本文介绍了一种优化的多重逆转录定量PCR（qRT-PCR）方案，结合微流控平台，作为检测microRNA（miRNA）表达水平的高通量筛选工具，具有成本低、耗时短的优点，尤其适用于样本量有限的情况。
方法文章
高通量 microRNA 表达谱分析：在 Fluidigm Dynamic ArrayTM IFCs 上进行纳升级优化多重 qRT-PCR
本文内容
摘要
摘要
miRNA 参与发育、组织稳态及疾病等关键过程的广泛作用，引起了科研界和制药界的极大关注。研究 miRNA 时，准确且稳健地定量 microRNA 水平至关重要。通过比较野生型与小 RNA 缺陷型小鼠胚胎干细胞（mESC），我们发现先前发表的多重 qRT-PCR 技术在准确性和稳健性方面存在不足。在此，我们描述了一种优化方法，包括在单重实时检测之前，去除前一步多重反应中过量的引物，该改进显著提高了该技术的准确性和稳健性。此外，我们还解释了如何在纳升级体积的微流控芯片上进行该技术操作，从而显著降低试剂成本，并实现高效、高通量的 miRNA 表达谱分析。
方案
1. RNA 提取：单层培养的细胞
（按照TRIzol试剂盒说明书操作。）
| 试剂名称 | 公司 | 产品/货号 |
| TRIzol Solution | Invitrogen | 15596-018 |
| 异丙醇 | Sigma-Aldrich | 1907-64 |
| 氯仿 | Sigma-Aldrich | C 2432 |
| 乙醇 | ||
| 无RNA酶水 |
匀浆
- 直接在培养皿中裂解细胞，每 10 cm2 培养皿面积加入 1 ml Trizol 溶液，轻轻晃动使 Trizol 覆盖整个培养皿表面，并反复吹打以确保充分裂解。
相分离
- 将匀浆样品在室温下孵育 5 分钟。
- 转移至标记好的离心管中，每 1 ml TrizolSolution 加入 0.2 ml 氯仿，用手剧烈振荡离心管 15 秒。
- 在室温下孵育 3 分钟。
- 在 12,000 × g 条件下离心 15 分钟，温度为 2 °C。离心后混合物分为下层红色相、中间相和上层无色水相，其中上层水相含有 RNA，体积应占 Trizol Solution 总体积的 60%。
RNA 沉淀
- 将含有 RNA 的水相转移至一个新的、已标记的离心管中。
- 每 1 ml Trizol 溶液加入 0.5 ml 异丙醇，以沉淀 RNA。
- 在室温下孵育样品 10 分钟。
- 在 2 °C 下以 12,000 × g 离心 10 分钟。
RNA 洗涤
- 离心后，弃去各管中的上清液。
- 通过向每 1 ml Trizol 溶液中加入至少 1 ml 75% 乙醇，洗涤 RNA 沉淀（位于管壁及管底），涡旋振荡。
- 在 2 °C 条件下，以 7500 × g 离心 5 分钟。
RNA 洗脱
- 弃去上清，再次离心1分钟，去除过量液体。
- 将沉淀在空气中干燥5–10分钟。
注意：RNA过度干燥后难以溶解。 - 通过移液操作将沉淀重新溶解于无RNase的水中，上下吹打混匀，于55 °C孵育10分钟。
- 使用Nanodrop™分光光度计测定RNA浓度（A260/280比值）。
- 置于-80 °C保存，直至使用。
2. RNA 提取：血清
（遵循 mirVana PARIS Kit 制造商的方案，经 Mitchell 等人1 修改）
| 试剂名称 | 公司 | 产品/目录号 | 备注 |
| mirVana PARIS试剂盒 2倍变性溶液 酸性酚:氯仿 miRNA洗涤液1 miRNA洗涤液2/3 | Ambion | AM1556 | 改良方案 |
| 2-巯基乙醇 | Sigma-Aldrich | M7522 | |
| 乙醇 | |||
| DEPC处理水 |
化学试剂的配制：
- 向2X变性溶液中加入375 μl的2-巯基乙醇，并充分混匀。
- 向miRNA洗涤溶液1中加入21 ml的100%乙醇。
- 向miRNA洗涤溶液2/3中加入40 ml的100%乙醇。
样品制备：
- 将血清样本在冰上解冻。
匀浆
- 将300 μl样品与等体积（300 μl）的2X变性溶液（应处于室温）混合，并涡旋震荡。
- 将混合物置于冰上孵育5分钟。
- 加入与样品裂解液和2X变性溶液总体积相等的酸性酚:氯仿溶液（600 μl）。
