方法文章

高通量微RNA分析:优化复纳升秤定量RT - PCR Fluidig​​m公司动态ArrayTM国际金融中心

DOI：

10.3791/2552

⸱

2011年8月3日

 ,  ,  ,  , 
1The Eli and Edythe Broad Center of Regeneration Medicine and Stem Cell Research, University of California San Francisco , 2Center for Reproductive Sciences, University of California San Francisco , 3Department of Urology, University of California San Francisco , 4Department of Cell and Tissue Biology, University of California San Francisco , 5Fluidigm Corporation, Fluidigm Corporation , 6Department of Obstetrics and Gynecology, Hadassah-Hebrew University Medical Center, 7UCSF - Helen Diller Family Comprehensive Cancer Center, University of California San Francisco

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

在这里，我们描述一个优化的多重逆转录定量PCR（QRT - PCR）结合起来作为一个时间和成本效益高通量的microRNA（miRNA）的表达水平的筛检工具的微流体平台的协议，尤其是当样本数量有限的工作。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

在底层开发，组织homoeostasis和疾病的关键进程的miRNA广泛参与，导致之间涌动的研究和制药界的兴趣。要研究的miRNA，它是必不可少的microRNA水平的量化准确，稳健的。通过比较野生型的小分子RNA的缺陷小鼠胚胎干细胞（MESC），我们揭示了在先前公布的多重定量RT - PCR技术的准确性和鲁棒性的缺乏。在这里，我们描述了一个优化的方法，包括净化远离以前的多重步骤之前单一的实时检测，大大提高了该技术的准确性和鲁棒性的过度引物。此外，我们将解释如何执行一个微流体芯片在纳升量的技术，大大降低试剂成本，并允许时间有效的高通量的miRNA表达谱。

方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1。 RNA的提取:在单层细胞培育出

（按照制造商的协议，用TRIzol。）

试剂名称 公司 PROD /猫＃
TRIZOL解决方案 Invitrogen公司 15596-018
异丙醇 Sigma - Aldrich公司 1907年至1964年
氯仿 Sigma - Aldrich公司彗星2432
乙醇
核糖核酸酶自由水

同质化

  1. 均质直接在培养皿中的细胞，加入1毫升Trizol法解决方案，每10厘米的2盘面积，漩涡周围的Trizol法和吸管向上和向下的钢板，以确保全覆盖。

相分离

  1. 孵育匀浆样品在室温下5分钟。
  2. 转移到一个标记管，加0.2毫升氯仿制成每1ml TrizolSolution管用手大力摇晃15秒。
  3. 在室温下孵育3分钟。
  4. 样品离心15分钟，在12000 XG 2 ° C。离心后的混合物分离成一个较低的相冲，一个相间和无色的上层水相，其中包含的RNA和总的Trizol溶液的体积应为60％。

RNA沉淀

  1. 转让的水，含有RNA的阶段到一个新的，标记管。
  2. 每1毫升的Trizol溶液中加入0.5毫升异丙醇沉淀的RNA。
  3. 样品在室温下孵育10分钟。
  4. 2 ° C。离心10分钟，在12000 XG

RNA洗

  1. 离心后，弃管的上清液。
  2. 加入至少1毫升75％，每1毫升的Trizol溶液，涡旋乙醇洗涤RNA的颗粒（侧面和底部的管）。
  3. 2 ° C。离心5分钟，在7500 XG

RNA的洗脱

  1. 弃上清，再次离心1分钟。卸下过多的液体。
  2. 空气干燥颗粒为5-10分钟。
    注:以上干RNA是难以溶解。
  3. 在核糖核酸酶自由水溶解沉淀吹打的解决方案和下孵育10分钟，在55 ° C。
  4. 测量RNA的浓度（A260/280的比值）使用Nanodrop™分光光度计。
  5. 储存在-80 ° C，直到准备使用。

2。 RNA的提取:血清

（以下mirVana巴黎工具包制造商的协议修改米切尔等。 ）

试剂名称 公司 PROD /猫＃ 评论
MIR瓦纳巴黎套件
2X变性解决方案
酸酚:氯仿
miRNA的清洗解决方案1
miRNA洗涤液的2 / 3 		Ambion公司 AM1556 修改协议
2 - 巯基乙醇 Sigma - Aldrich公司 M7522
乙醇
DEPC处理水

化学制备:

  • 2 - 巯基乙醇的加入375μL2X变性液，拌匀。
  • 21毫升100％的乙醇添加到miRNA的洗涤液1。
  • 100％的乙醇添加40毫升的miRNA洗涤液的2 / 3。

