在发育过程中，微环境（niche）和干细胞如何形成是一个具有实际意义的重要问题。Drosophila 卵巢中的生殖系干细胞及其体细胞微环境在幼虫发育阶段形成。本视频演示了如何解剖、染色并封片晚期三龄（LL3）Drosophila 雌性幼虫的生殖腺。
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摘要
摘要
许多器官在胚胎发育过程中依赖干细胞形成，并在成体生命阶段依赖干细胞进行维持或修复。因此，了解干细胞如何形成以及它们如何与所处环境相互作用，对于理解发育、稳态及疾病至关重要。果蝇Drosophila melanogaster的卵巢已成为研究生殖系干细胞（GSCs）与其体细胞支持细胞（微环境）相互作用的重要模型1, 2。由于该系统中微环境和生殖系干细胞的位置明确，并且具备对其进行遗传操作的能力，研究人员已借此阐明了干细胞与其微环境之间多种多样的相互作用机制3-12。
尽管关于控制生殖干细胞（GSC）维持和分化的机制已有大量研究，但对于GSC及其体细胞微环境在发育过程中如何形成，目前了解仍相对较少。大约18个体细胞微环境在三龄幼虫期形成，其细胞组分包括末端丝和帽细胞（图1）13-17。GSC起源于原始生殖细胞（PGCs）。PGCs在幼虫早期阶段发生增殖，但在微环境形成之后，一部分PGCs会转变为GSC7, 16, 18, 19。体细胞微环境细胞与GSC共同构成一个功能单位，能够在生物体整个生命周期中持续产生卵子。
关于生殖干细胞（GSC）单位形成的许多问题仍未得到解答。例如，生态位前体细胞与干细胞前体细胞之间的协调，或原始生殖细胞（PGCs）转变为GSC过程中不对称性的产生，这些过程在幼虫中进行研究最为理想。然而，对幼虫卵巢发育进行系统性研究在操作上具有挑战性。首先，幼虫卵巢体积微小，即使在三龄晚期（LL3），其直径也仅有100μm。此外，卵巢呈透明状，且嵌于白色的脂肪体中。本文中，我们描述了一种从三龄晚期（LL3）Drosophila 幼虫中分离卵巢并进行荧光抗体染色的逐步实验方案。我们提供了一些技术性解决方案，以应对诸如卵巢定位困难、组织染色和洗涤时漂浮不沉、以及确保抗体充分渗透入组织等问题。该方案同样适用于更早期的幼虫阶段以及幼虫精巢的研究。
方案
1. 产卵
- 解剖前五天：让交配后的雌蝇在添加了酵母的新鲜培养基上产卵 2-4 小时。为了获得同步化且发育良好的幼虫，必须避免培养环境过于拥挤（每支 25 mm 试管中约 30 枚卵）。通常每支试管使用 7-16 只雌蝇，具体数量取决于其产卵能力。
2. 选择幼虫
- 准备一个9孔玻璃解剖皿，加入林格氏液（128 mM NaCl, 2 mM KCl, 1.8 mM CaCl2, 4 mM MgCl2, 35.5 mM 蔗糖, 5 mM Hepes，pH 6.9）。
- 在六孔板中加入林格氏液，并放入细胞筛网，置于冰上。或者，我们使用特制的带有尼龙网的模具。
- 用精细的生物镊子（镊子）从培养瓶壁上挑选特定发育时期的幼虫，并将其放入盛有林格氏液的解剖皿中。
- 将一只雌性幼虫转移至一个干净的孔中。我们通过性腺来区分雌雄。雄性睾丸位于脂肪体后三分之一处，呈较大的透明椭圆形，易于识别；雌性卵巢位于脂肪体相同区域，呈更小的透明圆球状，可据此识别。
3. 幼虫解剖
- 用镊子固定幼虫脑部后方位置，并用另一把镊子去除头部。
- 将剩余的后部身体置于背侧，使气管朝下。
- 用一把镊子夹住幼虫的后气门，缓慢向内推压，同时用另一把镊子向后滑动表皮，直至约一半的幼虫脂肪体露出。
- 牢固夹住后端，用另一把镊子松松夹住表皮。轻柔而缓慢地拉开后端，使表皮及其附着的肠道穿过间隙滑出。此过程结束时，脂肪体应已完全与肠道和表皮分离。将肠道与脂肪体前部断开。为便于后续染色和封片，需确保脂肪体保持完整。
- 用任氏液充分润湿巴斯德移液管，最好使用盛有已解剖幼虫的孔中的液体。这有助于润湿移液管内壁，防止脂肪体粘附。用巴斯德移液管将脂肪体转移至细胞滤网中的冰冻任氏液中。
4. 固定与染色
所有步骤均在室温下进行，一抗孵育步骤除外，该步骤在 4 °C 下进行。
- 在林格氏液中加入5%甲醛，将脂肪体置于其中，在轻柔振荡条件下孵育20分钟。
- 用1% PBT（含1% Triton X-100的PBS）洗涤5分钟。重复此步骤，分别持续10分钟和45分钟。 1% Triton X-100的作用是穿透幼虫卵巢组织，使抗体能够进入。
- 用含0.3% Triton X-100和1% BSA的PBS溶液（PBTB）在轻度振荡条件下封闭1小时
- 孵育所需的1st 抗体用0.3% PBTB稀释后4℃孵育过夜 4°C 轻柔振荡。此步骤通常在0.2 ml离心管中于滚轴上进行。
- 将脂肪体转移回细胞筛网。
- 用0.3% PBTB轻柔振荡洗涤3次，每次30分钟。
- 用含5%正常驴血清的0.3% PBTB封闭液，在轻度振荡条件下封闭1小时。
- 在封闭液（0.3% PBTB 加入 5% 正常驴血清的 0.3% PBT 溶液）中按生产商说明书稀释适当的二抗，室温轻柔振荡孵育 2 小时。若使用荧光标记抗体，自此步骤起需避光操作。该步骤通常在 0.2 ml 离心管中于滚转仪上进行。
- 用含0.3% PBT的溶液轻柔振荡洗涤3次，每次30分钟。
5. 封片
- 将脂肪体转移至一个干净的离心管中。非常小心地去除所有液体，并立即用Vectashield封片剂覆盖。我们常规使用Vectashield，因为在分离脂肪体中的卵巢时，该封片剂不会硬化。
样品可在封片剂中于4°C下保存长达一周时间。 - 剪去移液器吸头的尖端，用其小心地将脂肪体连同最小体积的封片剂（约30 μl，适用于30 mm的盖玻片）转移至显微镜载玻片上。
- 使用两个镀镍的持针器，夹持直径为0.1 mm的细针，将脂肪体展开。卵巢位于脂肪体的后三分之一区域。包裹卵巢的脂肪体通常呈“花朵”状，有助于识别卵巢的位置。从其余脂肪体中解剖出这些“花朵”结构，并弃去其他部分。
