Arabidopsis thaliana 极性甘油酯谱型分析：薄层色谱法（TLC）联合气液色谱法（GLC）

摘要

通过一种简单且可靠的脂质谱分析实验，测定极性脂质提取物的组成以及单个甘油酯的脂肪酸组成。为此，采用薄层色谱法分离甘油酯，并对其酰基进行甲酯化反应。脂肪酰基甲酯通过气液色谱法进行定量分析。

摘要

生物膜将细胞与外界环境分隔开来。从单细胞生物到多细胞的植物和动物，甘油酯类（如磷脂酰胆碱或磷脂酰乙醇胺）构成了双层膜结构，既作为细胞的边界，也作为细胞与其周围环境之间化学物质交换的界面。与动物不同，植物细胞具有一种专门用于光合作用的特殊细胞器——叶绿体。叶绿体复杂的膜系统中含有独特的不含磷的甘油酯类，即糖脂：单半乳糖基二酰基甘油（MGDG）、二半乳糖基二酰基甘油（DGDG）和磺基醌糖基二酰基甘油（SQDG）⁴。这些脂质的功能远不止结构性作用。研究发现，这些糖脂及其他甘油酯类存在于光系统I和II的晶体结构中，表明甘油酯类参与了光合作用过程^8,11。在磷酸盐缺乏条件下，DGDG会被转运至叶绿体外的膜系统中，以补偿磷脂的缺失^9,12。

我们对这些脂质的生物合成及其功能的许多认识，主要来源于对Arabidopsis thaliana¹⁴进行的遗传学与生物化学研究的结合。在这些研究过程中，一种用于极性脂质分析的简便方法对于脂质突变体的筛选与分析至关重要，本文将对此方法进行详细阐述。首先通过薄层色谱法（TLC）分离叶片脂质提取物，然后用碘蒸气可逆地染色甘油酯类。将各个脂质条带从TLC板上刮下，并转化为脂肪酸甲酯（FAMEs），再通过气相色谱-火焰离子化检测（FID-GLC）进行分析（图1）。该方法已被证实是突变体筛选的可靠工具。例如，内质网到质体脂质转运突变体tgd1,2,3,4的发现，正是基于其膜脂中异常积累的半乳糖基甘油酯——三半乳糖基二酰基甘油（TGDG），以及18:3（碳原子数:双键数）脂肪酰基组分相对含量的减少^3,13,18,20。该方法也可用于以脂质为底物的蛋白质酶活性测定⁶。

方案

1. 脂质提取

1. 开始脂质提取，收获30 mg 4周龄的材料 拟南芥 从琼脂固化培养基或土壤中生长的植物上采集叶片，并转移至1.5 mL聚丙烯离心管中。新鲜叶片可迅速在液氮中速冻，并储存于-80 °C。80 °C.
2. 添加 300 μL 加入由甲醇、氯仿和甲酸按体积比20:10:1（v/v/v）组成的提取溶剂至各样品中。剧烈振荡（使用油漆振荡器或类似设备）5分钟。
3. 添加 150 μL 0.2 M 磷酸（H₃PO₄）₃PO₄），1 M 氯化钾（KCl），短暂涡旋。
4. 在室温下以13,000×g离心1分钟。溶解于下层氯仿相中的脂质将点样至薄层层析板上。

2. 薄层色谱法（TLC）¹⁵

1. 制备薄层色谱板时，将一块20 cm×20 cm涂有硅胶并带加样条的薄层色谱板浸入0.15 M硫酸铵((NH₄)₂SO₄)溶液中30秒₄)₂SO₄）溶液中浸泡30秒后，将板置于带盖容器中干燥至少2天。在活化过程中，氯化铵升华后留下硫酸，后者使磷脂酰甘油质子化，从而使其能够与其他甘油酯分离。
2. 实验当天，将TLC板置于烘箱中烘烤以活化 120 °C 2.5 小时。
3. 将活化后的薄层板冷却至室温后，用铅笔在色谱起点处距板边缘1.5 cm的位置画一条横越薄层板的直线。
4. 在通风橱中，缓慢加入3 X 20 μL 使用下层氯仿相中的脂质提取物 20 μL 移液器 200 μL 在 N 的缓流下，黄色塑料尖端₂为此，将一段Tygon软管连接至N的调节器₂ 烧杯。斑点直径应小于1 cm。每块板最多可容纳10个样品（若计划后续进行气相色谱分析）。
5. 当脂质斑点在通风橱中完全干燥后，配制由丙酮、甲苯和水（91 mL : 30 mL : 7.5 mL）组成的展开溶剂。若环境相对湿度较高，可能会影响分离效果；此时应减少水量至（91 mL : 30 mL : 7.0 mL），以获得理想的分离结果。
6. 将80 mL展开剂倒入可密封的薄层色谱展开槽（长:高:宽=27.0:26.5:7.0，cm/cm/cm）中，将薄层板样品端朝下放入展开槽内。用夹子密封展开槽。溶剂将沿薄层板上升，脂质成分随之分离。在室温下展开时间约为50分钟。
7. 当溶剂前沿到达板顶部1 cm处时，小心地将板从展开槽中取出，并在通风橱中完全干燥约10分钟。
8. 薄层色谱分离的脂质可短暂地用碘进行可逆染色以用于定量分析，或用硫酸或α-萘酚进行不可逆染色。
   1. 硫酸炭化法：在通风橱中，使用玻璃喷雾瓶将水中的50%硫酸溶液喷洒在薄层色谱板上，随后置于烘箱中加热 120 °C 15 分钟（图 2A）。
   2. 用于糖脂的α-萘酚染色：将含有2.4%（w/v）α-萘酚、10%（v/v）硫酸和80%（v/v）乙醇的溶液喷洒在薄层板上，随后加热烘烤 120 °C 3-5分钟，直至糖脂条带染成粉红色或紫色（图2B）。由于试剂中含有硫酸，处理时间过长会导致所有脂质炭化。
   3. 碘染色：在通风橱中，将薄层色谱板放入密闭的TLC展开槽内，槽底放置盛有碘晶体的托盘，使槽内空气被碘蒸气饱和，直至脂质条带可见（图2C）。注意不要使板暴露于碘蒸气中过久，因为碘可能共价修饰多不饱和脂肪酸。作为替代方案，为避免脂质发生任何氧化，仅对在样品泳道之间间隔设置的标准泳道进行染色，可使用玻璃 wool 塞住的巴斯德移液管，管内装有碘晶体，并通入N₂₂ 吹过各个标准泳道。