样品制备:

  • 在冰上解冻血清样本。

同质化

  1. 混合2X变性液等体积（300μL）（应在室温下）和旋涡300μL的样品。
  2. 孵育5分钟，冰的混合物。
  3. 添加量的酸酚:氯仿等于样品裂解液加2X变性液（600μL）的总体积。
    重要提示:不要使用缓冲溶液在于顶部的酸酚:氯仿。
  4. 旋涡混合60秒。
  5. 在室温下离心15分钟最大转速（> 10,000 XG）。离心后，上层水相，相间和较低的有机相的混合物分离成。
  6. 删除aque类层之上（300 - 500μL，包括任何proteinacious的"朦胧"层）。
  7. 像以前一样重新提取水层，再加入氯仿。
    重要信息:第二次提取的水层是常规体积小（250μL） 。注意卷的恢复。

终审RNA隔离（总RNA的制备）

  • 预热（95℃）无核酸酶水。
  • 100％的乙醇必须在室温下。

最后RNA隔离（总RNA）

  1. 1.25卷100％的乙醇添加到回收的水相（例如，如果被收回300μL，加入375μL乙醇），调匀。
  2. 对于每个样本，放入收集管中的一个滤芯。
  3. 滴入的过滤器在裂解。
  4. 离心机（10,000 XG），30秒，丢弃流过，再次离心30秒到同一个收集管和更换滤芯。

RNA洗

  1. 应用700μLmiRNA的清洗液1滤芯和离心15秒，丢弃收集管流过，并更换成相同的收集管滤芯。
  2. 申请为15秒500μL的miRNA洗涤液的2 / 3，离心，丢弃的流量通过，并重复第二个500μL洗涤液的2 / 3。
  3. 弃掉1-2分钟流过干自旋。
  4. 放置在一个新的收集管滤芯，适用于100μL核糖核酸酶自由水（95℃），接近第2分钟孵化。
  5. 离心1〜2分钟恢复的RNA。
  6. 贮存于-80℃直至使用。

3。浓度RNA解决方案（5X）

（以下制造商的协议）

试剂名称 公司 PROD /猫＃
单片机离心式过滤装置，Ultracell YM - 3 Millipore公司 42404
DEPC处理水

设备:单片机Ultracell YM - 3，截止SS和DS核苷酸:10

体积:所需的重新集中RNA溶液的体积是依赖于实验设计，并应包括对照实验。

  1. 插入小瓶单片机样品水库和水库移液器解决方案。
    注:请勿触摸膜。
  2. 185分钟离心机在4 °最大14000 C X G.
    注:位置对转子与打击乐队的小瓶。
  3. 移液器核糖核酸酶自由水所需的量（如20μL）上水库，水库的地方倒到一个新的瓶和3分钟旋转4 ° C最大3000小工
  4. 贮存于-80℃直至使用。

4。反转录

（由唐等协议。进行了修改。）

试剂名称 公司 PROD /猫＃ 评论
高容量的cDNA归档套件
10倍的cDNA归档缓冲区
的dNTP（100毫米）
莫洛尼鼠白血病病毒（MMLV）
逆转录酶（50 U /μL） 		美国应用生物系统公司 4368814 修改协议
RNaseOUT（40 U /μL） Invitrogen公司 10777019
X - plex的反向茎环结构的引物组合（40纳米）* 综合DNA技术自定义序列*
DEPC处理水

反应体积:5.5μL

注:最终的茎环结构的引物浓度应1-5纳米（2纳米）。

准备主混合（每反应体积）如下:

1。 DEPC -水 1.959μL
2。 10X RT -缓冲区 0.55μL
3。核糖核酸酶抑制剂（40 U /μL） 0.0715微升
4。的dNTP（100毫米） 0.275μL
5。 X - plex的反向茎环结构的引物组合（40纳米）* 0.275μL
6。 MMLV RT（50 U /μL） 0.369μL
  1. 宓X和短暂离心。
  2. 2μL样品添加3.5μL主混合。
  3. 执行以下的RT反应:
    16℃30分钟，由60个周期，在20 ° C 30秒，42 ° C为30秒，50 ° C为1秒，最后85 ° C时5分钟灭活MMLV - RT，4 ° C∞ 。
  4. 储存在-20 ° C，直到使用。

