肺上皮细胞可从小鼠呼吸道分离，并在气液界面培养，作为分化型呼吸道上皮的模型。本文描述了一种分离、培养这些细胞并将其暴露于主流香烟烟雾的实验方案，以研究细胞对这种环境毒素的分子响应。
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摘要
摘要
肺上皮细胞可从小鼠呼吸道分离，并在气液界面（ALI）条件下培养，作为分化型呼吸道上皮的模型。本文描述了一种分离这些细胞并将其暴露于主流香烟烟雾（CS）的实验方案，以研究上皮细胞对香烟烟雾暴露的反应。该方案包括三个部分：从小鼠气管分离气道上皮细胞、将这些细胞在气液界面（ALI）培养为完全分化的上皮细胞，以及向培养中的细胞递送经校准的主流香烟烟雾。ALI培养系统使呼吸道上皮细胞的培养条件更接近其生理环境，优于常规液体培养系统。研究香烟烟雾暴露下分子和肺细胞的反应，对于理解环境空气污染对人类健康的影响至关重要。该领域的研究成果最终有助于阐明慢性阻塞性肺疾病（COPD）及其他烟草相关疾病的病因，这些疾病是全球主要的健康问题。
方案
整个实验方案需要2天时间从动物组织中分离细胞，5-10天进行细胞增殖，再额外需要10-14天在气液界面条件下诱导细胞分化。此外，还需要1天时间进行细胞暴露处理及样本采集。
1. 小鼠气管支气管上皮细胞（MTEC）的分离。
注意：以下所述所有操作步骤均已通过布莱根妇女医院/哈佛医学院机构动物护理与使用委员会的审查和批准。
开始之前：
- 配制含抗生素的 Ham's F12 培养基。向 250 mL Ham's F12 基础培养基（Cellgro）中加入 2.50 mL 的 100 倍浓缩青霉素/链霉素溶液（102 U/mL–102 mg/mL）和 250 μL 的 1000 倍浓缩两性霉素 B 溶液。4°C 保存，最长可保存 4 周。
- 配制 0.15% 溴化蛋白酶溶液。将 15 mg 溴化蛋白酶加入 10 mL 含抗生素的 Ham's F12 培养基中。现用现配，并置于冰上保存直至使用。
- 准备洁净的操作台面、适用于小型动物手术的无菌外科器械，以及用于细胞分离的层流通风细胞培养罩。其他所有设备均为动物细胞培养常规所需，包括加湿 CO2 培养箱、冷藏室、台式细胞离心机、倒置显微镜以及一次性塑料移液管和培养器皿。
- 配制 I 型胶原蛋白溶液（50 μg/mL，溶于 0.02 N 乙酸中）。将 1.0 mL 胶原蛋白溶液加入 12 孔 Transwell 板（Corning）的每个孔中。用封口膜包裹，室温下水平静置过夜。
- 使用市售小鼠品系（例如 C57Bl/6，雄性，6-8 周龄），采用经批准的安乐死方法（如 CO2 诱导麻醉）处死小鼠。通常 6 只小鼠可获得足够细胞（每只小鼠 1.5–2.0 × 105 个细胞），用于接种一个 12 孔 Transwell 板。
- 用 70% 乙醇溶液喷洒动物尸体，以消毒操作区域。
- 使用无菌手术剪和解剖刀，去除气管周围皮肤并暴露气管。切开腹部，沿胸骨剪开，移除胸廓。去除组织直至暴露气管末端。
- 将气管放入含有 30 mL Ham's F12 培养基（含抗生素）的 50 mL 锥形管中，并置于冰上。
- 在无菌层流罩内，将气管组织转移至含有 10 mL Ham's F12 培养基（含抗生素）的无菌 100 mm 培养皿中。
- 用无菌镊子和手术剪轻轻剥离结缔组织。
- 将气管组织转移至另一个含有 10 mL Ham's F12 培养基（含抗生素）的 100 mm 培养皿中进行清洗。沿纵向切开气管以暴露管腔。
- 将气管转移至含有 10 mL 0.15% Pronase 溶液的 50 mL 管中，4°C 过夜孵育。
- 第二天，准备以下溶液：
- 配制 DNAse I 溶液：向 18 mL 含抗生素的 Ham's F12 培养基中加入 2 mL 10 mg/mL 牛血清白蛋白（BSA）储备液和 10 mg 粗制胰 DNase I。分装为每管 1 mL，-20°C 保存（使用前在冰上解冻）。
- 配制含 20% 胎牛血清（FBS）的 Ham's F12 培养基：向 200 mL Ham's F12 基础培养基（Invitrogen）中加入 50 mL 热灭活 FBS、2.5 mL 100 × 青霉素/链霉素（102 U/mL–102 mg/mL）溶液和 250 μL 1000 × Fungizone 溶液。
- 配制含抗生素的 MTEC 基础培养基：向 475.5 mL DMEM/F12 基础培养基（Cellgro）中加入 7.5 mL 1 M HEPES 溶液、10 mL 200 mM 谷氨酰胺溶液、2 mL 7.5% NaHCO3 溶液、5 mL 100 × 青霉素/链霉素溶液和 500 μL 1000 × Fungizone 溶液。
