使用悬挂重物系统实现小鼠冠状动脉闭塞

摘要

一种用于研究心肌缺血及缺血预处理的心脏保护机制的小鼠模型是一项重要工具 体内. 本文报道了一种易于应用的 原位 利用悬挂式砝码系统实现冠状动脉闭塞的心脏缺血后处理模型

摘要

急性损伤的鼠类研究是一个备受关注的研究领域，因为针对不同基因的敲除小鼠正变得越来越可获得^1-38。缺血预处理（IP）对心脏的保护作用仍然是一个研究热点。为了进一步阐明其分子机制，敲除小鼠的研究尤为重要^{7, 14, 30, 39}。尽管已有研究成功在小鼠中实施了心肌缺血与再灌注模型，但该模型在技术上极具挑战性。特别是冠状动脉的视觉识别、在血管周围放置缝线并通过打结阻断血流，这些操作在技术上难度较高。此外，在缺血预处理过程中，为实现冠状动脉的间歇性再灌注而重新打开结扎线，同时避免造成手术创伤，进一步增加了操作难度。而且，如果结扎不够牢固，可能因冠状动脉闭塞不完全而导致意外再灌注，从而影响实验结果。事实上，由于心脏持续跳动，这种情况很容易发生。

基于使用打结冠状动脉阻断系统可能存在的问题，我们采用了一种先前发表的慢性心肌病模型，该模型基于在缺血预处理（IP）期间通过悬挂重物系统实现间歇性冠状动脉阻断³⁹。实际上，通过该方法可在无需以打结方式阻断冠状动脉的情况下实现冠状动脉闭塞。此外，由于悬挂重物位于远离心脏组织的部位，通过移除重物即可轻松实现血管再灌注。

我们对该系统进行了系统性测试，包括缺血与再灌注时间、预处理方案、体温以及遗传背景的多种变化³⁹。除了梗死染色外，我们还检测了心肌肌钙蛋白 I（cTnI）作为该模型中心肌梗死的标志物。事实上，cTnI 的血浆水平与梗死面积呈良好相关性（R²=0.8）。最后，我们在多项研究中证实，该技术在小鼠缺血后处理（IP）及心肌梗死模型中可获得高度可重复的梗死面积^{6, 8, 30, 40, 41}。因此，该技术可能有助于研究人员利用基因敲除小鼠通过遗传学方法探究 IP 介导的心肌保护相关分子机制。后续在转基因小鼠中开展的心脏缺血后处理研究也可考虑采用该技术。

方案

一般注意事项：

所有操作均应在直立式解剖显微镜（Olympus，SZX10 配备 Z 轴手摇臂和 STU2 支架臂）下进行，并使用外科凝固器。通气对该手术至关重要，因此应投入一定时间选择合适的呼吸机并优化通气技术。术中应保持体温、血压和麻醉状态稳定。

