Jacqueline Abranches 博士以及 Stacy Gregoire 女士在工具箱分析组件方面提供的技术和科学支持。本研究部分由美国国立牙科与颅面研究所（National Institute of Dental and Craniofacial Research）提供的 USPHS 研究基金 DE018023 资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Syto 9 | Invitrogen | S34854 | |
| Syto 60 | Invitrogen | S11342 | |
| 与Alexa 647偶联的葡聚糖 | Invitrogen | D22914 | |
| Olympus FV1000双光子激光扫描显微镜 | Olympus Corporation |
参考文献
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