*反向的茎环结构的引物名单可以发现在http://urology.ucsf.edu/blellochlab/protocols.htm

5。预扩增（预PCR）

（由唐等协议。进行了修改。）

试剂名称 公司 PROD /猫＃ 评论
的dNTP（100毫米） 美国应用生物系统公司 4368814 高第。 cDNA的归档包。
2个通用PCR扩增预混试剂NoAmpErase UNG 美国应用生物系统公司 4324018
X - plex的正向引物组合（450纳米）* 综合DNA技术自定义序列*
通用反向引物（100微米） 综合DNA技术自定义序列2
AmpliTaqGold聚合酶（5 U /μL） 美国应用生物系统公司 4311806
MgCl 2的 （100毫米）
DEPC处理水

反应体积:27.5μl（22μlMM +5.5μlRT -产品）

注:前置放大是必要的，以提高信号强度，尤其是当起始RNA浓度是有限的。输入RNA水平决定前PCR循环的最佳数量。由于相同的相对效率，每个PCR循环最终产品的浓度增加一倍。由于一些miRNA将更加高效表达，避免过度骑自行车。然而，在放大，可能会导致检测灵敏度的损失，尤其是在低水平表达的microRNA。 12预扩增循环，使用100ng的总RNA，在我们的手中出现足够了。使用作为起始原料，经12个周期结果在检测的miRNA的水平，但15个周期似乎要优于血清。最后，3卵母细胞（约400 PG每个卵母细胞3的总RNA），16预扩增周期的开始，成功地使我们屏幕上的microRNA的表达水平4。

*正向引物名单，可以发现在 http://urology.ucsf.edu/blellochlab/protocols.htm

准备主混合（每反应体积）如下:

1。 2个通用MM 13.75μL
2。 DEPC -水 0.792μL
3。 MgCl 2的 （100毫米） 0.55μL
4。的dNTP（100毫米） 1.1μL
5。 X - plex的正向引物组合（450纳米） 3.06μL
6。通用RP（100μmol） 1.375μL
7。 AmpliTaqGold聚合酶（5 U /μL） 1.375μL
  1. 混合，短暂离心。
  2. 加入22μL法师组合，以每5.5μLRT - 产品。
  3. 执行以下预PCR反应:
    95℃10分钟，55 ° C为2分钟，10 - 18 95 ° C的周期为1秒和65 ° C为1分，4 ° C∞。

6。前- PCR产物的纯化

10％的原生聚丙烯酰胺凝胶净化大小选择

试剂名称 公司 PROD /猫＃
40％丙烯酰胺/双解决方案 Bio - Rad公司 161-0144
TEMED Bio - Rad公司 161-0801
10 bp的DNA阶梯 Invitrogen公司 10821-015
SYBR黄​​金核酸凝胶染色
10,000 ×集中在DMSO 		Invitrogen公司 S11494
糖原（20毫克/毫升） 罗氏公司 10 901 393 001
缓冲器EB
10％Ammoniumpersulfate（APS）
10缓冲区
6X橙G
DEPC处理水
ddH2O

A.凝胶法制备

为了使10％的聚丙烯酰胺的混合物添加10毫升

1。 DDH 2 Ø 6.5毫升
2。 10X TBE 1毫升
3。聚丙烯酰胺（40％） 2.5毫升
4。 APS（10％） 80μL
5。 TEMED 4μL
  1. 准备DNA梯状:
    • 0.5μL10 bp的DNA阶梯
    • 4.5μL缓冲液（EB）
    • 1μL6X橙G
  2. 每27.5μL预- PCR产物5.5μL6X橙G。

B.运行凝胶

  1. 与150V运行55-60分钟的凝胶。
    注:溴酚蓝为指示剂，用20bp区域运行。

C.染色凝胶

  1. 摇床25分钟的凝胶染色使用SYBR金。
    注 :SYBR的黄金对光敏感。

D.切割凝胶

  1. 切出60-80 BP前PCR产物带，并转移到标记管。
    注:为低RNA输入预PCR产物带可能不可见。
  2. 粉碎凝胶带（如管离心管）。

E.重新提取的cDNA

  1. 加入300μl10缓冲区在37 ° C时4小时的肩。
  2. 一个标记收集管传输流体，添加另外300μL10缓冲区凝胶含管孵育4 ° C在肩过夜。
  3. 吸剩下的液体，转移到标记之前收集管，并注意总回收量。