- 通过将两根细针在其周围小心交叉，去除包裹性腺的脂肪体。将分离出的性腺置于载玻片上远离脂肪体残留物的位置。
- 盖上盖玻片，并用指甲油封固。
- 直接使用共聚焦显微镜观察。样品可在4°C下保存长达三周。
6. 代表性结果
我们已采用上述方案追踪体细胞卵巢内多种细胞谱系的建立过程，包括生殖干细胞（GSCs）及其体细胞微环境。为此，我们使用特异性抗体和标记物来区分发育中性腺内的不同细胞类型。此处展示了两个LL3期卵巢组织样本，分别用不同组合的抗体进行染色的结果。图1A突出显示了末端丝和帽细胞（绿色），二者共同构成微环境中的体细胞成分。图1B显示了混合细胞（ICs，品红色），它们与生殖细胞（蓝色）直接接触。
图1. LL3期卵巢。（A）单克隆抗体1B1（品红色）标记体细胞轮廓，并染色原始生殖细胞（PGC）内的细胞器——合胞体（箭头所示）。增强子捕获系hh-lacZ（抗β-半乳糖苷酶，绿色）在末端丝状结构中表达。在丝状结构基部可见体细胞帽细胞（箭头所示）。（B）1B1抗体（绿色）标记卵巢中所有体细胞。抗Vasa抗体（蓝色）标记所有原始生殖细胞。原始生殖细胞直接与中间细胞（ICs，抗traffic jam，品红色）接触。标尺（适用于A和B）为20 μm。
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讨论
本视频演示了三龄晚期幼虫卵巢的分离与染色实验方案。为了常规且可靠地执行该方案，需注意以下几点：
- 为获得同步且发育良好的幼虫，必须避免过度拥挤。
- 为防止丢失微小且半透明的卵巢，请确保完整解剖脂肪体。这也有助于在制片阶段定位卵巢，尤其是在处理较年轻（二龄或三龄初期）卵巢时。
- 为同时处理多个样本，可使用细胞筛网或其他装置。
- 确保样本始终不干燥。
- 我们使用高质量的体视显微镜进行制片。通过使用带单侧暗场的透射光源底座，可以找到合适的条件，使半透明的卵巢与白色的脂肪体之间形成良好对比，从而便于发现和操作卵巢。
- 制片完成后，应避免反复的温度变化，否则会导致抗体解离，降低染色质量。
该方案也可应用于较早的幼虫阶段，但此时脂肪体更为脆弱且黏性更强，使得操作相对复杂。建议先练习三龄晚期幼虫的解剖。
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
IM 受到玛丽·居里再融合基金的资助。本工作受到以色列科学基金资助项目编号 1146/08、魏茨曼科学研究所海伦与马丁·基梅尔干细胞研究所及莱尔慈善基金会的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| NaCl | JT Baker | ||
| Kcl | Merck & Co., Inc. | ||
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | ||
| MgCl2 | Merck & Co., Inc. | ||
| 蔗糖 | JT Baker | ||
| Hepes | Sigma-Aldrich | ||
| PBS | Sigma-Aldrich | ||
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | ||
| 牛血清白蛋白 V 级 | MP Biomedicals | 160069 | |
| Dumont 生物镊子 5 号，抛光 | Fine Science Tools | 11295-10 | |
| 镍镀层针具夹持器 | Fine Science Tools | 26018-17 | |
| 不锈钢显微针，直径 0.1 mm，长 10 mm | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| 9 孔板，85×100 mm，外径 22 mm × 深 7 mm | Corning | 7220-85 | |
| 配备标准透射光源 TL ST 的立体显微镜 MZ 16.5 | Leica Microsystems | ||
| 6 孔板 | Costar | 3516 | |
| 载玻片 | Menzel-Glaser | 798 | |
| 盖玻片 | Corning | 2940-223 | |
| 封片介质 | Vectashield | H-1200 | |
| 细胞滤网 | Falcon BD | FAL352350 | |
| 1B1 抗体 | 发育研究杂交瘤库 | ||
| 抗 Traffic Jam 抗体 | Dorothea Godt 博士实验室 | ||
| 抗 Vasa 抗体 | Ruth Lehmann 博士实验室 | ||
| 抗 β-半乳糖苷酶 | Cappel | ||
| 二抗 | Jackson ImmunoResearch |
参考文献
- Fuller, M. T., Spradling, A. C. Male and female Drosophila germline stem cells: two versions of immortality. Science. 316, 402-404 (2007).
- Li, L., Xie, T. Stem cell niche: structure and function. Annual review of cell and developmental biology. 21, 605-631 (2005).
- Chen, D., McKearin, D. Gene circuitry controlling a stem cell niche. Curr Biol. 15, 179-184 (2005).
- Kai, T., Spradling, A. An empty Drosophila stem cell niche reactivates the proliferation of ectopic cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 4633-4638 (2003).