- 配制含 10% FBS 的 MTEC 培养基：向 45 mL 含抗生素的 MTEC 基础培养基中加入 5 mL 热灭活 FBS。
- 轻轻摇动第 1.8 步的试管 10–12 次，然后在 4°C 静置 30–60 分钟。
- 向管中加入 10 mL 含 20% FBS 和抗生素的 Ham's F12 培养基，摇动 12 次。
- 准备 3 个 15 mL 锥形管，每管含 10 mL 含 20% FBS 和抗生素的 Ham's F12 培养基。
- 从 Pronase 溶液中取出气管，将该溶液保留在冰上；将气管转移至第一个含有 Ham's F12 的锥形管中，倒置混匀 12 次。重复此过程共三次。
- 将 Pronase 溶液与第 1.13 步的三个上清液合并至一个 50 mL 管中。弃去剩余组织。
- 在 4°C 下以 1400 rpm（390 × g；Eppendorf 5810R 离心机配 A-4-62 转子）离心 10 分钟，弃去上清液。
- 用 1 mL DNAse 溶液（每根气管 100–200 μL）轻轻重悬沉淀，并在冰上孵育 5 分钟。
- 在 4°C 下以 1400 rpm（390 × g）离心 5 分钟，弃去上清液。
- 用 8 mL 含 10% FBS 的 MTEC 培养基重悬细胞沉淀。
- 将细胞悬液接种于 Primaria 培养板（Falcon）。在 37°C、95% 空气和 5% CO2 的环境中孵育 5 小时（注：此为成纤维细胞的负向筛选步骤）。
- 收集培养板中的细胞悬液，并用 4 mL 含 10% FBS 的 MTEC 培养基冲洗培养板两次。将细胞悬液与洗液合并至一个 50 mL 锥形管中。
- 保留 1 mL 用于细胞离心涂片和细胞计数。在台式离心机中以 5000 rpm 离心 5 分钟（Eppendorf 5415D）。移除 500 μL 上清液，将沉淀重悬于剩余上清液中。取 100 μL 用台盼蓝活体染色法进行细胞计数。保留 4 份 100 μL 样品用于细胞离心涂片分析。
- 将剩余的 15 mL 细胞悬液在 4°C 下以 1400 rpm（390 × g）离心 10 分钟。
2. 气液界面条件下MTEC的扩增与分化
制备维甲酸储备液。储备液 A：在避光条件下称取维甲酸（分子量 300.44 g/mol），用 95% 乙醇配制成 5 mM 的储备液。将溶液装入铝箔包裹的离心管中，于 -80°C 保存。根据需要，取 50 μL 储备液 A、500 μL BSA 溶液（100 mg/mL）和 49.5 mL Hank's 平衡盐溶液（HBSS），混合配制储备液 B（5 μM）。储备液 B 亦用铝箔包裹的离心管分装，于 -80°C 保存，可稳定存放长达 4 周。
配制含视黄酸的MTEC增殖培养基。向含有抗生素的45.7 mL MTEC基础培养基中加入2.5 mL热灭活胎牛血清、1 mL视黄酸储存液B、250 μL胰岛素溶液（2 mg/mL胰岛素溶于4 mM HCl）、250 μL表皮生长因子溶液（5 μg/mL EGF溶于含1 mg/mL BSA的HBS）、200 μL牛垂体提取物（15 mg/mL溶于含1 mg/mL BSA的HBS）、50 μL转铁蛋白溶液（5 mg/mL转铁蛋白溶于含1 mg/mL BSA的HBS）以及50 μL霍乱毒素溶液（100 mg/mL溶于含1 mg/mL BSA的HBS）。将最终配制的培养基过滤除菌，并在配制后2天内使用。
- 从Transwell板中移除胶原溶液，在生物安全柜中静置5分钟，并用PBS洗涤两次。
- 离心后，将细胞沉淀重悬于适量增殖培养基（500 μL）中，以便每孔接种7.5 × 104–1.0 × 105个细胞。用移液器将500 μL细胞悬液加入Transwell聚碳酸酯膜插入物的顶端表面，在Transwell的基底室中加入1.5 mL增殖培养基。
- 将浸没培养的MTEC细胞置于37°C、含95%空气和5% CO2的湿化培养箱中培养7–10天。
- 首次换液前等待三天，之后每隔一天换液一次。通过肉眼观察及使用电极（EVOM Ohmvoltometer，World Precision Instruments，Sarasota，FL）测量跨上皮细胞电阻来监测培养状态。
- 当细胞呈现汇合状态且跨上皮电阻达到1000 Ω/cm2时，细胞已准备好在气液界面（ALI）进行分化。
- 配制含2% NuSerum的MTEC基础培养基。将NuSerum加入MTEC基础培养基中，使其终浓度为2%（V/V）。使用前加入维甲酸Stock B，使其终浓度为1 × 10-7 M。现配现用，配制后2天内使用完毕。
