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使用整体封片法 原位 将分子生物学与生物体生物学相联系的杂交技术

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DOI：

10.3791/2533

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2011年3月31日

 ,  , 
1Department of Biology, Syracuse University, 2Department of Science Teaching, Syracuse University

本文内容

摘要

整体装片 原位 原位杂交（WISH）被应用于高年级本科生的比较脊椎动物生物学课程中，作为脊椎动物解剖实验的补充。这使学生能够在同一门课程中研究基因表达模式和宏观解剖结构，从而将分子生物学与个体生物学的学习相结合。

摘要

整体封片 原位 杂交（WISH）是分子生物学实验室中常用的一种技术，用于通过在整体标本中定位特定mRNA转录本来研究基因表达。该技术（改编自Albertson和Yelick，2005）曾在美国雪城大学高年级本科生《比较脊椎动物生物学》实验课程中使用。在《比较脊椎动物生物学》实验课的前三分之二阶段，学生主要通过传统解剖和使用模型，学习代表不同脊索动物分类群的多种生物的胚胎学和大体解剖学。课程的最后阶段则采用了一种创新的教学方法，即通过观察脊椎动物发育并结合分子技术来教授解剖学，其中包括对斑马鱼胚胎进行WISH实验。实验使用了成纤维细胞生长因子8a（fibroblast growth factor 8 a）杂合子fgf8a）突变品系， ACE，被使用。由于孟德尔遗传规律，ace 杂交产生了野生型、杂合子和纯合子 ace/fgf8a 突变体呈1:2:1比例。使用在中线以及发育中的解剖结构（如心脏、体节、尾芽、肌节和脑）中具有已知表达模式的RNA探针。采用13个体节期和prim-6期的斑马鱼进行WISH实验，学生在课堂上完成染色反应。通过对不同发育阶段斑马鱼胚胎的研究，学生能够观察这些解剖结构在个体发育过程中的变化。此外，部分 ace/fgf8a 突变体表现出心脏环化异常，以及体节和脑部发育缺陷。本实验课程的学生通过外部解剖结构及基因表达模式，观察了多种器官系统的正常发育过程。同时，他们还识别并描述了呈现异常解剖结构发育和基因表达的胚胎（即候选突变体）。

对于所在机构尚未配备必要设备，或实验与课程创新经费有限的教师而言，试剂和仪器的经济成本可能是需要考虑的因素，同时无论在何种教学环境下，教师所需投入的时间和精力也同样重要。然而，我们认为，在此类课堂实验环境中使用WISH技术，能够在发育遗传学与解剖学之间建立重要的联系。随着技术的进步，对生物体发育进行分子水平研究的能力正变得越来越容易、成本更低且日益普及，许多进化生物学家、生态学家和生理学家正转向分子生物学领域的研究策略。在比较脊椎动物生物学实验课堂中应用WISH技术，正是分子生物学与解剖学在单一课程中融合的一个实例。这为高年级大学生提供了实践现代生物学研究技术的机会，有助于实现教育的多元化，并推动未来跨学科的科学研究。

方案

1. 目标cDNA的质粒转化

第一部分：质粒转化

（所需时间：3 小时加上过夜孵育）

  1. 将SOC营养肉汤在42°C水浴中预热（每反应500 μL）
  2. 在冰上解冻感受态细胞
  3. 向25 μL感受态细胞中加入1 μL质粒
  4. 冰上放置20分钟
  5. 在42°C水浴中热激细胞45秒
  6. 立即放回冰上冷却2分钟
  7. 向每管细胞中加入500 μL 42°C的营养肉汤
  8. 在37°C、255转/分钟（rpm）条件下振荡培养2小时
  9. 取75 μL转化混合物涂布于Luria Bertani（LB）琼脂平板
  10. 倒置平板，于37°C过夜培养