F.乙醇沉淀

  1. 室温100％的乙醇添加3卷。
  2. 添加0.5μL糖原（20毫克/毫升）。
  3. 涡街流量计。
  4. 干冰放置至少2小时，或在-80 ° C过夜。
  5. 自旋在4 ° C离心30分钟以沉淀的cDNA在。
  6. 转储液，添加700μL室温75％乙醇和10分钟的旋转。
  7. 转储液和自旋为5分钟。
  8. 吸了10分钟，而不会干扰颗粒和空气干燥上清。
  9. 干净的水溶解沉淀。

注:集中cDNA的解决方案所需的量依赖于实验设计应包括对照实验。

7。前- PCR产物的纯化

其次是引物酶消化纯化离心柱（制造商协议）

试剂名称 公司 PROD /猫＃
ExoSAP - IT USB - Affymetrix公司 78250
MinElute PCR纯化试剂盒 Qiagen公司 28004

注:独家酶清理成功切除引​​物在我们手中，但也导致了部分降解的预扩增产物，可能是由于部分短的产品随着温度升高80 ° C时的灭活步骤变性酶。避免热灭活和使用离心柱从酶反应的PCR产物直接净化删除任何无产品退化的底漆。

  1. 5μL后的PCR产物与2μLExoSAP - IT混合。
  2. 37 ° 15分钟，以降低其余的引物和核苷酸的彗星。
  3. 加入5的缓冲PB卷1体积的PCR反应和混合，如果pH值指示剂，我已添加到缓冲器PB，检查混合物的颜色是黄色。
  4. 在提供的2ml收集管放置在一个合适的机架的MinElute列。
  5. 应用范例MinElute列和1分钟的离心。
  6. 流丢弃，MinElute列到同一管内，并添加750μL缓冲体育MinElute列洗1分钟离心机。
  7. 丢弃流过，并在同一管内放置MinElute列回。离心机以最大的速度增加1分钟列。
  8. 放置在一个干净的1.5 ml离心管的MinElute列。
  9. 以洗脱DNA，加入10μLDEPC处理水的膜的中心，让站在列1分钟，然后CENtrifuge为1分钟。

8。 Fludigim 96.96 QRT - PCR分析

试剂名称 公司 PROD /猫＃ 评论
Fluidigm公司96.96动态阵列套件
96.96动态阵列
96.96控制线液
20X载入试剂		 Fluidig​​m公司
混合的
通用反向引物（1μM）
正向引物（1μM）
TaqMan探针（0.2微米） 		综合DNA技术自定义序列（1）
2个通用PCR扩增预混试剂
NoAmpErase UNG 		美国应用生物系统公司 4324018
吐温

1。促发的96.96动态阵列国际金融公司

  1. 注入到每个芯片上的累加器的控制线液（150μL）。
  2. 将进入国际金融公司（集成流体通路）控制器芯片和运行总理（136x）脚本到芯片的控制线液总理。

注:芯片需要使用24小时后打开包装。请务必不要对泄漏物控制线液，因为控制芯片上，或在进气口线流体使芯片无法使用。芯片需要吸60分钟内加载。

2。准备样品

2.1前的样品制备

在一个一次性的塑料管，结合下面的表格，使样品预混合（每进气道卷）的组成部分。

2X的TaqMan通用的master mix 2.5μL
20X载入试剂 0.25μL

注:最终成交量为2.75μL，为移液器盘盈免除损失

2.2样品制备

在96结合以及格式每个样品与样品预混合（每进气道卷）。

前样品混合 2.75μL
样品 2.25μL

注:涡和离心96孔板中，简要地收集液。
每个入口5μL的最后一卷，吹打考虑损失准备成交量略高。

2.3准备13X检测

  1. 使用96孔板准备13X检测。 1X浓度在下面的表格，规模达13倍。
通用反向引物 1微米（1个） 2序列
正向引物* 1微米（1个） *
基因特异性的TaqMan探针＃ 0.2微米 ＃

*正向引物名单，可以发现在 http://urology.ucsf.edu/blellochlab/protocols.htm

＃TaqMan探针的名单可以发现在 http://urology.ucsf.edu/blellochlab/protocols.htm

  1. 在浓度为0.25％，最终吐温吐温13X检测一个新的96孔板等分结合
    注:每个入口的最终体积为5μL，准备足够的体积（5.5μL）期间损失量转移到。
  2. 拌匀，避免气泡，短暂离心收集液。

