本文描述了在活体动物中进行细菌感染生物发光成像的方法。通过改造病原体使其表达荧光素酶，从而实现对活体动物体内感染的光学整体成像。可利用表达荧光素酶的病原体感染动物模型，并通过生物发光成像实时观察疾病的发展过程。
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摘要
摘要
成像是一种可用于监测生物过程的重要技术。特别是，可以在活体动物体内实时追踪癌细胞、干细胞、特定免疫细胞类型、病毒病原体、寄生虫和细菌的存在1-2。与动物模型中分析感染的传统策略相比，将生物发光成像应用于病原体研究具有诸多优势3-4。感染可在同一只动物体内随时间推移被连续可视化观察，无需通过安乐死来确定病原体的位置和数量。光学成像能够对所有组织和器官进行全面检查，而非仅限于已知先前受感染部位的取样。此外，在继续实验前，可直接确认病原体是否成功接种至特定组织，从而排除接种失败的动物。由于成像技术可对每只动物进行个体化追踪，因此可有效控制动物间的个体差异。成像技术有望显著减少所需实验动物数量，因其能够在多个时间点获取数据，而无需通过组织取样来测定病原体载量3-4。
本实验方案描述了利用生物发光成像技术对表达荧光素酶的重组细菌菌株进行活体动物感染可视化的方法。荧光甲虫（CBRLuc）和萤火虫荧光素酶（FFluc）以荧光素为底物5-6。CBRluc 和 FFluc 产生的光波长范围广泛，介于 500 nm 至 700 nm 之间，因此这些荧光素酶非常适合作为活体动物模型光学成像的报告分子7-9。这主要是因为波长大于 600 nm 的光可避免被血红蛋白吸收，从而更有效地穿透哺乳动物组织。通过基因工程手段将荧光素酶导入细菌，使其产生可检测的发光信号10。通过气管内接种的方式将生物发光细菌接种至小鼠肺部，以实现实时监测感染过程。注射荧光素后，使用 IVIS 成像系统采集图像。成像过程中，采用 XGI-8 气体麻醉系统以异氟烷对小鼠进行麻醉。所获得的图像可用于定位和定量发光信号源，分别代表细菌感染部位及细菌数量。成像结束后，对匀浆组织进行菌落形成单位（CFU）测定，以确认细菌的存在。通过使用多种剂量的细菌，建立细菌数量与发光强度之间的相关性。该成像技术可用于病原机制研究以及抗菌化合物和疫苗疗效的评估。
方案
1. 经气管插管进行肺部感染
- 称重小鼠，必要时可在耳朵上做标记以便于识别。
- 通过腹腔注射给予氯胺酮（100 μg 每克小鼠体重）和赛拉嗪（10 μg 每克小鼠体重）以麻醉小鼠。
- 将小鼠放入笼中，直至完全麻醉。挤压其足垫以检查足底反射，小鼠应表现为反射减弱或无反射反应。
- 将小鼠仰卧位放置于插管架上。
- 将橡皮筋固定在插管架上，然后将其置于小鼠上门齿下方。使用胶带将小鼠的四肢固定在插管架上。
- 使用镊子轻轻将舌头移出口腔。
- 将带有耳镜的扩张器插入小鼠口腔内，观察口咽部，直至可见喉部开口。
- 将套有导管的引导丝推进气管，直至导管接头处到达门齿位置。取出引导丝，向导管内注入空气，观察胸部是否扩张，以确认插管位置正确。
- 使用1 mL注射器通过导管注入50 μL细菌溶液（图中所示为本实验室构建的表达红萤光素酶（CBRLuc）的卡介苗（BCG），但也可使用其他发光细菌菌株）。
- 将小鼠放回笼中，并在麻醉恢复期间进行观察。
2. 动物麻醉及生物发光成像前准备
使用 XGI-8 气体麻醉系统通过异氟烷对小鼠进行麻醉。
- 操作 XGI-8 麻醉系统前，称量每个活性炭过滤罐的重量，并在罐体上记录重量和日期。若其重量超过初始重量 50 ....
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讨论
尽管遵循这些方案通常能够获得高质量的图像，但为了从成像研究中获取准确且一致的数据，仍需考虑一些关键问题。发光图像的计数值应控制在600至60,000之间，以确保信号高于背景水平且相机未发生饱和。若获得的信号低于600，应调整曝光条件以提高计数值；若信号超过60,000，则表明相机在某些区域已饱和。当相机饱和时，不应在饱和区域进行定量分析，但在非饱和区域仍可进行定量，有时也必须进行。此外，若用于三维重建掩膜的区域内包含饱和区域，则无法准确完成三维重建。通过调整图像采集时的曝光时间、像素合并（binning）和光圈值（F/stop），以及修改成像区域或动物体位，可控制所获得的信号，从而实现数据的定量分析。因此，在许多实验中，建议在多种曝光条件下持续对动物进行成像，以确保至少有一组图像处于可进行定量分析的所需范围内。
需要牢记的是，任何报告基因的表达都可能影响细菌的毒力，因此有必要开展预实验，评估用于成像的重组菌株中报告基因对适应性的潜在影响。这是生物发光成像的局限性之一，因为它需要在细菌中表达外源基因。这一问题通常可通过使用针对目标细菌物种优化密码子使用的构建体、滴定报告基因的表达水.......
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披露
动物实验按照德克萨斯大学奥斯汀分校机构动物护理与使用委员会（Institutional Animal Care and Use Committee of Texas A&M大学
致谢
作者感谢Cirillo实验室成员在本研究过程中提供的宝贵讨论和帮助。我们感谢Joshua Hill博士以及James Samuel博士实验室在本实验方案拍摄过程中提供的协助。本研究由比尔及梅琳达·盖茨基金会资助项目（项目编号48523）以及美国国立卫生研究院资助项目（项目编号AI47866）提供经费支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 异氟烷 | VETONE | 501027 | |
| 氯胺酮 | Butler Animal Health Supply | ||
| 赛拉嗪 | MP Biomedicals | 158307 | |
| 荧光素 | GMT | LUCK-100 | |
| 胎牛血清溶液 | Vortech Pharmaceutical Ls, Ltd | ||
| 导管（22G × 1”） | Terumo Medical Corp. | OX2225CA | |
| 导丝 | Hallowell EMC | 210A3491 | |
| 带窥器的八爪仪 | Hallowell EMC | 000A3748 | |
| Xenogen IVIS 系统 | Caliper Life Sciences | ||
| XGI-8 气体麻醉系统 | Caliper Life Sciences | ||
| 活体成像软件 | Caliper Life Sciences | ||
| 透明鼻罩 | Caliper Life Sciences | ||
| 光屏蔽隔板 | Caliper Life Sciences |
参考文献
- Wilson, T., Hastings, J. W. Bioluminescence. Annu Rev Cell Dev Biol. 14, 197-230 (1998).
- Contag, C. H., Bachmann, M. H. Advances in in vivo bioluminescence imaging of gene expression. Annu Rev Biomed Eng. 4, 235-260 (2002).
- Hutchens, M., Luker, G. D.
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