- 通过移除顶端培养基并将基底室培养基更换为750 μL含2% NuSerum和维甲酸的MTEC基础培养基，使细胞在10–14天内进行分化。每隔一天更换一次基底室培养基，并用含2% NuSerum的MTEC培养基洗涤顶端表面。
3. 香烟烟雾对培养的上皮细胞的应用
- 使用香烟烟雾细胞暴露系统（EMI Instruments，Pittsburgh，PA）将transwell培养物的顶侧暴露于主流香烟烟雾中。装置的照片见图1。技术规格详见特定试剂与设备表格。简言之，该装置包含一个蠕动泵，可在约7-8次抽吸内点燃每支香烟，并将主流烟雾吸入连接至通气暴露室的聚丙烯管路中。暴露室通过循环水维持在37°C，并通过气体管路维持5% CO2的气体环境。可使用肯塔基大学烟草研究所（Lexington，KY）提供的Kentucky 3R4F科研参考滤嘴香烟对细胞进行暴露。通常，细胞暴露于1-2支香烟产生的烟雾中，产生100-200 mg/m3的总颗粒物（TPM）。对照组培养物在相同暴露时间内暴露于室内空气。
- 根据TE-10c吸烟机（Teague Enterprises）随附的制造商协议测定TPM。简要而言，将滤膜（Pallflex）置于采样管路上的不锈钢在线滤器中，该采样管连接吸烟室的采样口与恒流泵（采样单元）。采样单元通过出流管连接至气体计量器（Dry Gas Meter，ONM61,67，AEM）。在气体采样前后分别称量滤膜重量。以采样空气总体积对滤膜上沉积的总物质（mg）进行归一化处理。
- 暴露后可在任意时间点（例如0-24小时）收集细胞，用于标准细胞分析程序（例如Western免疫印迹分析、mRNA分析等）或显微镜检查（例如共聚焦显微镜或电子显微镜）。培养基也可用于检测细胞因子或乳酸脱氢酶（LDH）释放，以评估细胞毒性。
4. 代表性结果
成功的上皮细胞分离、增殖及在气液界面（ALI）条件下的分化应形成一层完整、呈铺路石样形态的单层细胞。健康培养物的跨上皮细胞电阻应约为 1000–2000 Ω/cm2。图 2 显示了在对照条件及香烟烟雾暴露后，经上皮细胞和纤毛标志物染色的小鼠呼吸道上皮细胞单层。图 3 展示了健康原代小鼠气管上皮细胞（MTEC）培养物的代表性电子显微照片，呈现其超微结构及纤毛形态。
图1. 上皮细胞的制备分为三个阶段：分离、扩增和气液界面分化阶段（示意图）。上皮细胞从小鼠气管中分离后，接种于Transwell小室，在浸没培养条件下增殖，随后转换为气液界面培养，使其完全分化。实验通常在培养第24天进行th 连续培养的第几天。该图展示了一个用于将培养细胞暴露于主流烟雾的模型系统。一个Transwell气液界面（ALI）培养系统被置于定制的模块化香烟烟雾递送装置内，该装置可控制温度、湿度和CO。2.
图2. 上皮细胞培养物经固定后，使用Hoechst 33258染细胞核、Alexa Fluor 488标记的鬼笔环肽（绿色）染F-actin，以及Cy3标记的二抗（红色）染纤毛标志物乙酰化α-微管蛋白。下方图示为暴露于香烟烟雾（2支香烟，150 mg/m3）4小时后获得的上皮细胞相应图像。(B) 暴露于不同浓度香烟烟雾后24小时，测定基础培养基中乳酸脱氢酶（LDH）的释放量。
图3. 从小鼠气管上皮分离的上皮细胞在气液界面培养条件下可分化为多种亚型，透射电子显微镜（TEM）下可见其具有纤毛细胞、基底细胞和非纤毛细胞的特征1。这些细胞代表了假复层呼吸上皮的典型结构。图中标签对应如下：bb：基体，a：轴丝，m：线粒体，n：细胞核，s：基质（聚碳酸酯膜），mv：微绒毛
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讨论
从小鼠气管中分离上皮细胞的实验方案改编自You 等1及其他研究者2-3的方法，并进行了修改。与所有细胞分离方案一样，最关键的步骤是采用严格的无菌技术，避免细菌或真菌病原体污染。第二个关键步骤是避免成纤维细胞污染，可通过仔细解剖气管以及如步骤1.19所述的阴性筛选方法来避免。只要在初始72小时孵育后定期观察培养物，并每隔一天进行换液和更换培养基，培养物通常在空气-液体界面（ALI）培养开始后约两周内完成完全分化。
慢性阻塞性肺疾病（COPD）主要由长期吸烟引起，至今仍是全球重要的公共卫生问题4-7。COPD的特征是进行性气流受限、肺泡结构破坏（肺气肿）以及肺部对香烟烟雾产生过度的炎症反应4-7。大量研究采用肺泡、支气管和气道上皮细胞系统来模拟肺细胞对香烟烟雾（CS）的反应。其中许多研究使用原代上皮细胞或永生化细胞系（例如Beas-2b），参见参考文献8-11中的示例。气液界面（ALI）Transwell培养系统可使肺上皮细胞以更接近其在气道中生理排列的方式...