第二部分：E. coli 培养

（所需时间：15 分钟加上过夜孵育）

  1. 每个反应中，取 3 mL LB 培养基和 3 μL 50 mg/mL 氨苄青霉素加入培养管中
  2. 从琼脂平板上刮取 1 个细菌菌落，加入每根培养管中
  3. 将培养管于 37°C、255 rpm 条件下振荡培养过夜

第三部分：质粒制备

（所需时间：1.5 小时）

  1. 使用 5 Prime FastPlasmid Mini Kit（目录号 #2300000）从过夜培养物中分离质粒
  2. 为检测所制备质粒的存在，将试剂盒洗脱的 DNA 在含溴化乙锭染色的 1% Tris-乙酸-EDTA（TAE）凝胶上电泳

2. 原位 地高辛标记RNA探针合成

第一部分：质粒的线性化

（所需时间：2.5 小时）

  1. 在 1.5 mL 微量离心管中混合：
    制备好的质粒20 mL
    限制性内切酶*2 mL
    缓冲液**10 mL
    10X 牛血清白蛋白 (BSA)10 mL
    焦碳酸二乙酯 (DEPC) 水58 mL
     100 mL
  2. 在 37°C 下孵育 2 小时
    *根据质粒不同而变化
    **根据限制性内切酶不同而变化

第二部分：转录

（所需时间：3 小时）

  1. 在 1.5 mL 微量离心管中混合：
    线性化质粒4 mL
    10X 转录缓冲液**4 mL
    地高辛标记混合物4 mL
    聚合酶*2 mL
    RNase 抑制剂2 mL
    DEPC 水24 mL
     40 mL
  2. 在 37°C 下孵育 1 小时
  3. 加入 2 μL 聚合酶*
  4. 在 37°C 下孵育 1 小时
  5. 加入 2 μL DNase
  6. 在 37°C 下孵育 20 分钟
    *随质粒不同而变化
    **随聚合酶不同而变化

第三部分：沉淀

（所需时间：5 分钟操作时间，加上 2 小时至过夜孵育，1 小时离心及重悬）

  1. 加入 4 μL 的 0.2 M EDTA
  2. 加入 5 μL 的 4 M 氯化锂
  3. 加入 150 μL 冰冷的 100% 乙醇
  4. 在 -80°C 下孵育 2 小时至过夜
  5. 在 4°C 下以 14,000 rpm 离心 30 分钟，弃去上清液
  6. 将沉淀干燥 7 分钟
  7. 用 20 μL DEPC 处理水重新悬浮
  8. 在 37°C 下孵育 5 分钟

第四部分：分级分离——仅当探针大小大于 0.6 kb 时进行

（所需时间：根据探针大小而定，通常不超过20分钟）

  1. 在 1.5 mL 微量离心管中混合：
    RNA 探针20 mL
    DEPC 水12 mL
    碳酸氢钠4 mL
    碳酸钠4 mL
     40 mL
  2. 在 60°C 水浴中孵育。孵育时间根据以下公式确定：
    时间（分钟）=（起始 kb - 目标 kb）/（0.11 × 起始 kb × 目标 kb）
    目标平均大小 = 0.6 kb

第五部分：最终沉淀

（所需时间：5 分钟操作时间，加上 2 小时至过夜孵育，1 小时离心与重悬，1 小时凝胶电泳）

  1. 加入 40 μL DEPC 水
  2. 加入 8 μL 醋酸钠
  3. 加入 1.04 μL 冰醋酸
  4. 加入 240 μL 冰冷的 100% 乙醇
  5. 在 -80°C 下孵育 2 小时至过夜
  6. 在 4°C 下以 14,000 rpm 离心 30 分钟，弃去上清液
  7. 将沉淀干燥 7 分钟
  8. 用 20 μL DEPC 水重悬沉淀
  9. 涡旋混匀
  10. 为检测核糖探针的存在，将重悬后的溶液在含溴化乙锭的 1% TAE 琼脂糖凝胶上电泳