1. 麻醉、插管与监测

1. 使用至少10周龄的C57BL/6小鼠。以70 mg/kg体重剂量的戊巴比妥钠经腹腔注射诱导麻醉，维持麻醉时使用约10 mg/kg/h的戊巴比妥钠。需谨慎避免过量，因为这可能显著降低血压。即使在数小时后追加戊巴比妥钠，也可能导致血浆浓度严重升高。基于大量证据表明异氟烷具有心脏保护作用，我们建议在心肌缺血模型中使用“惰性”且已被广泛验证的戊巴比妥钠^46-56。
2. 将小鼠置于温控加热台（RT, Effenberg, Munich, Germany）上，并连接直肠温度探头至热反馈控制器，以维持体温在37°C。
3. 麻醉诱导后，将小鼠固定于仰卧位，用胶带和缝线将四肢固定在手术台上，头部则通过牙齿固定。充分的固定对于成功插管和精确控制手术过程至关重要。术前用矿物油覆盖小鼠体表，以降低小鼠毛发过敏的风险。
4. 外科暴露气管，并使用钝头聚乙烯导管（Insyte 22g, Beckton Dickinson, USA）进行气管插管。需将针头磨钝，以便作为导丝使用。
5. 使用镊子将舌头拉出，然后以15度角轻轻向身体方向推进。即使已暴露气管并在显微镜下操作，此步骤仍可能需要一定训练。注意避免气管轻微损伤，否则可能导致整个缝合过程中无法通气。因此，若出现气道问题，应检查气管是否有微小穿孔。
6. 通过直接观察导管是否位于气管隆突上方的暴露气管内，确认导管位置正确。
7. 将导管连接至呼吸机。我们推荐使用Siemens（DRE Veterinary, USA）的Servo 900 C呼吸机进行压力控制通气。通气参数设置为：吸气峰压10 mbar，呼吸频率110次/分钟，呼气末正压3–5 mbar，吸入氧浓度FiO₂ = 0.4。参数可能需要微调，最简便的方法是在开胸手术过程中观察肺部状态，确保肺部既不塌陷也不过度膨胀。尽管Servo 900 C是为人类设计的呼吸机，但在压力控制模式下对小鼠通气效果极佳。
8. 在通气4至6小时后，使用i-STAT系统（Abbott, USA）进行血气分析，以确认气体交换正常（氧分压paO₂为115±15 mmHg，二氧化碳分压paCO₂为38±6 mmHg）。
9. 使用心电图仪（例如Hewlett Packard, Böblingen, Germany）监测心率，确保心率不低于450次/分钟。若小鼠出现心动过缓，应检查体温及麻醉剂量/浓度。赛拉嗪/氯胺酮麻醉会导致心率降至250次/分钟，因此不推荐使用。
10. 实施适当的液体替代治疗。在缺血开始前，应通过动脉或静脉导管以0.1 ml/小时的速度输注生理盐水。此外，术前可经腹腔给予500 μl生理盐水推注。开胸术可能导致血压下降，可能需要额外的生理盐水推注。缺血后，输液速度可能需增至1 ml/小时，以维持平均动脉压高于60 mmHg，并确保充分再灌注，这对TTC染色评估梗死面积至关重要。
11. 置入颈动脉导管（PE10, Tip O.D. (mm/"), Tapered>.024 mm/.011"）以持续记录血压。通过钝性分离气管旁肌肉暴露颈动脉。进一步暴露时应小心避免组织损伤（特别是迷走神经）。使用两根缝线和一个小夹子将导管插入血管。在开始分离动脉前，先将前肢固定于身体一侧，以暴露更长段的动脉。结扎颈动脉近端末端，并在缝线末端固定一个较大的夹子以施加张力。在动脉上再绕一根缝线，向远端充分游离动脉，在远端放置一个小夹子。使用显微剪刀在动脉上剪出一个小的斜切口。用精细镊子（Dumont, WPI）固定切口，用手或镊子推进合适尺寸的导管。用第二根缝线打结固定动脉。松开夹子，继续推进导管。通过多个结扎和胶带固定导管。

