耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的皮下感染

摘要

小鼠皮肤和软组织感染模型用于评估耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的毒力功能及宿主免疫应答。本文介绍了一种用于皮肤和软组织感染的皮下感染模型。

摘要

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）对全球公共卫生构成严重威胁，目前在美国，MRSA引起的皮肤和软组织感染已占所有软组织感染病例的一半以上。在各类软组织感染中，肌炎、化脓性肌炎和坏死性筋膜炎与社区来源的MRSA感染相关的报道日益增多。为了深入理解MRSA与宿主免疫系统之间的相互作用如何导致更严重的感染，建立动物模型至关重要，这有助于研究宿主和细菌两方面的因素。已有多种感染模型被用于评估金黄色葡萄球菌（S. aureus）在浅表皮肤感染过程中的致病机制。本文中，我们描述了一种皮下感染模型，可用于观察皮肤、皮下组织及肌肉的病理变化。

方案

1. 准备耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（感染前两天）

1. 从保存的菌种中挑取一环耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA），接种至血琼脂平板（胰蛋白酶大豆琼脂平板，TSA）上。
2. 观察血琼脂平板上的溶血表型（菌落周围出现透明溶血环）。
3. 挑选一个溶血表型与其他实验结果一致的菌落。
4. 将该菌落接种至含有3 mL Todd Hewitt肉汤（THB）的15 mL带螺旋盖的试管中，必要时加入相应的抗生素。
5. 在37°C、220 rpm振荡条件下培养过夜。

2. 感染前小鼠的准备（感染前一天）

1. 根据小鼠体型大小，剃除小鼠背部约 3 × 4 cm 面积的毛发。
2. 在剃毛区域涂抹约 5 mm³ 的脱毛膏（购自当地药店）。
3. 使脱毛膏在皮肤表面作用约 1 分钟。
4. 用去离子水（ddH₂O）浸湿纸巾。
5. 用湿润的纸巾擦去脱毛膏。

3. 准备耐甲氧西林金黄色葡萄球菌用于感染（感染当天）

1. 用10 mL预热的THB培养基，在50 mL带螺帽的离心管中将过夜培养的细菌培养物按1:500至1:1000的比例稀释。
2. 在37°C、220 rpm振荡条件下孵育约2.5小时，直至A₅₄₀达到2.5。
3. 在4°C下以3,225 × g离心10分钟，收集耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）。
4. 弃去上清液。
5. 用10 mL杜尔贝科磷酸盐缓冲液（DPBS）重悬细菌沉淀。
6. 重复步骤3和4。
7. 用DPBS将细菌沉淀重悬至所需浓度。
8. 将细菌悬液进行10倍系列稀释，从10¹稀释至10⁸。
9. 将稀释后的细菌悬液接种到血琼脂平板上。
10. 将平板在37°C下过夜孵育。
11. 观察并记录接种物的溶血表型。
12. 计数平板上的菌落形成单位（CFU）数量。
13. 根据平板上的CFU数量计算接种物浓度。

4. 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的皮下感染（感染当天及感染后第3天）

1. 在 shaved 区域皮下注射 100 μL 细菌悬液。
2. 注射后观察动物 3 至 5 小时，以确保小鼠存活。
3. 每天观察动物背部的病灶，并在需要时每天记录病灶面积。病灶观察应包括记录病灶大小和形态。皮肤和肌肉病灶均通过测量病灶的长度与宽度相乘进行定量。不规则形状的病灶需分解为若干较小的对称部分，各部分均采用相同方法测量。病灶测量也可使用计算机辅助组织形态学评估软件（ImageJ；可从美国国立卫生研究院 NIH 网站 http://rsb.info.nih.gov/ij/ 免费获取）²。
4. 感染后第 3 天，通过吸入异氟烷麻醉后行颈椎脱位法处死动物。
5. 观察并记录皮肤上的病灶。
6. 用无菌剪刀在皮肤上做切口。
7. 小心剥离皮肤，观察并记录肌肉上的病灶。
8. 切除病灶及周围约 2–5 mm 的组织。
9. 采集脾脏和肾脏。
10. 使用组织匀浆器，或将 1 mL 注射器的推杆反复压入含有组织和 100 μL DPBS 的微量离心管中，对组织进行匀浆处理。
11. 向每根试管中加入 900 μL DPBS。
12. 将样品涡旋振荡 5 分钟。
13. 用 DPBS 将悬液进行连续 10¹ 至 10⁶ 倍梯度稀释。
14. 将稀释后的悬液接种于 THA 平板上。