3. 整体封片 原位 杂交

第一部分：胚胎固定与蛋白酶K消化

（所需时间：固定过夜，次日储存需4小时，从储存到第二部分需2.5小时）

  1. 收集不同发育阶段的斑马鱼胚胎，并在4%多聚甲醛（PFA）中于4°C过夜固定
  2. 用含0.1% Tween-20的磷酸盐缓冲液（PBSt）洗涤固定后的胚胎，每次10分钟，共洗涤3次
  3. 为确保胚胎充分接触实验试剂，必要时使用尖头镊子手动去除胚胎的绒毛膜
  4. 通过在PBSt中依次用25%和50%甲醇梯度溶液各洗涤1小时进行脱水，然后在-20°C下保存于100%甲醇中
  5. 使用前，在PBSt中通过50%甲醇（2次）和25%甲醇（1次）各洗涤10分钟以重新水化胚胎，最后在100% PBSt中洗涤2次，每次10分钟。PBSt/甲醇洗涤的具体时间并不关键
  6. 如有需要，将胚胎置于含10%过氧化氢的PBSt溶液中漂白，以去除深色色素。根据胚胎发育阶段，孵育时间应为10–20分钟，且微量离心管盖应保持打开状态，以防气压积聚
  7. 根据胚胎发育阶段，使用以PBSt按1:5000稀释的50 mg/mL蛋白酶K消化胚胎，时间为3–15分钟
  8. 将胚胎在4% PFA中重新固定30分钟，随后在PBSt中洗涤3次，每次5分钟

第二部分：核糖探针的杂交

（所需时间：3 小时，外加杂交过夜，次日 1.5 小时至第三部分）

  1. 将胚胎置于预热至70°C的预杂交液（PHS）中，在70°C水浴中预杂交2-3小时
  2. 移除PHS，加入0.5 mL杂交液和1.5 μL先前合成的地高辛标记的核糖探针，在70°C孵育过夜。根据核糖探针靶标的不同，温度可在几度范围内波动
  3. 次日，在70°C下依次用含75%、50%和25% PHS的2X盐-柠檬酸钠（SSC）溶液梯度洗涤胚胎，每次10分钟，然后在68°C下用0.2X SSC溶液洗涤30分钟
  4. 在马来酸缓冲液（MAB）中于室温洗涤2次，每次10分钟

第三部分：抗地高辛（α-DIG）抗体孵育

（所需时间：3 小时以上用于封闭，以及过夜封闭，第二天再需 2.5 小时进行第四部分）

  1. 将胚胎转移至12孔板中
  2. 在1-2 mL封闭液中室温下预封闭胚胎，至少3小时
  3. 同时，通过另取一份封闭液并将抗地高辛抗体按1:2000比例稀释于其中，对抗体进行预封闭
  4. 去除预封闭液，加入1-2 mL预封闭的α-DIG溶液，4°C孵育过夜
  5. 次日，用MAB缓冲液洗涤胚胎；先让胚胎在MAB中孵育5分钟，随后更换缓冲液，分别孵育两个10分钟、一个30分钟和一个60分钟。具体时间无需精确
  6. 用碱性磷酸酶（AP）缓冲液洗涤胚胎，每次5分钟，共洗涤3次

第四部分：染色与最终处理

（所需时间：染色需1小时至过夜，具体取决于所用的核糖探针；开始甘油洗涤前需4小时；每次甘油洗涤需6-10小时；可在甘油中保存）

  1. 向胚胎中加入 1–2 mL 染色液，用铝箔包裹培养板，并定期（约每 20 分钟）检查染色情况，直至染色程度充分
  2. 用 PBSt 洗涤胚胎 2 次，每次 5 分钟，以终止染色反应
  3. 使用 PBSt 中的 25% 甲醇（1 次）和 50% 甲醇（2 次）各洗涤 10 分钟，然后用 100% 甲醇洗涤，以去除背景染色
  4. 让胚胎在 100% 甲醇中于室温孵育至少 2 小时
  5. 用 PBSt 中的 50% 甲醇（2 次）和 25% 甲醇（1 次）各洗涤 10 分钟进行再水化，然后用 100% PBSt 洗涤 2 次
  6. 将染色后的胚胎通过梯度洗涤转移至含 80% 甘油的 PBSt 溶液中，并于 4°C 保存

