收集变浓度等温滴定量热法数据集以确定结合机制

摘要

等温滴定量热法（ITC）是研究配体与其宿主结合的有力工具。然而，在复杂体系中，可能有多个模型对数据的拟合效果相当。本文所述方法提供了一种手段，用于阐明复杂体系中合适的结合模型，并提取相应的热力学参数。

摘要

等温滴定 calorimetry（ITC）常用于测定配体与宿主大分子结合过程中相关的热力学参数。相较于研究宿主/配体相互作用的常见光谱学方法，ITC 具有一些优势。例如，当两个组分相互作用时所释放或吸收的热量被直接测量，无需任何外源性报告分子。因此，结合焓和缔合常数（Ka）可直接从 ITC 数据中获得，并可用于计算熵贡献。此外，等温曲线的形状依赖于 c 值及所涉及的机制模型。c 值定义为 c = n[P]tKa，其中 [P]t 为蛋白质浓度，n 为宿主分子内配体结合位点的数量。在许多情况下，同一配体的多个结合位点并不等同，而 ITC 可用于表征每个独立结合位点的热力学结合参数。然而，这要求使用正确的结合模型。若不同模型均可拟合同一实验数据，则模型选择可能成为问题。我们此前已证明，通过在多个 c 值下进行实验可规避此问题。在不同 c 值下获得的多条等温曲线可同时拟合至不同模型。随后基于整个变 c 值数据集的拟合优度来确定正确模型。本文将该方法应用于氨基糖苷类耐药酶——氨基糖苷 N-6'-乙酰转移酶-Ii（AAC(6')-Ii）。尽管本方法适用于任何体系，但该策略的必要性在表现出变构效应或协同性的大分子-配体体系中更为显著，尤其是在不同结合模型对同一数据产生几乎相同拟合效果的情况下。据我们所知，目前尚无此类商业可得的系统。AAC(6')-Ii 是一种同源二聚体，含有两个活性位点，且两个亚基之间表现出协同性。然而，在单一 c 值下获得的 ITC 数据可 equally well 拟合至少两种不同模型：一种为两组独立位点模型，另一种为双位点序贯（协同）模型。通过如上所述改变 c 值，我们确定 AAC(6')-Ii 的正确结合模型为双位点序贯结合模型。本文中，我们描述了进行 ITC 实验时必须采取的步骤，以获得适用于变 c 值分析的数据集。

方案

1. 配制储备溶液

1. 纯化目标大分子。（本实验中，氨基糖苷类 N-6'-乙酰转移酶-Ii（AAC6'-Ii）的分离方法如文献所述¹³。）
2. 配制 4 升透析缓冲液。（本实验中使用 25 mM 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES，分子量 238.3 g/mol），含 2 mM 乙二胺四乙酸（EDTA，分子量 292.2），pH 调至 7.5。）
3. 对蛋白进行透析。所用 AAC(6')-Ii 样品（5 mL，浓度 400 μM）需在透析缓冲液中透析三次，每次 1.3 L。最终的透析液保留用于冲洗仪器及稀释样品。
4. 将最终透析液经 0.45 μm 纤维素滤膜过滤后，于 4°C 保存。此液后续称为“运行缓冲液”。
5. 将蛋白溶液经已用运行缓冲液充分冲洗过的 0.2 μm 注射式滤膜过滤。使用标准方法（如 Bradford 法、Lowry 法等）或紫外吸光度测定蛋白最终浓度。储存蛋白时应以最大限度保持其长期稳定性。（对于 AAC(6')-Ii 蛋白，应于 4°C 保存；该蛋白在冻融后无法保持活性。）
6. 将 4.0 mg 乙酰辅酶 A（AcCoA，配体，分子量 809.57）溶于运行缓冲液中，配制成 200 μL 的 25 mM 储存液。待用前于 -78°C 冻存。
7. 所有蛋白和配体样品必须来源于同一母液，以尽量减少样品间浓度的随机波动。在整个变浓度数据集的分析中，将统一使用一个蛋白浓度校正因子进行调整。¹⁰

2. 准备ITC样品

1. 将酶溶液稀释至 c 值为 64，终体积为 2 mL。（对于 AAC(6')-Ii，这相当于 192 μM。）
2. 将配体（AcCoA）储备溶液迅速在冰水中解冻。
3. 用运行缓冲液将 80 μL 的 AcCoA 储备溶液稀释至 420 μL，配制 0.5 mL 浓度为蛋白结合位点数量 10 倍的 AcCoA 溶液（本例中为 4 mM）。转移至移液管填充管中。迅速将 AcCoA 储备溶液放回 -78°C 保存。
4. 在比设定运行温度低 1°C（19 °C）的条件下，将蛋白溶液和各溶液在真空下脱气 5 分钟。

3. 注射器的准备¹⁴

1. 将注射器穿过注射器支架，直到预装的注射器夹与支架处于同一高度。
2. 将第二个注射器夹套在注射器上，直至其紧贴支架底部。使用提供的 0.050" 球头六角扳手轻轻拧紧夹具。
3. 将注射器支架放入移液器支架中。
4. 轻轻将移液器注射装置滑入注射器内，确保推杆尖端直接插入注射器孔中。插入到位后，将注射器支架的锁紧环拧入移液器注射装置中。