2. 冠状动脉阻断技术

1. 使用钝性解剖技术分离皮肤，暴露左侧胸壁。
2. 使用电灼器切开胸大肌和胸小肌以暴露胸壁。牵拉胸大肌可使肺下垂，从而可插入电外科设备的镊子，并在距肺上方1-3 mm处沿肋骨做一水平凝固线。
3. 使用钝头剪刀剪开胸壁。随后使用经改装的安全别针（去除卡扣板，将钝端弯曲）以保持胸腔开放。
4. 为便于最终缝线的放置，沿膈肌向胸腔左下侧方向凝固并切开胸壁。
5. 解剖心包以暴露心脏。为避免膈肌运动，需切除并切断膈神经。
6. 用镊子夹取一小块湿润的棉签，将心脏向右侧翻转。辨认左冠状动脉（LCA），并确保肺部不过度膨胀。优化胸腔开口，以便在放置缝线时能稳固地固定心脏。若血压过低，可能影响LCA的识别；额外推注生理盐水可能有助于LCA的辨认。LCA是一条呈鲜红色、横向跨越心脏的血管（与回流静脉不同）。有时在无显微镜的情况下更易观察到LCA。避免使用过强的光源，否则会产生严重反光，导致无法观察。
7. 一旦肉眼确认LCA，用8.0尼龙缝线（Prolene, Ethicon, Notiefies, USA）环绕LCA。为实现间歇性LCA闭塞，我们采用一种基于悬挂重物系统的慢性心肌病模型⁴²。
8. 将缝线穿过一段带有钝边的小型塑料管（PE-10管），并在两端各连接一个小型重物（1 g，例如装有水的Eppendorf离心管）。当重物自由悬挂在横杆上时，LCA应立即闭塞；当重物被移除时，LCA闭塞也立即解除。成功的LCA闭塞可通过血管颜色由浅红色迅速变为深紫色、由该血管供血的心肌由鲜红色变为白色，以及心电图出现ST段抬高来确认。再灌注期间，上述颜色变化迅速消失。整个过程中需持续用37°C生理盐水浸湿的棉球保持心脏湿润（见图1）。
9. 根据研究目的选择合适的缺血时间。实际上，若研究缺血预处理（IP）的心脏保护作用，理想情况是采用导致梗死面积约为AAR的30%至40%的缺血时间，以便能够观察到双向变化，例如心脏IP导致梗死面积减小，或某种实验性治疗或特定基因敲除导致梗死面积增大。此外，梗死面积小于50%的小鼠通常可存活至实验结束，而梗死面积达60%至80%者常在再灌注完成前死亡。在我们的模型中，10分钟心肌缺血后接2小时再灌注，导致梗死面积为AAR的3.5 ± 1.3%；相比之下，60分钟缺血导致平均梗死面积为AAR的42 ± 5.2%（p<0.01）³⁹。因此，我们认为60分钟缺血是研究双向变化的理想条件。然而，对于表型严重的基因靶向小鼠，可能需要调整缺血时间。
10. 选择合适的再灌注时间。再灌注时间对TTC染色至关重要。无色染料在辅酶NADH存在下，被脱氢酶还原为砖红色沉淀。濒死细胞失去保留NADH的能力，因此在红色染色的存活心肌中呈现为浅色区域。TTC染色显示梗死区域的前提是坏死区内的NADH已完全洗脱。然而，若再灌注时间不足，TTC染色可能导致对实际梗死面积的低估⁴³。在我们的实验中，缺血60分钟后，再灌注30分钟时测得梗死面积为11.5 ± 4.5%，而再灌注120分钟后增至42.2 ± 5.1%。进一步延长再灌注时间（至240分钟）未见梗死面积进一步增加³⁹。因此，我们推荐2小时再灌注期，该时长也适用于心肌酶测定。若研究缺血预处理，我们建议采用4个循环的IP（5分钟缺血，5分钟再灌注），随后进行60分钟缺血和2小时再灌注。在此条件下，IP可使梗死面积由AAR的42.2 ± 5.1%减少至13.3 ± 3.3%，降低达3.2倍³⁹。然而，由于采用悬挂重物系统，可方便地实施不同的预处理方案。

3. 风险区域（AAR）和心肌梗死面积的测定

心肌梗死（无论是否进行缺血预处理）诱导后，左冠状动脉（LCA）所灌注的区域即为风险区域（AAR），梗死范围本身将通过染色技术进行测定。随后，以风险区域为参照，计算心肌梗死面积所占的百分比。为此，采用先前描述的伊文思蓝与氯化三苯基四氮唑（TTC）双染色技术⁴⁴。

