C57BL/6小鼠已被用于研究Hc的发病机制，并提供了最佳模型。我们正在探索体液免疫对该真菌的潜在保护作用，并制备了多种单克隆抗体[mAb]（针对组蛋白H2B和一种60kDa热休克蛋白），通过腹腔注射后检测其保护效果。
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摘要
摘要
使用该方法学的目的在于：1）提升我们通过抗体或疫苗保护个体、以预防或治疗由荚膜组织胞浆菌（Histoplasma capsulatum）引起的组织胞浆菌病的能力；2）研究毒力因子作为治疗靶点的作用。为制备单克隆抗体（mAb），先对小鼠进行免疫，随后采用本实验室建立的固相ELISA系统评估其免疫反应，并筛选出免疫应答最强的小鼠，分离其脾细胞用于与杂交瘤细胞融合。C57BL/6小鼠已被广泛用于研究H. capsulatum的致病机制，是获取所需数据的最佳模型。为评估单克隆抗体在感染中的作用，小鼠经腹腔注射给予抗H. capsulatum的单克隆抗体或同型匹配的对照单克隆抗体，随后通过静脉（i.v.）、腹腔（i.p.）或鼻内（i.n.）途径感染病原体。在科学文献中，评估单克隆抗体对真菌感染疗效的终点通常依赖于死亡率，并结合早期时间点的菌落形成单位（CFU）测定。生存期（死亡时间）研究至关重要，因其最能反映人类疾病的进程。因此，若无生存曲线，我们干预措施的有效性将无法充分确立。这一点同样适用于疫苗有效性的验证或对毒力突变株的测试。在组织胞浆菌病中，小鼠常在数小时内从活跃状态迅速发展至死亡。某种干预措施（如单克隆抗体给药）可能在初期保护动物免于发病，但疾病可能复发，而短期的CFU实验无法揭示这一情况。除了生存期和真菌负荷检测外，我们还检测感染引发的炎症反应（包括组织病理学、细胞募集和细胞因子反应）。在生存期/死亡时间实验中，小鼠感染后每天至少两次观察其发病迹象。为评估真菌负荷、组织病理学变化及细胞因子反应，小鼠在感染后的不同时间点被实施安乐死。动物实验均依照阿尔伯特·爱因斯坦医学院动物研究研究所的指导原则进行。
方案
1. H. capsulatum 的培养
- 使用10%的漂白剂清洁生物安全柜，随后进行20分钟的紫外照射，为真菌操作做好准备。H. capsulatum 的酵母相需要遵循生物安全二级（BSL II）操作规范，而菌丝相则需要BSL III级防护。后续步骤中使用酵母相。
- 准备一个15 ml的锥形管，加入5 ml PBS。从在37°C培养的BHI血琼脂平板[葡萄糖10 g/L、半胱氨酸0.1 g/L、青霉素-链霉素1%、绵羊红细胞50 ml/L（Colorado Serum Co., Colorado, USA）]上挑取一单菌落H. capsulatum（菌株Hc ATCC G217B），或取-80°C保存的酵母冻存液适量加入PBS中。剧烈涡旋混匀，室温下以1100 × g离心10分钟。小心移除上清液，避免扰动沉淀，加入10 mL新鲜PBS。重复此洗涤步骤三次。将细胞重悬于5 mL PBS中，并转移至50 mL锥形管。
- 为打破细胞聚集，将酵母细胞悬液在生物安全柜内（佩戴面部防护）用10 mL注射器通过26G1/2针头反复推注5次。为分离出小而均一的酵母细胞，将细胞在室温下以55 × g离心1分钟，然后小心吸取并弃去顶部1 ml液体。
