寻找导致自闭症和精神分裂症等常见疾病的新生突变的分子遗传学策略。
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摘要
摘要
有多种证据支持de novo突变作为常见疾病（如自闭症和精神分裂症）发病机制的作用。首先，人类的de novo突变率相对较高，因此群体中新突变的发生频率也较高。然而，在大多数常见疾病中尚未报道de novo突变的存在。那些导致严重疾病且表型受到强烈负向选择的基因突变，例如在胚胎期致死或导致生殖适应性下降的突变，不会传递给多个家族成员，因此无法通过连锁基因定位或关联研究检测到。单卵双生子中极高的疾病一致性以及双卵双生子中极低的一致性也强烈支持相当一部分病例可能源于新发突变这一假说。自闭症和精神分裂症即属于此类疾病。其次，尽管存在生殖适应性降低1以及环境因素的高度变异性，某些疾病的发病率在全球范围内仍维持在相对较高且稳定的水平。自闭症和精神分裂症即是如此，其全球发病率约为1%。突变负荷可被视为有害突变受到选择压力（正向或负向）与其通过de novo突变产生速率之间的一种平衡。较低的生育率构成一种负向选择因素，应会减少群体中突变等位基因的数量，最终导致疾病流行率下降。这些选择压力在不同环境中往往强度各异。然而，尽管存在强烈负向选择，这些严重的神经精神障碍在全球不同文化与国家的人群中仍长期维持着相对较高且稳定的患病率2。这在生殖适应性降低的疾病中是难以解释的，除非存在较高的新突变率。最后，父系年龄效应：随着父系年龄增加，疾病风险显著上升，这可能与父亲年龄增长相关的de novo突变累积有关。这一点在自闭症和精神分裂症中已有证实3。男性与女性的突变率之比估计约为4–6:1，推测是由于男性生殖细胞随年龄增长而分裂次数更多所致。因此可以预测，de novo突变更常来源于男性，尤其是年长男性4。较高的新突变率可能部分解释为何迄今为止遗传学研究未能识别出大量与复杂疾病（如自闭症和精神分裂症）相关的易感基因，以及为何仅在人类基因组3%的基因中确认了致病性。要确定de novo突变是否为某种疾病的病因，需要采用有针对性的分子生物学方法，包括对患者及其父母进行研究。本文将以自闭症和精神分裂症为例，阐述判断疾病遗传基础是否部分源于de novo突变的过程，以及建立这种关联的分子研究方法。
方案
1. 选择可能由新生突变引起的疾病
符合以下标准的疾病可能与新生突变假说相吻合：
- 生殖适合度降低。
- 尽管环境差异较大，该疾病的发病率仍相对较高且稳定。
- 该疾病与较高的父系年龄相关。
- 经典的连锁分析和关联研究未能解释该疾病遗传性的显著部分。
- 双生子一致性数据支持新生突变模型。
分析一种常见疾病的可能性 从头合成 突变在一定程度上可以解释其遗传基础，这是至关重要的第一步。
2. 病例与DNA样本的选择
选择合适的样本对于成功鉴定至关重要 从头合成 突变。为了最大限度地提高发现新发突变的概率，我们建议采取以下措施：
- 选择发病年龄早、表型严重、父母未受累、父亲年龄较大且无扩展家族病史的病例。
- 选择其可用DNA足以开展研究的患者。尤其关键的是需获得未经培养的原代细胞来源的DNA（例如 Blood DNA 或 saliva DNA）。
- 必须获得患者双亲的DNA，以确定突变的传递状态（遗传性 vs. 新发突变）。在鉴定出候选基因后，还需具备其他患病队列和正常对照样本，以进行遗传学验证研究。
- 根据突变率、待筛查基因数量以及估计由de novo突变导致的病例比例，来估算样本量。
3. 基因重测序；两种主要方法
- 高质量低通量测序
该方法基于候选基因策略。- 候选基因的选择
根据基于六个主要标准的评分系统，选择最佳候选基因。然后计算总分，即使用表1中列出的六项标准所赋予的所有分数之和。参见图1中我们项目中被选中与未被选中基因分布的示例。
表1. 候选基因选择所用标准
图1. 显示本项目中用于测序的被选中与未被选中基因分布的图表。我们根据基因的评分值进行排序，得到按候选特性分级的基因分布。例如，SHANK3 和 NRXN1 基因是我们发现存在de novo突变的两个基因，其评分分别为7和6（满分为12）。 - 通过 Exonprimer 使用 Primer3 软件设计引物。仅需覆盖编码区和剪接位点，并在每个外显子两侧额外包含50个碱基对。
- 优化PCR条件，包括Taq酶的选择、反应体积等。
- 对所有PCR片段进行优化。
- 按照标准操作程序，扩增从血液样本中提取的5 ng基因组DNA。
- 在送测序前，通过上样2%琼脂糖凝胶对PCR产物进行质量控制。随机选取部分样本进行检测。
- 在DNA分析仪上对PCR产物进行单链测序。若超过90%的测序峰图可被分析，则认为该片段测序成功。此标准适用于大规模筛查。
- 变异检测
- 使用PolyPhred、Polyscan和Mutation Surveyor等工具进行基因组变异的检测与基因分型。理想情况是联合使用两种以上检测工具。例如，PolyPhred v.5 和 PolyPhred v.6 在默认设置下检测到的变异并不完全相同。Polyscan v.3 对SNP的假阳性突变率较高（96%），对INDEL则较低（93%）。PolyPhred v.6 未能检测到大多数真实的INDEL，但其INDEL假阳性率总体低于Polyscan v.3（90%）。因此，应关闭Polyscan v.3 的SNP检测选项，同时保留PolyPhred v.5 和 PolyPhred v.6 用于变异检测。Mutation Surveyor 和 Polyscan 更适合检测插入缺失（indel）。注意：使用Polyscan时不应启用SNP检测选项，仅应开启“indel”选项，因为Polyscan在SNP检测中会产生过多假阳性结果。