3。载入芯片

注:为了使样品和检测，确保芯片的正确定位正确加载。很方便的槽口对准左上角。

确保所有检测样品溶液混合，然后再加载芯片。这是方便做在96孔板和旋转，然后再加载芯片板。注意芯片的吹打，以供日后参考地图。

未使用的示例入口处应填2.75μL样品混合和2.25μLDNA自由水。

应填写未使用的检测进气口与2.5μL检测装载试剂和2.5μl水。

不要走过去的第一站，同时吹打，以避免引入气泡。

  1. 加载样品和检测（五后olume每个入口:5μL）运行负载混合脚本（136x）脚本来加载到芯片的样品和检测。
  2. 脚本已经完成后，删除从ICF控制器芯片。
  3. 剥离加载芯片底部的蓝色保护膜。
  4. 删除任何从芯片表面的灰尘颗粒或碎片。

4。 96.96定量RT - PCR检测

  1. BioMark系统传输芯片，并使用以下的扩增条件:
    55℃2分钟，95 ° C为10分钟，40个周期为95 ° C为1分15秒和55℃。
  2. 按照制造商的数据采集软件的协议。

5。使用的qPCR分析软件

经过RT - PCR技术的专有软件提供的扩增曲线，每口井的热图和CT值。请参阅数据分析软件手册。

9。代表性的成果:

figure-protocol-1
图1。图解实验的工作流程。所示是一个一步一步的多重定量RT - PCR协议的描述，包括从多重反转录（步骤C）和多路前置放大器的过度引物的净化（步骤E）（步骤d）前实时检测（步骤F），在纯化的QRT - PCR的cDNA模板。 FP:microRNA的具体正向引物，URP:通用反向引物，R - SLP:小分子RNA的特定反向茎环结构的引物。
点击这里为一个较大的图像。

figure-protocol-2
图2。聚丙烯酰胺凝胶净化。QRT - PCR的模板后前 PCR - PCR产物的大小乐队专门在WT样本，但没有microRNA的缺陷DGCR8 - / -或Dicer酶- / -样本（箭头）后96复杂RT和12周期的前置放大。请注意，非特定产品来源不明（箭头）和过量引物在所有样本中发现（星级）。

figure-protocol-3
图3。净化多重前置放大后，大大提高了定量RT - PCR结果的精度比较的相对表达水平的WT MESC）DGCR8 - / - （缺乏规范的microRNA）MESC揭示1）更多的小分子RNA的检测和2）假阳性的损失/ - -在DGCR8信号的背景后，净化了引物- PCR产物。二）经纯化后，双方DGCR8的相对表达水平- / - / WT 和 Dicer - / - / WT显示假阳性信号的损失，并允许适当的分类罕见DGCR8 独立/ Dicer的依赖性小分子RNA（miR - 320的， - 484，-877）5。

figure-protocol-4
图4。 Fluidigm公司的高通量定量RT - PCR检测miRNA表达谱。屏幕截图96.96 Fluidigm公司QRT - PCR mircoRNA分析屏幕为前列腺癌患者血清miRNA的水平的改变。实时定量PCR分析软件提供的扩增曲线，色码热图和循环阈值（CT）。

讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

miRNA是短（18-24个核苷酸），非编码RNA，从而调节基因表达的转录后由两个不稳定的信使RNA（mRNA）的抑制其翻译。6，至少有三分之一的人类基因组包含保守的miRNA约束力的网站在他们的3'UTR和多能性，增殖和凋亡基因的miRNA明显的相互作用，表明在细胞命运的决定，组织动态平衡和癌症等疾病的重要贡献6,7因此，准确的microRNA表达谱广泛。兴趣。

为了测试发布的多重定量RT - PCR检测miRNA 表达谱协议2，我们作为阴性对照的小分子RNA的缺陷MESC。 DGCR8 - / -细胞缺乏规范的microRNA，而Dicer的- / -细胞缺乏规范和非canoncial micoRNAs 8,9

比较野生型水平的MES DGCR8 - / -细胞，我们发现几个表示没有检测到野生型细胞11 10小分子RNA的缺乏准确性。有的甚至呈相对较低的表达水平的基因敲除细胞（图3a）。我们推测，可能会造成大量的引物进行两个连续的多重步骤之前RT定量单一（RT和前PCR）缺乏准确性。然而，多重预扩增是必要的，以提高信号强度，尤其是当起始RNA浓度是有限的。净化远离本地聚丙烯酰胺凝胶电泳（图2）的大小选择的引物- PCR产物，我们可以证明，通过检测microRNA和假阳性信号的损失都DGCR8在精度显着改善 - / -和 Dicer - / -另外的背景（图3a和3b）修改后的QRT - PCR的方法，允许适当的分类DGCR8罕见的独立 / Dicer的依赖小分子RNA（ 图 3b ）11。因此，一个额外的步骤，以净化过量引物离预PCR产物是明显的优势，尤其是当使用大型复用底漆，每样本集。