- 将细胞悬液加入含有100 ml HAM F12培养基（GIBCO）的无菌锥形瓶中，培养基中添加16 g/L葡萄糖、1 g/L谷氨酸、8.4 mg/L胱氨酸和6 g/L谷氨酸，在37°C、150 rpm振荡条件下培养48小时。
2. 杂交瘤细胞培养与单克隆抗体纯化
- 将选定的杂交瘤细胞转移至含10%胎牛血清、10% NCTC、1%非必需氨基酸和1%青霉素-链霉素的DMEM培养基中。在37°C、5% CO2条件下，于细胞培养瓶（Becton Dickenson）中培养5-7天。
- 随后在室温下以1100 × g离心10分钟，收集上清液，避免扰动沉淀物。
- 接着使用蛋白A/G树脂通过FPLC纯化无细胞的上清液。
- 然后可通过捕获ELISA（1）使用IgG同型对照作为标准品来计算mAb浓度（图1B）。
3. Histoplasma Capsulatum 接种物制备
- 取48小时 荚膜组织胞浆菌 （菌株 Hc ATCC G217B）酵母相培养物，在 HAM F-12 培养基中培养。
- 以 1100 × g 离心 10 分钟。弃去上清液，加入新鲜 PBS。
- 重复步骤 3.2，共 3 次。
- 用注射器将酵母细胞悬液通过26G1/2针头反复推注5次。
- 以 55 × g 离心 1 分钟，使残留的细胞团沉淀。将含有单细胞悬液的上清液转移至新离心管中。
- 使用血细胞计数板对单细胞悬液进行计数。
- 调整细胞浓度，以达到 1.25 x 107 酵母（存活率）或 5.0 x 106 （菌落形成单位、细胞因子和组织学）在悬液中 <50 μL （图2）。
4. 单克隆抗体的腹腔注射
- 用一只手抓住小鼠的尾巴和颈部背侧皮肤（图 3A）。尽可能靠近耳朵处捏住小鼠颈部背侧皮肤以固定小鼠（确保捏起足够的皮肤，防止小鼠转头咬伤操作者；图 3B 和 3C）。
- 用小指轻轻压住手掌固定尾巴（图 3D）。
- 注射前用 70% 乙醇擦拭注射部位，并在插入针头后回抽观察是否有血液，确认无误后再进行注射。
- 使用 26G1/2 针头刺穿皮肤和腹肌，将含有 500μg 抗体的溶液（PBS、同型对照抗体或待测单克隆抗体，溶于 1 mL PBS 中）注入左下腹或右下腹象限（腹膜腔内），操作时使小鼠头部朝下，注意避免损伤膈肌和其他内脏器官（图 3E）。
- 拔针前短暂停留，以减少药液外漏的可能性。
- 至少等待两小时后，再进行下一步操作。
5. 小鼠麻醉与经鼻感染
- 使用氯胺酮（100 mg/kg）和赛拉嗪（10 mg/kg）配制麻醉剂。按照随附书面方案所述，通过腹腔注射给予磷酸盐缓冲液（PBS）、同型对照抗体或实验性抗体。在单克隆抗体注射后等待两小时，再对小鼠进行麻醉并开展鼻内感染实验。
使用氯胺酮（100 mg/kg）和赛拉嗪（10 mg/kg）配制麻醉剂（7）。
- 在2小时等待期间，准备 荚膜组织胞浆菌 按照随附书面方案中所述制备接种物。
- 按照步骤 5.1 至 5.5 操作。用镊子夹捏动物脚趾，检查无反射反应，以确认麻醉生效. 麻醉后，将小鼠前牙轻轻悬挂在尼龙或棉线上，使用两个支柱架固定绳子以悬挂动物。