配方：

  • LB 琼脂平板——10 g LB 琼脂 + 250 mL 蒸馏水，高压灭菌，冷却至不烫手时加入 250 μL 氨苄青霉素，将15–20 mL温热溶液倒入每个培养皿中，静置使琼脂凝固
  • LB 培养基 — 12.5 g LB 培养基粉末 + 200 mL 蒸馏水，高压灭菌，使用前冷却
  • 1% TAE 琼脂糖凝胶——0.4 g 琼脂糖，40 mL 1× TAE 2 μL 溴化乙锭；上样 7 μL 质粒（靶cDNA的质粒转化）或 3 μL 核糖探针和 4 μL DEPC 水（原位 DIG标记的RNA探针合成）+ 1 μL 上样染料， 5 μL DNA 标准分子量标记
  • 预杂交液 - 50% 甲酰胺，5× SSC，9.2 mM 柠檬酸，1% Tween-20
  • 杂交液——预杂交液加 500 μg/ mL tRNA 和 50 μg/ mL 肝素
  • MAB- 100 mM 马来酸，150 mM NaCl，0.2 M NaOH，0.1% Tween-20，调至 pH 7.5
  • 封闭液——3 份 MAB，1 份 MAB 中的 10% Boehringer 封闭试剂，1 份热灭活的羊血清
  • AP缓冲液——60 mM Tris-HCl（pH调至9.5），60 mM NaCl，30 mM MgCl2，0.1% Tween-20
  • 染色液——AP缓冲液中的5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸盐（BCIP）与硝基蓝四氮唑（NBT）

4. 代表性结果

当操作正确时，NBT、BCIP 与碱性磷酸酶之间的反应会形成紫色沉淀，应在斑马鱼胚胎上呈现为紫色染色。核糖探针应事先由目的基因对应的 cDNA 合成。因此，可以推断所观察到的任何染色区域均代表在该特定发育阶段目的基因发生转录的斑马鱼部位。本课程所用的核糖探针由以下基因的 cDNA 合成：aldh1a2（先前称为 raldh2；Begemann et al., 2001；图1）；fgf8a（Reifers et al., 1998；图2）；deltaC（Oates et al., 2005）；myod1（Weinberg et al., 1996）；shha（Krauss et al., 1993）；pax2a（Brand et al., 1996；图3）以及 myl7（先前称为 cmlc2；Yelon et al., 1999）。预期染色出现在中线及体节、尾芽、肌节、脑和心脏等解剖结构中。Ace/fgf8a 突变体预期在上述多种结构中存在缺陷。使用常规体视显微镜即可清晰观察染色结果。其他参考资料提供了与本文所述相似的WISH技术的更多细节及故障排除方法（Clark, 2003；D'Costa et al., 2009；Schmoldt et al., 2009；Schoenwolf, 2009）。

胚胎发育阶段示意图；标注特征：后脑、眼睛、胸鳍原基。
图1. 一条受精后24小时的斑马鱼胚胎，已与特异性针对aldh1a2的核糖探针进行杂交。可在眼睛、后脑、胸鳍芽原基和体节中观察到特异性染色。上为头端，下为尾端。

胚胎脑发育示意图；标注：端脑、间脑、中脑-后脑边界。
图 2. 一条处于13体节发育阶段的斑马鱼胚胎，经fgf8a特异性探针杂交处理。可见端脑、背侧间脑、中脑-后脑边界、体节及尾芽部位有特异性染色。腹侧朝左，背侧朝右。

