在发育过程中，微环境（niche）和干细胞如何形成是一个具有实际意义的重要问题。Drosophila 卵巢中的生殖系干细胞及其体细胞微环境在幼虫发育阶段形成。本视频演示了如何解剖、染色并封片晚期三龄（LL3）Drosophila 雌性幼虫的生殖腺。
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摘要
摘要
许多器官在胚胎发育过程中依赖干细胞形成，并在成体生命阶段依赖干细胞进行维持或修复。因此，了解干细胞如何形成以及它们如何与所处环境相互作用，对于理解发育、稳态及疾病至关重要。果蝇Drosophila melanogaster的卵巢已成为研究生殖系干细胞（GSCs）与其体细胞支持细胞（微环境）相互作用的重要模型1, 2。由于该系统中微环境和生殖系干细胞的位置明确，并且具备对其进行遗传操作的能力，研究人员已借此阐明了干细胞与其微环境之间多种多样的相互作用机制3-12。
尽管关于控制生殖干细胞（GSC）维持和分化的机制已有大量研究，但对于GSC及其体细胞微环境在发育过程中如何形成，目前了解仍相对较少。大约18个体细胞微环境在三龄幼虫期形成，其细胞组分包括末端丝和帽细胞（图1）13-17。GSC起源于原始生殖细胞（PGCs）。PGCs在幼虫早期阶段发生增殖，但在微环境形成之后，一部分PGCs会转变为GSC7, 16, 18, 19。体细胞微环境细胞与GSC共同构成一个功能单位，能够在生物体整个生命周期中持续产生卵子。
关于生殖干细胞（GSC）单位形成的许多问题仍未得到解答。例如，生态位前体细胞与干细胞前体细胞之间的协调，或原始生殖细胞（PGCs）转变为GSC过程中不对称性的产生，这些过程在幼虫中进行研究最为理想。然而，对幼虫卵巢发育进行系统性研究在操作上具有挑战性。首先，幼虫卵巢体积微小，即使在三龄晚期（LL3），其直径也仅有100μm。此外，卵巢呈透明状，且嵌于白色的脂肪体中。本文中，我们描述了一种从三龄晚期（LL3）Drosophila 幼虫中分离卵巢并进行荧光抗体染色的逐步实验方案。我们提供了一些技术性解决方案，以应对诸如卵巢定位困难、组织染色和洗涤时漂浮不沉、以及确保抗体充分渗透入组织等问题。该方案同样适用于更早期的幼虫阶段以及幼虫精巢的研究。
方案
1. 产卵
- 解剖前五天：让交配后的雌蝇在添加了酵母的新鲜培养基上产卵 2-4 小时。为了获得同步化且发育良好的幼虫，必须避免培养环境过于拥挤（每支 25 mm 试管中约 30 枚卵）。通常每支试管使用 7-16 只雌蝇，具体数量取决于其产卵能力。
2. 选择幼虫
- 准备一个9孔玻璃解剖皿，加入林格氏液（128 mM NaCl, 2 mM KCl, 1.8 mM CaCl2, 4 mM MgCl2, 35.5 mM 蔗糖, 5 mM Hepes，pH 6.9）。
- 在六孔板中加入林格氏液，并放入细胞筛网，置于冰上。或者，我们使用特制的带有尼龙网的模具。
- 用精细的生物镊子（镊子）从培养瓶壁上挑选特定发育时期的幼虫，并将其放入盛有林格氏液的解剖皿中。
- 将一只雌性幼虫转移至一个干净的孔中。我们通过性腺来区分雌雄。雄性睾丸位于脂肪体后三分之一处，呈较大的透明椭圆形，易于识别；雌性卵巢位于脂肪体相同区域，呈更小的透明圆球状，可据此识别。
3. 幼虫解剖
- 用镊子固定幼虫脑部后方位置，并用另一把镊子去除头部。
- 将剩余的后部身体置于背侧，使气管朝下。
- 用一把镊子夹住幼虫的后气门，缓慢向....
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讨论
本视频演示了三龄晚期幼虫卵巢的分离与染色实验方案。为了常规且可靠地执行该方案，需注意以下几点：
- 为获得同步且发育良好的幼虫，必须避免过度拥挤。
- 为防止丢失微小且半透明的卵巢，请确保完整解剖脂肪体。这也有助于在制片阶段定位卵巢，尤其是在处理较年轻（二龄或三龄初期）卵巢时。
- 为同时处理多个样本，可使用细胞筛网或其他装置。
- 确保样本始终不干燥。
- 我们使用高质量的体视显微镜进行制片。通过使用带单侧暗场的透射光源底座，可以找到合适的条件，使半透明的卵巢与白色的脂肪体之间形成良好对比，从而便于发现和操作卵巢。
- 制片完成后，应避免反复的温度变化，否则会导致抗体解离，降低染色质量。
该方案也可应用于较早的幼虫阶段，但此时脂肪体更为脆弱且黏性更强，使得操作相对复杂。建议先练习三龄晚期幼虫的解剖。
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
IM 受到玛丽·居里再融合基金的资助。本工作受到以色列科学基金资助项目编号 1146/08、魏茨曼科学研究所海伦与马丁·基梅尔干细胞研究所及莱尔慈善基金会的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| NaCl | JT Baker | ||
| Kcl | Merck & Co., Inc. | ||
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | ||
| MgCl2 | Merck & Co., Inc. | ||
| 蔗糖 | JT Baker | ||
| Hepes | Sigma-Aldrich | ||
| PBS | Sigma-Aldrich | ||
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | ||
| 牛血清白蛋白 V 级 | MP Biomedicals | 160069 | |
| Dumont 生物镊子 5 号，抛光 | Fine Science Tools | 11295-10 | |
| 镍镀层针具夹持器 | Fine Science Tools | 26018-17 | |
| 不锈钢显微针，直径 0.1 mm，长 10 mm | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| 9 孔板，85×100 mm，外径 22 mm × 深 7 mm | Corning | 7220-85 | |
| 配备标准透射光源 TL ST 的立体显微镜 MZ 16.5 | Leica Microsystems | ||
| 6 孔板 | Costar | 3516 | |
| 载玻片 | Menzel-Glaser | 798 | |
| 盖玻片 | Corning | 2940-223 | |
| 封片介质 | Vectashield | H-1200 | |
| 细胞滤网 | Falcon BD | FAL352350 | |
| 1B1 抗体 | 发育研究杂交瘤库 | ||
| 抗 Traffic Jam 抗体 | Dorothea Godt 博士实验室 | ||
| 抗 Vasa 抗体 | Ruth Lehmann 博士实验室 | ||
| 抗 β-半乳糖苷酶 | Cappel | ||
| 二抗 | Jackson ImmunoResearch |
参考文献
- Fuller, M. T., Spradling, A. C. Male and female Drosophila germline stem cells: two versions of immortality. Science. 316, 402-404 (2007).
- Li, L., Xie, T. Stem cell niche: structure and function. Annual review of cell and developmental biology. 21<....
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