预扩增周期的最佳人数是由输入RNA浓度。不能下或平衡overamplify应遵循的具体实验的详情。

与千余名已知的microRNA，使用标准的384孔板未必最广泛的microRNA分析，尤其是在比较多个样本。 Fluidig​​m公司的动态阵列国际金融公司使，用移液步骤和所需化学显着下降，以96对96纳升规模（6.7 NL）（9216反应）在一次实验中在不同的小分子RNA的个别样品测试。对于每一个运行的分析软件提供的扩增曲线，色码热图和循环阈值（CT）。同时大规模的分析，降低实验的差异，并允许平均表达式的值正常化，这出执行其他正常化战略，利用小分子RNA控制的。

相比市售384预先指定的TaqMan探针的良好平台，与定制引物的高通量分析平台的结合提供了实验的灵活性高。

优化的多重定量RT - PCR技术相结合的方式，用动态数组平台成功地允许我们同时屏幕改建48个前列腺癌患者血清中384的miRNA（图4）的水平，并没有控制穗（即合成的microRNA）的数据正常化。 11

尽管增加从样品制备到分析结果步骤，描述的方法是一个时间和成本效益的高通量方法简介miRNA表达水平的大样本集，即使在有限的起始原料。

披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

艾伦米尔是Fluidig​​m公司的雇员。否则，我们没有披露的财务利益。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们想感谢Blelloch实验室评论文本。这项工作是由来自美国国立卫生研究院（K08 NS48118和R01 NS057221），加州再生医学研究所（CIRM）（种子补助RS1 - 00161，新教师奖RN2 - 00906）和皮尤慈善信托基金到RB和调频支持Wissenschaftlich Urologische GESELLSCHAFT EV。

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Mitchell, P. S. Circulating microRNAs as stable blood-based markers for cancer detection. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 10513-10518 (2008).
  2. Tang, F. 220-plex microRNA expression profile of a single cell. Nat Protoc. 1, 1154-1159 (2006).
  3. Gertsenstein, M., Vintersten, K., Behringer, R. Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual. 3, Cold Spring Harbor Laboratory Press. 644-645 (2003).
  4. Suh, N. MicroRNA function is globally suppressed in mouse oocytes and early embryos. Curr Biol. 20, 271-277 (2010).
  5. Babiarz, J. E., Ruby, J. G., Wang, Y., Bartel, D. P., Blelloch, R. Mouse ES cells express endogenous shRNAs, siRNAs, and other Microprocessor-independent, Dicer-dependent small RNAs. Genes Dev. 22, 2773-2785 (2008).
  6. Babiarz, J. E. Small RNAs: their biogenesis, regulation and function in embryonic stem cells. StemBook. , (2009).
  7. Friedman, R. C., Farh, K. K., Burge, C. B., Bartel, D. P. Most mammalian mRNAs are conserved targets of microRNAs. Genome Res. 19, 92-105 (2008).
  8. Wang, Y., Medvid, R., Melton, C., Jaenisch, R., Blelloch, R. DGCR8 is essential for microRNA biogenesis and silencing of embryonic stem cell self-renewal. Nat Genet. 39, 380-385 (2007).
  9. Kanellopoulou, C. Dicer-deficient mouse embryonic stem cells are defective in differentiation and centromeric silencing. Genes Dev. 19, 489-501 (2005).
  10. Thomson, J. M., Parker, J., Perou, C. M., Hammond, S. M. A custom microarray platform for analysis of microRNA gene expression. Nat Methods. 1, 47-53 (2004).
  11. Moltzahn, F. Microfluidic based multiplex qRT-PCR identifies diagnostic and prognostic microRNA signatures in sera of prostate cancer patients. Cancer Res. 71, 550-560 (2011).
  12. Mestdagh, P. A novel and universal method for microRNA RT-qPCR data normalization. Genome Biol. 10, R64-R64 (2009).

重印与许可

申请许可以重复使用本 JoVE 文章的文本或图表

申请许可

标签

MicroRNA ProfilingMultiplex qRT PCRFluidigm Dynamic ArrayNanoliter ScalePrimer PurificationMicrofluidic ChipHigh ThroughputRNA ConcentrationPolyacrylamide GelCT Values

相关文章