4. 加载样品池¹⁴

1. 用至少 50 mL 的运行缓冲液清洗样品池，并使用带长针头的 2.5 ml 玻璃注射器吸除残留液体。
2. 缓慢将至少 1.8 ml 的蛋白质样品溶液吸入洁净且干燥的带长针头的 2.5 ml 玻璃注射器中。注意避免引入气泡。
3. 小心地将针头插入样品池，并轻轻接触池底。将针尖略微上提（约 1 mm），然后缓慢注入 AAC(6')-Ii 溶液，直至样品池顶部可见多余液体溢出。
4. 一边缓慢上提针头约 1 cm，一边确保溢流口处始终有液体存在。迅速抽出并重新注入少量溶液（约 0.25 ml），以排除样品池中可能滞留的气泡。
5. 清除所有溢出的溶液。操作时将针头沿溢流侧壁轻轻滑入样品池内，当针尖触碰到一个台阶状结构时，即达到运行溶液的理想液面高度。将此线以上的所有液体完全移除。

5. 加载注射器并启动运行¹⁴

1. 将塑料管装样注射器插入填充口。
2. 将活塞尖端降至填充口顶部。
3. 将乙酰辅酶A（AcCoA）溶液置于移液管支架底部的移液管填充管中。注射器尖端不应接触填充管底部。
4. 缓慢吸取溶液至注射器内，直至有少量溶液进入装样注射器的管中。
5. 通过降低活塞尖端并点击“关闭填充口”按钮来关闭填充口。点击“排空->重新填充”按钮，重复排空和重新填充操作3次，以去除装载过程中可能混入的气泡。
6. 从移液管支架上取下填充管，并轻轻擦拭注射器尖端。
7. 取移液管组件，缓慢而轻柔地将注射器插入样品池中。操作时应缓慢进行，因为注射器容易弯曲，需格外小心。通过按压锁定环底部，确保注射器完全插入。
8. 设置所需的运行温度（本例中为20°C），并选择略高于预期最大注射热流的参考功率（本例中为20μcal/sec）。
9. 编程设定所需的注射体积和延迟时间（本例中采用28次注射。第一次注射体积为2 μL，延迟60秒；后续所有注射体积均为10 μL，延迟330秒）。

6. 后续运行

1. 在后续所有实验中重复步骤 2-5，同时将 AAC(6')-Ii 和 AcCoA 的浓度依次降低为原来的 1/2、1/4、1/8、1/16 和 1/32。

7. 数据分析

1. 采用一种拟合程序，将所有等温线全局拟合至同一组结合参数，如先前所述¹⁰。

8. 代表性结果

代表性数据如图1所示。等温线的形状应随浓度变化而变化。当c值较高（即蛋白质和配体浓度较高）时，预期会出现更陡峭的转变（图2）。

对于AAC(6')-Ii而言，双位点顺序模型的拟合效果优于描述两组相同且独立结合位点并具有可调化学计量比的模型。

图 1. 将乙酰辅酶A（3.86 mM）滴定至AAC(6')-Ii（192 μM）中产生的等温曲线。A）原始ITC曲线。B）用于确定结合参数的积分值（方块），采用双位点连续结合模型拟合（实线）。

图 2. 将不同浓度的 AcCoA 滴定至 AAC(6')-Ii 中的 ITC 等温曲线。实验数据（空心圆圈）拟合至两组独立位点模型（虚线，品红色）和双位点顺序结合模型（实线，蓝色）。双位点顺序结合模型明显提供了更优的整体拟合效果。所使用的浓度分别为：A) 6 μM, 0.25 mM；B) 12 μM, 0.25 mM；C) 24 μM, 0.5 mM；D) 48 μM, 1.0 mM；E) 96 μM, 1.9 mM；F) 196 μM, 3.86 mM，分别对应 AAC(6')-Ii 和 AcCoA。

讨论

可变浓度c拟合的这一分析部分此前已有详细描述¹⁰。本文报道了采集适用于该方法的可变浓度c数据集的实际操作要点。所有蛋白质和配体样品必须来自相同的储备溶液，因此初始阶段需制备足够量的储备液以完成全部系列实验。这可确保AAC(6')-Ii与AcCoA的比例在所有实验中保持恒定，并减少样品间浓度的随机波动。

在此情况下，必须谨慎操作配体。乙酰辅酶A（AcCoA）在溶液中化学性质不稳定，因此务必确保其储备液处于液态的时间极短。一旦从储备液中取出所需用量，必须立即重新冷冻储备液。若不如此操作，AcCoA可能随时间推移发生降解，导致后续实验中的浓度不准确。分装后的AcCoA样品必须立即使用。对于不稳定的蛋白质，同样需要采取类似的预防措施。

该方案可轻松修改以用于研究其他复杂系统。¹⁰ 所用浓度必须根据特定系统的结合常数进行调整。广泛的范围 c 约1至1000之间的数值^8,10 在整个数据集中是必需的。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
乙酰基 c–乙酰辅酶A（AcCoA）	Sigma-Aldrich	A2056
4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）	Fisher Scientific	7365-45-9
乙二胺四乙酸（EDTA）	Sigma-Aldrich	431788
Spectra/Por 2 透析管	Spectrum Labs	132678
无菌注射器滤器（0.2 μm)	VWR 国际公司	281445-477
硝酸纤维素膜滤器（0.45 μm)	Whatman，GE Healthcare	7184-004
VP-ITC	MicroCal	VP-ITC	用于测量的微热量计
ThermoVac	MicroCal	USB Thermo Vac	温度控制脱气站