5. 代表性结果：

1. 每次皮下注射后，若感染操作正确，可在皮肤表面观察到隆起的水疱（图1A）。如果皮肤表面未观察到水疱，则注射可能过深，这可能会影响感染结果（病灶大小、菌落形成单位数，CFU）。
2. 每次实验均需对细菌悬液进行系列稀释，并在血琼脂平板上检测菌落形成单位数（CFU）。此步骤可提供重要信息：1）接种菌是否具有均一的表型；2）用于感染的活菌确切数量。
3. 可在感染后的不同时间点评估病灶发展及细菌存活情况。本研究中，我们在感染后第3天进行观察。病灶大小可在皮肤表面（图1B：1×10⁹；图1D：1×10⁷ CFU）和肌肉表面（图1C：1×10⁹；图1E：1×10⁷ CFU）进行分析。病灶面积等于长度（mm）乘以宽度（mm），可用于评估组织损伤程度（图2A和图2B）。该结果有助于确定特定毒力因子所导致的组织损伤范围。此外，将病灶组织切除后在DPBS中匀浆处理，并进行平板培养以定量CFU数量（图2C），从而反映感染部位细菌的存活情况。

图1. 皮肤与肌肉病灶。 在CD1小鼠单侧 flank 皮下接种耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA，LAC株）。在感染后0时间点及第3天拍摄照片。（A）感染后0时间点（p.i.），（B）-（G）感染后第3天（p.i.）；B、D 和 F：皮肤病灶；C、E 和 G：肌肉病灶；B 和 C：接种 1×10⁹ CFU；D 和 E：接种 1×10⁷ CFU；F 和 G：模拟处理组。

图 2. 感染后第 3 天 MRSA（LAC）感染 CD1 小鼠的皮肤病灶大小及感染部位可存活细菌计数。 MRSA（LAC）感染的 CD1 小鼠皮肤和肌肉病灶。（A）皮肤病灶大小。（B）肌肉病灶大小。（C）组织总菌落形成单位（CFU）。H：1 × 10⁹ CFU 接种量；L：1 × 10⁷ CFU 接种量。*：p < 0.05，Mann-Whitney 检验。

讨论

1. 小鼠皮肤和软组织感染模型是一种强大的工具 体内 病原体毒力评估。该病原体的致病性 S. aureus 皮肤和软组织感染中的感染情况可能因多种参数而异，包括接种量、细菌生长阶段、接种深度、小鼠年龄以及小鼠的遗传背景 ^{7, 8}在使用该模型研究毒力功能时，必须严格控制这些参数，以确保实验结果的一致性。我们已在多种小鼠品系中研究了耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的皮肤感染，包括SKH1（无毛小鼠）、C57Bl/6、BALB/c和CD1。不同品系小鼠的感染结果存在差异。 ⁷，这与其他研究报道一致，即小鼠的遗传构成是决定MRSA感染严重程度的重要因素 ¹在本实验中，我们采用 CD1 小鼠，因为该小鼠品系已被证明非常适合用于相关研究 S. aureus 毒力因子 ⁵ 且比其他菌株更便宜。
2. 为确保实验结果的一致性，每次实验前必须检测用于感染的菌落是否具有溶血表型。 在绵羊血琼脂上呈现的β-溶血表型（菌落周围出现透明区域）反映了α-毒素的表达 S. aureus 分...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
THB	VWR international	95025-314
DPBS	Invitrogen	21-031-CV
1 ml 注射器	BD Biosciences	309602
27G1/2 针头	BD Biosciences	305109
羊血琼脂（TSA）	VWR international	90004-328