- Kai, T., Spradling, A. Differentiating germ cells can revert into functional stem cells in Drosophila melanogaster ovaries. Nature. 428, 564-569 (2004).
- Lopez-Onieva, L., Fernandez-Minan, A., Gonzalez-Reyes, A. Jak/Stat signalling in niche support cells regulates dpp transcription to control germline stem cell maintenance in the Drosophila ovary. Development. 135, 533-540 (2008).
- Song, X., Zhu, C. H., Doan, C., Xie, T. Germline stem cells anchored by adherens junctions in the Drosophila ovary niches. Science. 296, 1855-1857 (2002).
- Tazuke, S. I. A germline-specific gap junction protein required for survival of differentiating early germ cells. Development. 129, 2529-2539 (2002).
- Xie, T., Spradling, A. C. decapentaplegic is essential for the maintenance and division of germline stem cells in the Drosophila ovary. Cell. 94, 251-260 (1998).
- Xie, T., Spradling, A. C. A niche maintaining germ line stem cells in the Drosophila ovary. Science. , 290-328 (2000).
- Guo, Z., Wang, Z. The glypican Dally is required in the niche for the maintenance of germline stem cells and short-range BMP signaling in the Drosophila ovary. Development. 136, 3627-3635 (2009).
- Wang, X., Harris, R. E., Bayston, L. J., Ashe, H. L. Type IV collagens regulate BMP signalling in Drosophila. Nature. 455, 72-77 (2008).
- Godt, D., Laski, F. A. Mechanisms of cell rearrangement and cell recruitment in Drosophila ovary morphogenesis and the requirement of bric a brac. Development. 121, 173-187 (1995).
- Sahut-Barnola, I., Godt, D., Laski, F. A., Couderc, J. L. Drosophila ovary morphogenesis: analysis of terminal filament formation and identification of a gene required for this process. Developmental biology. 170, 127-135 (1995).
- Song, X., Call, G. B., Kirilly, D., Xie, T. Notch signaling controls germline stem cell niche formation in the Drosophila ovary. 134, 1071-1080 (2007).
- Zhu, C. H., Xie, T. Clonal expansion of ovarian germline stem cells during niche formation in Drosophila. Development. 130, 2579-2588 (2003).
- Ward, E. J. Stem cells signal to the niche through the Notch pathway in the Drosophila ovary. Curr Biol. 16, 2352-2358 (2006).
- Gilboa, L., Lehmann, R. Repression of primordial germ cell differentiation parallels germ line stem cell maintenance. Curr Biol. 14, 981-986 (2004).
- Gilboa, L., Lehmann, R. Soma-germline interactions coordinate homeostasis and growth in the Drosophila gonad. Nature. 443, 97-100 (2006).
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