胚胎脑发育，标记的显微图像，中脑-后脑边界，耳泡。
图3. 受精后22小时的斑马鱼胚胎，已与针对特定基因的核糖探针进行杂交 pax2a，一种用于可视化神经系统的可靠标记物。可在脉络丛裂、中脑-后脑边界、耳泡和脊髓神经元中观察到特异性染色。背侧视图，左侧为头侧。

讨论

在比较脊椎动物生物学实验课程中，使用WISH技术帮助学生通过已知基因表达模式的可视化，理解遗传学在解剖发育过程中的作用。课程的第一部分，学生对代表多个不同脊索动物分类群的生物体进行解剖，从而有充足的时间学习、理解、比较和对比脊椎动物的解剖结构。

作为课程第二部分的引言，学生们接受了一次正式讲座，内容涉及斑马鱼的发育过程与解剖结构。讲座还讨论了WISH实验的方法及预期结果。随后，学生们获得了处于体节形成期和prim-6发育阶段，以及受精后2天和5天（dpf）的活体斑马鱼，并在解剖显微镜下进行观察。此举旨在帮助学生更深入地理解斑马鱼胚胎的外观特征，以及在个体发育过程中发生的各类形态学变化。

在下一次实验课中，学生将获得此前已进行过WISH（原位杂交）的斑马鱼胚胎。他们需要观察并描述每个目标基因（所使用的核糖探针）的基因表达模式。用于WISH的胚胎来自杂合子ace/fgf8a品系个体之间的交配。根据孟德尔遗传规律，来自ace/fgf8a交配的胚胎中，预计有25%为纯合突变体，并在本课程重点关注的多种解剖结构上表现出缺陷。根据已发表的文献和Albertson实验室的未发表观察结果，预计这些突变体会出现脑部发育异常、心脏环化异常，以及体节缺陷（Brand et al., 1996; Albertson and Yelick, 2005; 个人观察）。

要求学生观察每种基因表达模式所对应的所有标本，包括野生型（在发育早期阶段，杂合子动物与其野生型同胞无法区分）和纯合突变体。随后要求学生撰写实验报告，描述他们的观察结果，并结合解剖学和遗传学知识，分析异常的基因表达如何引发解剖结构的畸形。

学生们似乎对这项实验练习表现出兴奋和好奇。大多数学生以前从未使用过WISH技术，因此对课程的这一部分极为感兴趣。学生们发现斑马鱼胚胎中不同的基因表达模式十分有趣，有些人甚至将染色所呈现的图样与一些广为人知的图案和符号联系起来描述，例如笑脸。最终的实验报告表明，学生普遍理解了WISH实验流程以及基因在特定解剖结构中的表达情况。学生还被要求理解在实验中通过WISH所研究的各个基因的具体功能（Stickney et al., 2000；Huelsken et al., 2002；Geetha-Loganathan et al., 2008a；Geetha-Loganathan et al., 2008b）。然而显然，部分学生对相关信号通路和目标基因的背景知识较为有限。在今后的比较脊椎动物生物学课程中，若能在WISH技术的导论讲座中增加有关这些概念的讲解，或将有助于提升教学效果。

由于该实验方案通常需要连续四天完成，具体取决于课程安排，学生可能只能在课堂上完成部分实验，其余步骤必须由授课教师负责完成。在我们的比较脊椎动物生物学课程中，学生在实验室完成染色反应，而之前的所有步骤均由助教完成。如果希望学生在课堂上完成整套WISH实验，可根据课程的时间安排，将实验方案划分为若干子单元，在多个实验课中分步进行。如果学生无法完成全部实验流程（例如本课程因每周仅进行一次实验课而不具备可行性），则可以让学生在课上开始时加入染色液，并根据所使用的核糖探针，在一小时内完成染色。染色所需时间因不同的核糖探针及多种实验条件而有显著差异，应在课前预先确定。值得注意的是，如果学生仅在实验课中进行染色显影，则所有前期步骤均由教师负责，这将需要在课堂外投入大量时间和精力。如有需要，也可采用免疫组织化学作为WISH的替代方案，利用抗体标记来观察蛋白质的定位；但目前针对斑马鱼发育相关基因的特异性抗体尚不易获得。另一种选择是，在不同脊椎动物物种上进行WISH实验，让学生比较相同基因在不同生物体中的表达模式（Pizard et al., 2004; Aramaki et al., 2007; Emerging Model Organisms, 2008; Emerging Model Organisms, 2010）。