- 缓慢给予约 50 μl 使用微量移液器将接种物注入小鼠鼻腔，同时密切监测小鼠的呼吸频率。鼻腔感染后，让小鼠保持该体位休息2–5分钟，以促进酵母菌沉积至动物肺部（图3F）。
- 小鼠感染后，将其置于受监控的温暖环境中饲养（温度保持在25至 37°C），必要时可小心使用加热灯，直至其从麻醉中恢复。小鼠苏醒后，将其放回洁净的笼具中 随意 食物和水的获取 将笼子送回我们的动物实验中心，并置于清洁的动物房（BLSI）中饲养。
6. 生存研究
- 对感染动物和模拟感染动物进行临床评估，观察呼吸急促、嗜睡、意识模糊和体重减轻等症状。实验室人员应每天检查两次，动物饲养员应每天检查一次。
- 在小鼠组织胞浆菌病中，通常直到接近死亡前，除呼吸频率轻度增加外，无其他明显感染迹象。在疾病晚期（通常发生在第10至11天），小鼠会出现明显的呼吸急促，并伴有活动减少。通常会迅速进入濒死状态并死亡。
- 应使用CO2在专用容器中对痛苦明显的动物实施安乐死，死亡动物应每日统计数量。
7. 菌落形成单位研究、组织学及细胞因子研究
- 为待采集的每个器官准备含有 10 mL PBS 的 15 mL 圆锥形管。
- 在接种亚致死剂量（5.0 × 106）后第 7 天和第 14 天处死动物，并立即取出肺、脾和肝。
- 取待检测器官的一小块组织，用福尔马林固定过夜。组织切片将通过显微镜进行病理学评估。
- 为待匀浆的每个器官准备含有 5 mL PBS 的 50 mL 圆锥形管，并在管口覆盖 70 μm 细胞滤器。使用无菌 5 mL 注射器活塞分别将各器官剩余部分压碎并加入 50 mL 管中。
- 随后对器官匀浆液进行连续稀释（1:100、1:1000 和 1:5000），并将每种稀释液各 100 μL 接种至 BHI-血琼脂平板（2）上。
- 根据生产商说明（Roche, Germany）向匀浆液中加入蛋白酶抑制剂片剂。
- 将平板在 37°C 下孵育最多 14 天，并计数菌落形成单位（CFU）。
- 将器官匀浆液在 4000×g 离心 10 分钟，收集上清液用于后续按制造商推荐的标准方法进行的细胞因子检测。
8. 单克隆抗体对的保护作用 H. Capsulatum 依赖于抗体特异性和同种型
- 单克隆抗体（MAb）的同种型在抵抗H. capsulatum中至关重要，接受抗Hsp60的IgG1或IgG2a单克隆抗体处理的小鼠，其存活时间显著长于接受抗Hsp60的IgG2b单克隆抗体、同种型对照单克隆抗体或PBS的对照组小鼠（图4）。
- 此外，在接受具有保护作用的单克隆抗体的小鼠中，第7天时肺部和脾脏的菌落形成单位（CFU）数量显著减少，至第14天时肺部酵母菌数量分别下降了2个和2.5个对数单位（图5）。
图 1：H. capsulatum 及杂交瘤的培养。（A）从 BHI-血琼脂平板上培养的 H. capsulatum 获得单菌落，用于制备液体 HAM F-12 培养物。（B）杂交瘤在细胞培养瓶中的生长，以及利用蛋白 A/G 树脂通过亲和层析纯化单克隆抗体。
图2： H. capsulatum 鼻腔感染接种物的制备。经细胞悬液获得后 H. capsulatum 通过移液器破坏聚集体并进行离心后，使用血细胞计数板进行计数。细胞浓度调整至1.25 × 107 （生存实验）或 5 × 106 （菌落形成单位、细胞因子和组织学）在 <50 μL.