3. 脂肪酰基甲酯（FAME）反应¹⁶

1. 用剃刀刮除薄层色谱板上已识别脂质斑点周围的硅胶，刮取含有脂质的硅胶，并通过漏斗将硅胶粉末转移至带有聚四氟乙烯（PTFE）衬垫螺旋盖的玻璃管中。
2. 使用玻璃移液管向每个样品中加入1 mL 1 N盐酸（HCl）的无水甲醇溶液。
3. 添加 100 μL 50 μg mL^-1 十五烷酸（15:0）的使用 200 μL 使用移液器向每个样品中加入内标 200 μL 移液器 200 μL 黄色塑料吸头。保留一支仅含十五碳烯酸甲醇盐酸溶液的试管作为对照。用带聚四氟乙烯衬垫的盖子 tightly 封紧玻璃管。
4. 将玻璃管置于培养箱中孵育 80 °C 水浴 25 分钟。试管需密封，以防止溶剂蒸发。
5. 待试管冷却后，加入1 mL 0.9%氯化钠溶液，随后加入1 mL 己烷，充分涡旋振荡。以1000×g离心3分钟。
6. 在通风橱中，使用巴斯德移液管移除样品的己烷/上层液体，并转移至一支新的13x100 mm玻璃试管中。
7. 在缓慢的氮气流下蒸发正己烷₂ 不要完全干燥。
8. 溶解所得的脂肪酸甲酯 60 μL 正己烷。将样品转移至自动进样瓶中，盖紧瓶盖。样品可于 4 °C 短期和-20 °C 几天。

4. 气液色谱法（GLC）¹⁰

1. 开始气相色谱分析前，确保氦气、氢气和空气钢瓶已充满。
2. 需向溶剂储液罐中加入足量的正己烷，并确保废液容器为空。进行脂肪酰基甲酯分离时，将DB-23色谱柱连接至仪器。
3. 将样品瓶放入自动进样器中。在系统计算机上启动用于气相色谱分析的Chemstation软件。
4. 设定进样口温度为250 °C，氦气流速为48.6 mL min^-1，压力为21.93 psi，分流比为30.0:1。
5. 程序升温设置如下：初始温度140 °C，保持2分钟；以25 °C min^-1的速率升至160 °C；再以8 °C min^-1的速率从160 °C升至250 °C，于250 °C保持4分钟；最后以38 °C min^-1的速率降温至140 °C。单次运行时间约为21分钟。
6. 火焰离子化检测器温度设为270 °C，氢气流速为30.0 mL min^-1，空气流速为400 mL min^-1，氦气流速为30.0 mL min^-1。
7. 在运行序列表格中输入样品瓶数量及样品名称。将10 μL进样器设置为每瓶注入2 μL样品。
8. 当仪器准备就绪后，启动运行序列。

5. 代表性结果：

4周龄样本经薄层色谱分离后脂质的不可逆染色示例 拟南芥 幼苗如图2所示。经硫酸染色的脂质（图2A）发生炭化，呈现为棕色斑点。α-萘酚更适用于染色甘油糖脂，如单半乳糖基二酰基甘油（MGDG）、二半乳糖基二酰基甘油（DGDG）、磺基喹诺糖基二酰基甘油（SQDG）等。用α-萘酚染色后，糖脂呈现粉紫色，而其他极性脂质则染成黄色（图2B）。碘染色是可逆的，使脂质呈现淡黄色，随着碘的挥发，颜色会在短时间内消失（图2C）。简而言之，碘染色的脂质可直接用于气相色谱分析，但未染色的脂质更适宜，以减少脂质降解。

