一种测量果蝇乙醇敏感性的简便方法

摘要

本文描述了一种基于翻正反射消失来测量乙醇对Drosophila果蝇镇静作用的简单检测方法。

摘要

低剂量乙醇会使果蝇变得过度活跃，而高剂量则具有镇静作用。特定品系果蝇对乙醇诱导镇静的敏感性与其对乙醇的偏好性相关，因此镇静效应是研究酒精反应和饮酒行为遗传机制的高度相关指标。我们展示了一种简单的方法，用于使果蝇接触乙醇并测量其醉酒效应。本实验方法可测定急性敏感性，以及重复暴露所诱导的乙醇耐受性。该方法无需复杂的技术设备，因此可在任何具备基本果蝇培养工具的实验室中应用。

方案

1. 构建暴露室

1. 使用剃刀刀片将一个瓶塞切成两半。或者，使用棉球。
2. 将瓶塞的一半或棉球推入食物瓶底部，形成一个光滑的表面，防止果蝇被困住。
3. 如果制备多个暴露室，请确保每个室中瓶塞和食物所占体积相同。可在瓶壁上做标记以方便操作。

2. 暴露果蝇

1. 在暴露前一天，将8只同性别、日龄为1-5天的果蝇收集到不含酵母的普通食物试管中。
2. 使用代码标记，使实验操作者对所用的实际基因型/品系保持盲态。
3. 通过轻弹将8只果蝇转移至暴露装置中。切勿麻醉果蝇。
4. 向纯乙醇（200 proof ethanol）中加入少量食用染料，例如酸性蓝9（acid blue 9），以便于观察。
5. 用0.5 ml乙醇涂抹在试管塞底部或棉球上。
6. 将含乙醇的塞子插入暴露试管中，确保乙醇面朝向试管内部，而非试管壁方向。
7. 启动计时器，开始累计计时。

3. 记录乙醇诱导的中毒反应

1. 计时开始后，每过一分钟，轻敲暴露室以惊动果蝇，并观察其十秒钟。
2. 记录每分钟内静止不动的果蝇数量。若果蝇无法翻身、停留在原地不动，或在整个十秒观察期间持续快速振动翅膀，则视为静止状态。后者被视为静止，是因为绝大多数此类果蝇在快速振翅的间歇期间实际处于静止状态。若果蝇能够翻身并行走离开，或沿试管壁向上爬行，则不视为静止。
3. 当记录到有4只或更多果蝇处于静止状态时，即结束一次暴露实验。
4. 丢弃使用过的果蝇，并将暴露室通风，以备后续重复使用。

4. 确定达到50%镇静所需时间

50%果蝇发生镇静的时间（ST50）是指在乙醇暴露开始后，八只果蝇中有四只保持静止不动的时间点。该时间点按以下方法确定：
或者：首次恰好有四只果蝇静止不动的测量分钟。
或者：若在某一时间点（第X分钟）静止不动的果蝇少于四只（Y1），而在下一个测量时间点（第X+1分钟）静止不动的果蝇多于四只（Y2），则使用以下公式进行线性插值计算ST50：
ST50 = (4 - Y1)/(Y2 - Y1) + X

5. 重复暴露以确定耐受性

暴露果蝇

1. 测定实验中所用野生型对照品系的 ST50(wt)。
2. 按照上述方法将实验组果蝇暴露于乙醇。
3. 测定其 ST50(1)，但继续暴露至达到 2×ST50(wt) 的时间点。
4. 将果蝇转移回空的食物小瓶中，静置 4 小时。
5. 再次暴露果蝇，并测定第二次暴露的 ST50(2)。

确定耐受性

以 (ST50(2)/ ST50(1) - 1)×100 计算耐受性的百分比。

6. 代表性结果：

此处展示的是我们每种基因型和剂量使用6-8管果蝇获得的一些代表性结果。如果您的标准误差明显较大，则可能出现了系统性问题。请确保乙醇面向暴露室，并且各暴露室的体积相同。

图 1. 野生型果蝇在不同浓度乙醇暴露下的剂量反应曲线。每种剂量和性别均使用八个试管的果蝇进行实验。雄性和雌性果蝇在各剂量下的 ST50 无显著差异（p>0.22，双因素方差分析），而随着乙醇剂量的增加，不同剂量间的 ST50 显著降低（p<0.001）。需注意，过于拥挤的培养瓶中的果蝇体型可能明显小于健康培养瓶中的个体，这种体型差异可能影响 ST50。为获得每瓶最佳的幼虫密度，建议每瓶接种 15–20 只雌蝇，产卵 1–2 天。

图2. 将果蝇暴露于90%或100%乙醇可重现此前报道的由white rabbit1突变2引起的乙醇抗性（p<0.001，双因素方差分析）。

图3. 间隔4小时恢复期的两次100%乙醇重复暴露，导致第二次暴露后ST50显著增加（p<0.001，配对t检验）。注意，果蝇在第一次暴露时的处理时间为24分钟（相当于其初始ST50的两倍）。较短时间的暴露（12分钟）在再次暴露时未引起ST50的显著增加（数据未显示）。

讨论

在本演示中，我们概述了一种基于Bainton等（2000）¹和Rothenfluh等（2006）²先前所描述方法的简单方案，用于测定乙醇诱导的中毒状态。由于酒精引起的镇静效应与饮酒偏好相关³，该实验方法对于研究酒精使用障碍具有重要意义。所述实验基于惊吓诱发的负向趋地性行为，以及酒精暴露对该先天行为反应的干扰作用。在开始暴露处理前，需确保所有果蝇对该惊吓刺激表现出正常反应，即：轻敲盛有果蝇的食物管使其沉降至管底后，在10秒观察时间内所有果蝇均应自底部向上移动。表现出负向趋地性减弱的果蝇实例包括对机械冲击敏感的癫痫突变体⁵，以及因多巴胺能神经元退化而导致运动能力缺陷的果蝇⁶。

尽管所述实验方法相对简单，但有两个变量需要特别注意，以确保结果的可重复性。首先，所有暴露小瓶的体积应保持一致。这包括确保小瓶底部的食物与瓶塞/棉球所占体积相同，以及将含乙醇的棉塞插入每个小瓶的深度保持一致。虽然该实验可使用完全空的小瓶，但这会导致ST50值延长，从而降低实验通量。

该实验方法也适用于测定果蝇在反复暴露于乙醇后所产生的耐受程度。进行反复暴露实验时，应考虑多个变量。首先，本实验中两次暴露之间的间隔时间为4小时。该变量可以调整，但我们建议间隔时间不应短于2小时，以确保第一次暴露中的乙醇得以充分清除。有关乙醇耐受形成与消退的动力学，请参见 Scholz 等人 2000⁴。第二个需要考虑的变量是首次暴露的持续时间。显然，对照组和实验组果蝇的暴露时间必须相同。然而，这并不一定意味着两种果蝇品系实际摄入的乙醇量相同。被麻醉的果蝇比活跃的果蝇吸收更多的乙醇²，因此较早进入麻醉状态的品系可能比较晚麻醉的品系接受更高剂量的乙醇，从而因初始剂量较高而表现出更强的耐受性。因此，当比较在初始ST50(1)值上存在差异的果蝇品系时，我们强烈建议读者谨慎解读其耐受性发展结果。

本文所述的实验方法是一种简便且可重复地测定果蝇对酒精行为反应的有效工具。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
暴露小瓶	www.flystuff.com	32-116
塞子	www.flystuff.com	49-102
酸性蓝 9	Sigma-Aldrich	861146