图3：单克隆抗体给药过程中的小鼠操作。（A）通过尾巴抓取小鼠，（B 和 C）通过握住其颈部后方皮肤并尽量靠近耳朵处进行固定。（D）将尾巴夹于小指与手掌之间。（E）使用26G1/2针头注射单克隆抗体溶液。（F）通过移液器将H. capsulatum细胞悬液轻柔滴入鼻孔，以进行鼻内接种。
图4：抗Hsp60的单克隆抗体可改变组织胞浆菌病的发病过程。在感染前2小时，腹腔注射500 μg的IgG1或IgG2a单克隆抗体，可显著延长小鼠的存活时间（与对照组相比，p<0.05），但IgG2b单克隆抗体无此效果。
图 5： 在经腹腔注射给予抗Hsp60特异性单克隆抗体或无关单克隆抗体处理的小鼠中，于鼻腔接种5×106 Hc 酵母菌后7天和14天检测肺组织中的CFU，结果显示接受IgG1和IgG2a亚型单克隆抗体治疗的小鼠真菌负荷显著降低。黑色柱代表感染后第7天的CFU，白色柱代表第14天的CFU（*感染后第7天 p<0.001，**感染后第14天 p<0.001）。
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讨论
本文所述方案表明，抗荚膜组织胞浆菌（H. capsulatum）的单克隆抗体（mAb）可改变实验性小鼠组织胞浆菌病的病程。针对病原体细胞表面抗原的单克隆抗体能够调节宿主与病原体相互作用过程中发生的复杂动态变化。本研究证实，在致死性组织胞浆菌病的小鼠模型中，腹腔注射单克隆抗体可介导保护作用，并提示某些候选蛋白可用于疫苗开发，例如H2B、M抗原（表面过氧化氢酶）(3) 和Hsp60。在体内实验中，给予针对Hc Hsp60和H2B的保护性单克隆抗体可降低感染小鼠器官中的真菌负荷和炎症反应，并延长其存活时间。
尽管针对荚膜组织胞浆菌（H. capsulatum）的疫苗研发是一个令人振奋的研究领域，但疫苗在免疫功能低下个体中可能无效，因为他们未必能够有效启动免疫应答。因此，显然这类人群可能最受益于针对荚膜组织胞浆菌抗原（H. capsulatum antigens）的单克隆抗体（mAb）被动治疗。我们的数据表明，针对Hsp60的单克隆抗体，尤其是与其他靶向细胞表面抗原的单克隆抗体联用时，可能改善组织胞浆菌病患者的治疗效...
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披露
未声明任何利益冲突。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 生物安全柜（BSL2） | |||
| 15 mL 圆锥形离心管 | Falcon BD | ||
| HAM F-12 培养基 | GIBCO，由 Life Technologies 提供 | ||
| 37°C 摇床 | |||
| 涡旋振荡器 | |||
| 50 mL 圆锥形离心管 | Falcon BD | ||
| 26G1/2 针头 | BD Biosciences | ||
| 10 mL 注射器 | BD Biosciences | ||
| 250 mL 三角烧瓶 | |||
| FPLC（快速蛋白液相色谱）系统 | GE Healthcare | ||
| 酶标仪 | BioTek | ||
| 麻醉剂（氯胺酮和赛拉嗪） | |||
| 层析柱支架 | |||
| 尼龙绳 | |||
| 加热灯 | |||
| 70μm 细胞滤网 | Falcon BD | ||
| BHI 琼脂平板 | GIBCO，由 Life Technologies 提供 |
参考文献
- Casadevall, A., Mukherjee, J., Scharff, M. D. Monoclonal antibody based ELISAs for cryptococcal polysaccharide. J. Immunol. Methods. 154, 27-35 (1992).
- Guimaraes, A. J., Frases, S., Gomez, F. J., Zancope-Oliveira, R. M., Nosanchuk, J. D. Monoclonal antibodies to heat shock protein 60 alter the pathogenesis of Histoplasma capsulatum. Infect Immun 77. , 1357-1367 (2009).
- Guimaraes, A. J., Hamilton, A. J., de M Guedes, H. L., Nosanchuk, J. D., Zancope-Oliveira, R. M. Biological function and molecular mapping of M antigen in yeast phase of Histoplasma capsulatum. PLoS One. 3, e3449-e3449 (2008).
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- Smith, W. Responses of laboratory animals to some injectable anaesthetics. Lab Anim. 27, 30-39 (1993).
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