如果操作成功，在气相色谱（GLC）分析后将观察到代表不同脂肪酰甲酯的明显信号（图3）。使用DB-23色谱柱时，碳链较短且双键数目较少的脂肪酰甲酯具有更短的保留时间。脂肪酰甲酯谱分析是一种用于鉴定脂质组成发生改变的突变体的灵敏工具。在图4中，与野生型相比，tgd4-1突变体的MGDG18:3脂肪酸摩尔比有所降低¹⁸。通过将某一脂类组分的脂肪酰甲酯摩尔数除以所有脂类组分的总摩尔数，可计算出每种脂类的摩尔比。例如，计算MGDG摩尔比的方法如下：

(MGDG) 摩尔百分比 = ∑ [FAMEs_(MGDG)] / ∑ [FAMEs_(total)] ×100%

可以比较野生型和突变体中每种脂质类别的摩尔比。例如， tgd4-1 突变体中MGDG和PG的相对含量增加，而DGDG和PE的含量减少（图5）¹⁸.

图1. 使用流式图分析极性脂质 拟南芥 幼苗。从4周龄的植株中提取总脂质 拟南芥 幼苗经薄层色谱（TLC）分离脂质。分离后的脂质可从TLC板上刮下，进行转酯化反应，随后通过气相色谱（GLC）分析。

图 2. 脂质在薄层色谱板上的分离。取35 mg（鲜重）野生型幼苗的脂质提取物，通过薄层色谱法分离，并分别用硫酸（A）、α-萘酚（B）或碘蒸气（C）染色。每种染色方法均显示三次重复结果。DGDG，二半乳糖基二酰基甘油；MGDG，单半乳糖基二酰基甘油；PC，磷脂酰胆碱；PE，磷脂酰乙醇胺；PG，磷脂酰甘油；PI，磷脂酰肌醇；SQDG，磺基醌糖基二酰基甘油。

图3. 野生型MGDG来源的脂肪酸甲酯（FAMEs）的气相色谱分析。FAMEs在30 m毛细管柱上分离，并通过火焰离子化检测。十五烷酸（15:0）用作内标物。

图 4. 野生型 Col2（白色柱）和 tgd4-1 突变体（黑色柱）中 MGDG 的脂肪酸谱。脂肪酸以碳原子数后跟双键数表示。数据为三次重复实验的平均值，误差线表示标准偏差。

图5. 野生型Col2（白色柱）与tgd4-1突变体（黑色柱）的极性脂质组成。数据为三次重复实验的平均值，误差线表示标准偏差。

讨论

薄层色谱与气相色谱联用为植物中极性脂质的定量分析提供了一种稳健且快速的工具。该方法能够识别脂质组成中的微小变化，因此已被用于大规模筛选极性脂质代谢途径受损的突变体^1,20。此外，该方法也广泛用于监测以极性脂质为底物的酶活性^2,6,7。

除了叶片外，其他植物组织（如根和种子）或亚细胞组分（如叶绿体和线粒体）的脂质组成也可采用相同方法进行测定。

此处使用的溶剂系统（丙酮、甲苯、水）已针对植物中糖脂和磷脂的分离进行了优化。然而，在tgd1,2,3,4突变体和分离的叶绿体中，TGDG与磷脂酰乙醇胺（PE）共迁移，而四半乳糖基二酰基甘油则与磷脂酰胆碱（PC）共迁移。在这种情况下，需使用氯仿、甲醇、乙酸和水（85:20:10:4，v/v/v/v）的溶剂系统¹³。有时还会采用二维薄层色谱法（TLC），结合两种不同的溶剂系统，以进一步分离糖脂和磷脂¹⁹。此外，植物组织可直接进行FAME反应，随后通过气相色谱法（GLC）分析，以确定总脂肪酸谱型，而无需在TLC上进行初始分离⁵。除了本实验展示的TLC-GLC系统外，另一种用于脂质谱型分析的方法是基于直接电喷雾电离串联质谱法¹⁷。该方法省略了提取物中脂质的初始色谱分离步骤。然而，该方法需要昂贵的仪器设备和经验丰富的操作人员，因此在实验室常规分析或突变体筛选中应用受限。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
α-萘酚	Sigma-Aldrich	N1000
3N 甲醇盐酸	Sigma-Aldrich	33050-U	用甲醇稀释至 1N
Si250-PA 薄层层析板	JT Baker	7003-04	带预吸附层
薄层层析槽	Sigma-Aldrich	Z266000
带螺帽试管	VWR international	53283-800
螺帽	Sun Sri	13-425
聚四氟乙烯圆盘	Sun Sri	200 608
气相色谱系统	Hewlett-Packard	HP6890
DB-23 色谱柱	J&W Scientific	122-2332
气相色谱样品瓶	Sun Sri	500 132
气相色谱样品瓶瓶盖	Sun Sri	201 828
化学工作站软件	Agilent Technologies	G2070AA