1. 通过主动脉逆行注射1%伊文思蓝染料，同时结扎左冠状动脉（LCA），以确定风险区域面积（AAR）。或者，如果已置入颈动脉导管，可通过此通路注射伊文思蓝。伊文思蓝将使所有心肌组织染成蓝色，唯独AAR区域不被染色。此步骤中必须避免导管内存在气泡，因为气泡会进入冠状动脉循环，阻碍伊文思蓝的染色效果。在进行伊文思蓝染色前，可采集血液用于心肌酶学检测。此外，建议通过主动脉或颈动脉导管注入5 ml生理盐水，以清除部分血液。
2. 取出心脏，并用冰冻的0.9%生理盐水冲洗
3. 将心脏包埋于2%琼脂糖中。切勿使用高温琼脂糖，因其会影响染色效果。
4. 在+4°C下放置30分钟（或在-20°C下放置15分钟）后，使用心脏切片模具或切片机将心脏切成1 mm厚的切片。若将心脏放入冷冻器，应避免干燥冷冻，否则会导致切片无法染色。
5. 将切片置于37°C水浴中，用15 ml蓝色瓶盖离心管孵育10分钟，加入1%氯化三苯基四氮唑（TTC）。坏死区域将呈现白色，而存活的心肌组织则染成红色。
6. 用10%甲醛固定染色后的切片过夜。此步骤可增强梗死区域的对比度，提高图像质量。
7. 使用NIH图像软件Image 1.0⁴⁵，通过平面测量法确定风险区域面积（AAR）和梗死面积。
8. 计算梗死心肌占风险区域面积的百分比。

4. 心脏酶测定

由于TTC染色存在局限性，我们建议将小鼠血清中心肌肌钙蛋白I（cTnI）水平的测定作为评估心肌梗死严重程度的补充指标。血液将从门静脉采集，随后使用定量快速cTnI检测试剂盒（Life Diagnostics, Inc., West Chester, PA, USA）测定血清中cTnI的水平。

5. 代表性结果：

图1. （A）使用悬挂式砝码系统进行冠状动脉闭塞的心脏缺血预处理模型。该技术无需打结即可实现冠状动脉闭塞。（B, C）手术装置示意图。（D）左冠状动脉（LCA，箭头所示）结扎后的小鼠心脏图像。在小鼠中进行结扎和缺血预处理时，必须通过视觉识别LCA。将一根8.0尼龙缝线置于左心耳下方1-2 mm处的LCA周围，缝线穿过一段小型塑料管（*），每根缝线末端连接一个小型砝码（1 g），并将缝线搭在两侧的横杆上。（E）左冠状动脉闭塞后，通过主动脉逆行注射伊文思蓝染料确定风险区（AAR）。风险区未被染色，而其余心肌组织呈蓝色。将AAR组织经TTC孵育后，梗死区域呈白色，存活心肌组织呈红色。

讨论

本研究描述了一种在完整的小鼠模型中使用悬挂重物系统进行缺血后处理（IP）的新技术，从而避免了通过打结阻断冠状动脉的方法。事实上，本研究表明该方法可实现高度可重复的心肌梗死范围及缺血后处理带来的心脏保护作用，显著降低了传统打结法冠状动脉阻断模型所伴随的变异性。考虑在小鼠中研究缺血后处理心脏保护作用的研究人员可从该模型中获益。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
戊巴比妥钠（Fatal Plus）	Vortech Pharmaceutical Ls, Ltd	V.P.L. 9372	4mg/mL 生理盐水溶液
氯化三苯基四氮唑（TTC）	Sigma-Aldrich	17779 Fluka	1.5 % PBS 溶液
伊文思蓝（Evans Blue）	Sigma-Aldrich	E2129	10g 溶于 1 L PBS
Insyte 22 G	BD Biosciences	n/a
丝线缝合线，4.0 规格	Harvard Apparatus	517698
普罗林缝合线，8.0 规格	Ethicon Inc.	M8739	可重复使用
心脏固定模具（Heart Matrix）	Zivic Instruments	# HSMS001
Siemens 900 C	DRE Veterinary	# 336	翻新设备
体视显微镜（SZX10）	Olympus Corporation	n/a	建议选择工作距离较大的型号
加热台	Rt, Effenberger, Germany	n/a	唯一供应商
血压监测设备	Cyber Sense, Inc	BPM02
I STAT	Abbott Laboratories	n/a