在比较脊椎动物生物学课程中使用WISH的总体目标是向学生展示如何利用分子生物学技术来研究解剖结构的发育过程。同时，这也为学生提供了思考基因表达改变如何不仅导致发育畸形，还可能引发进化变化的机会。这一研究领域被正式称为进化发育生物学（常简称为“evo-devo”），是一个快速发展的学科，旨在通过发育过程将基因型与表型联系起来，并阐明进化变化的潜在机制基础。随着该领域的兴起，越来越多的生态学家、生物整体学家和生理学家在其研究中采用分子技术。我们认为，在比较脊椎动物生物学课程中引入WISH技术有助于使课程内容紧跟当前科研技术与概念的进步，通过整合不同生物学分支，促进高年级生物学课程之间的横向衔接。此外，这种整合式教学方法将使学生能够在一门课程中学习多种生物学研究技术，从而获得更加多元化的教育体验，并推动未来跨学科科学研究的发展。

披露

未声明任何利益冲突。

致谢

作者谨此感谢雪城大学生物系以及 Marilyn Kerr 博士在《比较脊椎动物生物学》课程管理工作中所给予的支持。Albertson 实验室的研究得到了美国国立卫生研究院/国家牙科与颅面研究所授予的 R21DE019223 项目资助，以及美国国立卫生研究院/国家老龄化研究所授予的 R01AG031922 项目资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
5 Prime 快速质粒小提试剂盒（100 次）Fisher Scientific2300000
One Shot TOP10 化学感受态 E. coli 菌株与 SOC 培养基 InvitrogenC404003
LB 琼脂Fisher ScientificBP1425-500
LB肉汤Fisher ScientificBP1426-500
氨苄青霉素钠盐 Fisher ScientificBP1760-5
异丙醇Acros Organics42383-0010
培养皿 100 × 20 mm，未处理实验室产品销售430591
14 ml 培养管，带卡扣盖Fisher Scientific1495911B
限制性内切酶 &缓冲液 & 10xBSANew England Biolabs有所不同
焦碳酸二乙酯（DEPC）25 mlSigma-AldrichD5758-25mL
三水合乙酸钠 USP/FCC 500gFisher Scientifics608500
Gal 200 proof 乙醇 Fisher Scientific04-355-451
Tris-乙酸-EDTA (TAE) 50倍浓缩液 1LFisher Scientificbp13321
低电渗琼脂糖 100 gFisher ScientificBP160-100
溴化乙锭 10 mlSigma-Aldrich45-E1510
蔗糖凝胶上样染料 40% 蔗糖Fisher ScientificBP655-1
1 kb 全量程 DNA 标准品Fisher ScientificBP2582200
DIG RNA标记混合物罗氏集团11277073910
T3 RNA聚合酶罗氏集团1031163
T7 RNA聚合酶罗氏集团10881767001
SP6 RNA聚合酶罗氏集团810274
Protector Rnase抑制剂罗氏集团3335399001
DNase I，无RNase，10,000单位 罗氏集团4716728001
EDTA 分子生物学试剂Sigma-Aldriche5134-500G
氯化锂 100 gFisher ScientificL121100
碳酸钠 1 kgFisher ScientificBP357-1
碳酸氢钠，500 gFisher ScientificBP328-500
冰醋酸 ACS 500 mlFisher Scientifica38500
多聚甲醛 R 500 gFisher Scientifico4042500
PBS 磷酸盐缓冲液 10XFisher Scientificbp3991
Tween 20 500 mlFisher Scientificbp337500
甲醇 5 LFisher ScientificA4124
蛋白酶K 50 mgFisher Scientificbp170050
甲酰胺 1 LFisher ScientificF841
20x SSC 1 LFisher Scientificbp13251
无水柠檬酸 ACS 500 gFisher Scientifica940500
V型核糖核酸转运Sigma-Aldrichr7876-2.5KU
肝素钠盐 50 mgFisher Scientificbp252450
马来酸 R 500 gFisher Scientifico3417500
氯化钠 500 gFisher Scientifics271500
氢氧化钠 500 gFisher Scientifics318500
封闭剂罗氏集团11096176001
羊血清 500 mlInvitrogen16070096
抗 DIG-AP 片段罗氏集团11093274910
2M Tris 溶液 500 mlFisher Scientificbp1759500
氯化镁 500 gFisher Scientificm33500
BCIP 3 ml罗氏集团11383221001
NBT 3 ml罗氏集团11383213001
甘油 99% 2.5 LFisher ScientificAC158920025
12 孔聚苯乙烯标准板（带盖）VWR 国际62406-165
15 ml 螺口管，每架 50 个，每箱 500 个实验室产品销售L262861
50 ml 螺口管，25 个/架，500 个/箱实验室产品销售L262890
1.6 ml 微量离心管 实验室产品销售L234401
2 Parafilm 2" x 250 英尺Fisher Scientifics37441
7 ml 移液管 USA Scientific, Inc.1020-2520
.1-10 μl 移液器吸头，散装 USA Scientific, Inc.1111-3000
1-200 μl 吸头，散装 USA Scientific, Inc.1111-0006
101-1000 μl 移液器吸头，散装 USA Scientific, Inc.1111-2021
铝箔杂货店
    <李>高压灭菌<李>微型离心机<李>37°C 型培养箱（带摇床）<李>4°C 微型离心机<李>水浴锅<李>涡旋<李>凝胶电泳装置<李>-20°C 冷冻室<李>-80°C 冷冻室<李>摇床/振荡器<李>4°C型冰箱<李>体视显微镜（最好配有教学屏幕或相机）

