小鼠呼吸道上皮细胞的分离及在气液界面暴露于实验性香烟烟雾

摘要

肺上皮细胞可从小鼠呼吸道分离，并在气液界面培养，作为分化型呼吸道上皮的模型。本文描述了一种分离、培养这些细胞并将其暴露于主流香烟烟雾的实验方案，以研究细胞对这种环境毒素的分子响应。

摘要

肺上皮细胞可从小鼠呼吸道分离，并在气液界面（ALI）条件下培养，作为分化型呼吸道上皮的模型。本文描述了一种分离这些细胞并将其暴露于主流香烟烟雾（CS）的实验方案，以研究上皮细胞对香烟烟雾暴露的反应。该方案包括三个部分：从小鼠气管分离气道上皮细胞、将这些细胞在气液界面（ALI）培养为完全分化的上皮细胞，以及向培养中的细胞递送经校准的主流香烟烟雾。ALI培养系统使呼吸道上皮细胞的培养条件更接近其生理环境，优于常规液体培养系统。研究香烟烟雾暴露下分子和肺细胞的反应，对于理解环境空气污染对人类健康的影响至关重要。该领域的研究成果最终有助于阐明慢性阻塞性肺疾病（COPD）及其他烟草相关疾病的病因，这些疾病是全球主要的健康问题。

方案

整个实验方案需要2天时间从动物组织中分离细胞，5-10天进行细胞增殖，再额外需要10-14天在气液界面条件下诱导细胞分化。此外，还需要1天时间进行细胞暴露处理及样本采集。

1. 小鼠气管支气管上皮细胞（MTEC）的分离。

注意：以下所述所有操作步骤均已通过布莱根妇女医院/哈佛医学院机构动物护理与使用委员会的审查和批准。

开始之前：

• 配制含抗生素的 Ham's F12 培养基。向 250 mL Ham's F12 基础培养基（Cellgro）中加入 2.50 mL 的 100 倍浓缩青霉素/链霉素溶液（10² U/mL–10² mg/mL）和 250 μL 的 1000 倍浓缩两性霉素 B 溶液。4°C 保存，最长可保存 4 周。
• 配制 0.15% 溴化蛋白酶溶液。将 15 mg 溴化蛋白酶加入 10 mL 含抗生素的 Ham's F12 培养基中。现用现配，并置于冰上保存直至使用。
• 准备洁净的操作台面、适用于小型动物手术的无菌外科器械，以及用于细胞分离的层流通风细胞培养罩。其他所有设备均为动物细胞培养常规所需，包括加湿 CO₂ 培养箱、冷藏室、台式细胞离心机、倒置显微镜以及一次性塑料移液管和培养器皿。
• 配制 I 型胶....

讨论

从小鼠气管中分离上皮细胞的实验方案改编自You 等¹及其他研究者^2-3的方法，并进行了修改。与所有细胞分离方案一样，最关键的步骤是采用严格的无菌技术，避免细菌或真菌病原体污染。第二个关键步骤是避免成纤维细胞污染，可通过仔细解剖气管以及如步骤1.19所述的阴性筛选方法来避免。只要在初始72小时孵育后定期观察培养物，并每隔一天进行换液和更换培养基，培养物通常在空气-液体界面（ALI）培养开始后约两周内完成完全分化。

慢性阻塞性肺疾病（COPD）主要由长期吸烟引起，至今仍是全球重要的公共卫生问题^4-7。COPD的特征是进行性气流受限、肺泡结构破坏（肺气肿）以及肺部对香烟烟雾产生过度的炎症反应^4-7。大量研究采用肺泡、支气管和气道上皮细胞系统来模拟肺细胞对香烟烟雾（CS）的反应。其中许多研究使用原代上皮细胞或永生化细胞系（例如Beas-2b），参见参考文献^8-11中的示例。气液界面（ALI）Transwell培养系统可使肺上皮细胞以更接近其在气道中生理排列的方式.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
哈姆’s F12 培养基 1X	Cellgro	MT-10-080-CM	含 L-谷氨酰胺
青霉素/链霉素	Lonza Inc.	17-602E
蛋白酶K	罗氏集团	10165921001	Streptomyces griseus
I 型胶原蛋白	BD Biosciences	354236	来自大鼠尾部
乙酸	Sigma-Aldrich	338826-25
DNaseI	Sigma-Aldrich	DN25-100MG	来自牛胰腺
牛血清白蛋白	Fisher Scientific	BP1605-100	第五组分
视黄酸	视黄酸	R265-50MG
Hank’s 平衡盐溶液	GIBCO，Life Technologies 公司旗下品牌	14175	不含 Ca++ 或 Mg++
DMEM-F12	Cellgro	MT-15-090-CM	不含 L-谷氨酰胺或 HEPES
HEPES，1 M H₂O 溶液2O	Sigma-Aldrich	83264-100ML
L-谷氨酰胺	Sigma-Aldrich	G7513-100ML	200 mM
两性霉素B（Fungizone）	Fisher Scientific	1672346
胰岛素	Sigma-Aldrich	16634-50MG	牛胰腺
去铁转铁蛋白（人）	Sigma-Aldrich	T1147-100MG
霍乱毒素	Sigma-Aldrich	C8052	霍乱弧菌
表皮生长因子	BD Biosciences	354001	小鼠
牛垂体提取物	BD Biosciences	354123
NuSerum	BD Biosciences	355100
Transwell	康宁	3401	12 mm，0.4 mm 孔径 聚碳酸酯
Primaria 100 mm 培养皿	Falcon BD	353803
Pallflex 膜	Pall Corporation	EMFAB TX40H120-WW
吸烟机	EMI 服务	ATCSALI-1	参见脚注*
*香烟吸烟机是定制设计和制造的14"x14"x20" 双室带水套透明浅色防碎玻璃1/2" 带有温度控制和水位传感器控制关断系统的厚聚碳酸酯Lexan香烟烟雾暴露室。配备可调节香烟抽吸频率的香烟抽吸装置。该装置在使用时模拟培养箱功能，系统内温度、湿度和二氧化碳浓度均受控。系统包括：(I) 定制双腔/水套单元，为组织培养实验提供受控环境；(II) 数字式重型高精度双泵水温循环系统，带水位传感器和温度控制；(III) 配备抽吸泵的香烟抽吸单元；(IV) 泵循环传感器控制速率调节器；(IV) 不锈钢高精度在线过滤器支架；(V) 可拆卸顶盖安装的11/2" 尺寸轴向均匀性香烟烟雾混合风扇。（VI）带有水循环器安装支架的中号水浴槽。（VII）1/2’ 带有支架的厚型聚甲基丙烯酸甲酯（Plexiglas）托盘，用于放置抽吸泵和香烟烟灰收集器支架。 该机器可替换为其他类似的市售吸烟机，例如TSE systems公司提供的型号www.tse-systems.com).