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致谢
感谢 Emeka Ifedigbo 提供的技术支持，以及 Shivraj Tyagi 博士提供的宝贵专业知识。同时感谢哈佛神经发现中心在显微镜技术方面的协助。本研究部分得到了美国心脏协会博士前资助 09PRE2250120（授予 Hilaire Lam）以及美国国立卫生研究院（NIH）资助 R01-HL60234、R01-HL55330 和 R01-HL079904（授予 A. M. K. Choi）的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 哈姆’s F12 培养基 1X | Cellgro | MT-10-080-CM | 含 L-谷氨酰胺 |
| 青霉素/链霉素 | Lonza Inc. | 17-602E | |
| 蛋白酶K | 罗氏集团 | 10165921001 | Streptomyces griseus |
| I 型胶原蛋白 | BD Biosciences | 354236 | 来自大鼠尾部 |
| 乙酸 | Sigma-Aldrich | 338826-25 | |
| DNaseI | Sigma-Aldrich | DN25-100MG | 来自牛胰腺 |
| 牛血清白蛋白 | Fisher Scientific | BP1605-100 | 第五组分 |
| 视黄酸 | 视黄酸 | R265-50MG | |
| Hank’s 平衡盐溶液 | GIBCO，Life Technologies 公司旗下品牌 | 14175 | 不含 Ca++ 或 Mg++ |
| DMEM-F12 | Cellgro | MT-15-090-CM | 不含 L-谷氨酰胺或 HEPES |
| HEPES，1 M H₂O 溶液2O | Sigma-Aldrich | 83264-100ML | |
| L-谷氨酰胺 | Sigma-Aldrich | G7513-100ML | 200 mM |
| 两性霉素B（Fungizone） | Fisher Scientific | 1672346 | |
| 胰岛素 | Sigma-Aldrich | 16634-50MG | 牛胰腺 |
| 去铁转铁蛋白（人） | Sigma-Aldrich | T1147-100MG | |
| 霍乱毒素 | Sigma-Aldrich | C8052 | 霍乱弧菌 |
| 表皮生长因子 | BD Biosciences | 354001 | 小鼠 |
| 牛垂体提取物 | BD Biosciences | 354123 | |
| NuSerum | BD Biosciences | 355100 | |
| Transwell | 康宁 | 3401 | 12 mm，0.4 mm 孔径 聚碳酸酯 |
| Primaria 100 mm 培养皿 | Falcon BD | 353803 | |
| Pallflex 膜 | Pall Corporation | EMFAB TX40H120-WW | |
| 吸烟机 | EMI 服务 | ATCSALI-1 | 参见脚注* |
*香烟吸烟机是定制设计和制造的14"x14"x20" 双室带水套透明浅色防碎玻璃1/2" 带有温度控制和水位传感器控制关断系统的厚聚碳酸酯Lexan香烟烟雾暴露室。配备可调节香烟抽吸频率的香烟抽吸装置。该装置在使用时模拟培养箱功能，系统内温度、湿度和二氧化碳浓度均受控。系统包括：(I) 定制双腔/水套单元，为组织培养实验提供受控环境；(II) 数字式重型高精度双泵水温循环系统，带水位传感器和温度控制；(III) 配备抽吸泵的香烟抽吸单元；(IV) 泵循环传感器控制速率调节器；(IV) 不锈钢高精度在线过滤器支架；(V) 可拆卸顶盖安装的11/2" 尺寸轴向均匀性香烟烟雾混合风扇。（VI）带有水循环器安装支架的中号水浴槽。（VII）1/2’ 带有支架的厚型聚甲基丙烯酸甲酯（Plexiglas）托盘，用于放置抽吸泵和香烟烟灰收集器支架。 该机器可替换为其他类似的市售吸烟机，例如TSE systems公司提供的型号www.tse-systems.com). |
参考文献
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