参考文献

  1. Albertson, R. C., Yelick, P. C. Roles for fgf8 signaling in left-right patterning of the visceral organs and craniofacial skeleton. Dev. Biol. 283, 310-321 (2005).
  2. Aramaki, M., Kimura, T., Udaka, T., Kosaki, R., Mitsuhashi, T., Okada, Y., Takahashi, T., Kosaki, K. Embryonic expression profile of chicken CHD7, the ortholog of the causative gene for CHARGE syndrome. Birth Defects Res A Clin Mol Teratol. 79, 50-57 (2007).
  3. Begemann, G., Schilling, T. F., Rauch, G. J., Geisler, R., Ingham, P. W. The zebrafish neckless mutation reveals a requirement for raldh2 in mesodermal signals that pattern the hindbrain. Development. 128, 3081-3094 (2001).
  4. Brand, M., Heisenberg, C. P., Jiang, Y. J., Beuchle, D., Lun, K., Furutani-Seiki, M., Granato, M., Haffter, P., Hammerschmidt, M., Kane, D. A., Kelsh, R. N., Mullins, M. C., Odenthal, J., van Eeden, F. J., Kane, D. A., Nüsslein-Volhard, C. Mutations in zebrafish genes affecting the formation of the boundary between midbrain and hindbrain. Development. 123, 179-190 (1996).
  5. Clark, M. In situ Hybridization: Laboratory Companion. , Wiley-VCH. (2003).
  6. D'Costa, A., Shepherd, I. T. Zebrafish development and genetics: Introducing undergraduates to developmental biology and genetics in a large introductory laboratory class. Zebrafish. 6, 169-177 (2009).
  7. Emerging Model Organisms: A Laboratory Manual, Volume 1. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2008).
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