- 对于检测到的每一个独特的新型外显子变异，需通过正向和反向引物重新扩增该片段，并对先证者及其父母重新测序，以人工确认其真实性，排除任何技术性假象。
- 候选基因的选择
- 全外显子组测序
该方法是一种高通量测序技术，靶向人类基因组中大多数编码区域。目前我们实验室正在使用这一新技术，以加速潜在候选基因的发现。- 订购Agilent公司设计的“SureSelect Human All Exon”试剂盒，该试剂盒靶向超过16,000个基因的编码区（约50 MB基因组区域），或选择Roche等公司类似的其他产品。在订购捕获试剂盒前，应确定测序平台（Illumina vs SOLiD）。
- 按照Agilent公司的实验方案进行捕获。
- 在各自可用的下一代测序平台上对产物进行测序。
- 从全外显子组测序中进行变异检测：已有多种可用于下一代测序平台的基因组变异检测与基因分型的生物信息学工具，如BWA、Bfast、Bioscope用于序列比对；之后还需使用其他免费的下游分析工具（例如SAMtools、VarScan、Annovar）进行变异识别与注释。此外，也有整合了序列比对、变异识别与注释功能的商业软件可供使用，如NextGEN（Softgenetics）、CLC Bio等。
4. 基因组变异优先级排序
随后应根据变异体为新生突变且对蛋白质或mRNA的功能和/或结构具有有害影响的可能性，对其进行优先级排序，以确定后续验证的顺序。检测新生突变时，变异体后续验证的优先级应遵循以下原则：
- 独特变异（在单个病例中仅观察到一次）
- 在父母中未发现的变异
- 蛋白质截短型变异：无义突变、导致移码的插入缺失突变以及剪接位点突变。
- 预测对功能具有破坏性的错义变异和同义变异（例如影响mRNA剪接）。使用Polyphen、SIFT和PANTHER工具预测变异对蛋白质功能的影响。
若采用全外显子组测序，可利用候选基因筛选作为优先选择变异位点以进行深入研究的策略。
5. 遗传学验证
- 在其他患者病例和对照样本中对整个基因进行重新测序（以鉴定其他致病性突变），对照样本将用于评估优先突变的等位基因频率。若某个基因在不同患者中发现至少两个不同的新生有害突变（无义突变、剪接突变、移码突变以及预测为有害的错义突变），且这些突变在对照样本或公共数据库中均未出现，则该基因应被高度优先考虑进行进一步验证研究。具体包括：1）在源自患者的淋巴母细胞系中检测是否存在潜在的剪接缺陷；根据我们的经验，大多数基因均可从淋巴母细胞系中扩增出RT-PCR产物；2）通过定量Western blot分析来自淋巴母细胞系的蛋白提取物，检测蛋白表达水平是否发生改变；3）如我们课题组此前所做（例如：5,6），在动物模型（c elegans、斑马鱼）和细胞系模型中对该突变/基因进行功能水平的进一步验证。
6. 代表性结果：
通过本方案，我们成功鉴定了精神分裂症和自闭症的新基因。其中一个例子是近期发现的SHANK3基因（图2）。在SHANK3基因中发现了两种不同的新生突变：一种是在三名患病兄弟中发现的无义突变，另一种是在一名患病女性中发现的错义突变。
图 2. (A) 家族 PED 419 中三位患病兄弟中 R1117X 无义突变的分离情况。先证者以箭头标示。(B) 家族 PED 56 中，先证者携带 R536W 错义突变，而其未患病的兄弟则不携带该突变。
讨论
此处所述方案旨在识别可能部分源于新生突变的特定常见疾病，并验证这一假设。新生突变是多种疾病发生的确立机制之一，例如遗传性癌症综合征，但在常见疾病中的研究仍较为有限。这部分归因于识别新生突变所涉及的技术挑战，该过程需要对大量DNA进行测序，而直到近期随着高通量测序技术的出现，此类测序才变得具有成本效益。此外， 从头合成 直到最近，人类的突变率仍仅为估算值。仅在最近才有研究直接测定了人类的突变率。在此类测量出现之前，很难预测开展此类研究所需的样本量，也难以判断所观察到的现象 从头合成 突变率高于基线水平。对候选基因测序还是全基因组测序？由于大多数已报道的致病突变均为错义/无义突变以及剪接位点突变（根据HGMD网站数据），我们的筛查策略可识别超过68%的已知突变。此外，氨基酸替换的严重程度与临床表型出现的可能性之间存在明确关联。与保守性氨基酸替换相比，无义突变在临床上表现出表型的可能性高出9.0倍7。因此，目前对候选基因进行测序是最具成本效益的策略。
所概述实验方案的成功取决于若干关键步骤，本文通过自闭症和精神分裂症两个示例对这些步骤进行了详细说明和图示。在实施过程中存在诸多需要避免的陷阱，例如疾病的选择、受试患者的筛选、DNA来源，以及如何高效识别新生突变（de novo mutations）的具体细节。我们提供了一种方法，可最高效地确定任何疾病中由此类自发突变所导致病例的比例。
致谢
我们感谢基因组加拿大（Genome Canada）、魁北克基因组学联合会（Génome Québec）和蒙特利尔大学的资金支持，同时也感谢加拿大创新基金会对我们的“从突触到疾病”（Synapse to Disease，S2D）项目提供的资助。
参考文献
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