重要提示：切勿使用位于酸性酚:氯仿上层的水相缓冲液。 - 涡旋震荡混合物60秒。
- 在室温下以最大速度（>10,000 × g）离心15分钟。离心后混合物分为上层水相、中间相和下层有机相。
- 移取上层水相（体积应为300–500 μl，包括任何呈“浑浊”状的蛋白质层）。
- 通过再次加入氯仿，按前述方法对水相层进行二次提取。
重要提示：第二次提取所得水相体积通常较小（约250 μl）。请记录回收的体积。
终末RNA提取物（总RNA）的制备
- 预热无核酸酶水（95 °C）。
- 100% 乙醇必须为室温。
最终RNA提取（总RNA）
- 向回收的水相中加入1.25倍体积的100%乙醇（例如，若回收了300 μl，则加入375 μl乙醇），并充分混匀。
- 对于每个样本，将一个过滤柱放入收集管中。
- 用移液器将裂解液加到过滤柱上。
- 离心（10,000 × g）30秒，弃去穿滤液，再次离心30秒，并将过滤柱放回同一收集管中。
RNA洗涤
- 向滤芯中加入 700 μl miRNA 洗涤液 1，离心 15 秒，弃去收集管中的穿流液，并将滤芯放回同一收集管中。
- 加入 500 μl miRNA 洗涤液 2/3，离心 15 秒，弃去穿流液，并用另一份 500 μl 洗涤液 2/3 重复一次。
- 弃去穿流液，空管离心干燥 1–2 分钟。
- 将滤芯转移至新的收集管中，加入 100 μl 无 RNA 酶的水（95 °C），盖紧管盖，孵育 2 分钟。
- 离心约 2 分钟以洗脱 RNA。
- 置于 -80 °C 保存，直至使用。
3. RNA溶液的浓缩（5倍）
（遵循制造商的说明书）
| 试剂名称 | 公司 | 货号/目录号 |
| MICROCON Centrifugal Filter Devices, Ultracell YM-3 | Millipore | 42404 |
| DEPC 处理水 |
设备： Microcon Ultracell YM-3，截留分子量 SS 和 DS 核苷酸：10
体积：重新浓缩的RNA溶液所需体积取决于实验设计，并应包括对照实验。
- 将 Microcon 样品储液管插入离心管中，并用移液器将溶液加入储液管。
注意：切勿接触滤膜。 - 在 4 °C 条件下以最高 14,000 × g 离心 185 分钟。
注意：将离心管的缺口带朝向转子方向放置。 - 向储液管中加入所需体积的无 RNA 酶水（例如 20 μl），将储液管倒置放入新的离心管中，在 4 °C 条件下以最高 3000 × g 离心 3 分钟。
- 保存于 -80 °C，直至使用。
4. 逆转录
（采用 Tang 等人2的方案并加以修改。）
| 试剂名称 | 公司 | 货号/产品编号 | 备注 |
| 高容量 cDNA 文库构建试剂盒 10x cDNA 文库构建缓冲液 dNTP (100 mM) Moloney 小鼠白血病病毒 (MMLV) 逆转录酶 (50 U/μl) | Applied Biosystems | 4368814 | 改良方案 |
| RNaseOUT (40 U/μl) | Invitrogen | 10777019 | |
| x-plex 反向茎环引物混合物 (40 nM) * | Integrated DNA Technologies | Custom | 序列 * |
| DEPC 处理水 |
反应体积：5.5 μl
注意：茎环引物的终浓度应为 1-5 nM（此处为 2 nM）。
按下表所示配制主混合液（每反应体积）：
| 1. DEPC-水 | 1.959 μl |
| 2. 10x RT-缓冲液 | 0.55 μl |
| 3. RNase抑制剂 (40 U/μl) | 0.0715 μl |
| 4. dNTP (100 mM ) | 0.275 μl |
| 5. x-plex 反向茎环引物混合液 (40 nM)* | 0.275 μl |
| 6. MMLV-RT (50 U/μl) | 0.369 μl |
- 混匀并短暂离心。
- 向 2 μl 样品中加入 3.5 μl 的预混液（Master-Mix）。
- 进行以下逆转录反应：
16 °C 反应 30 分钟，随后进行 60 个循环：20 °C 30 秒，42 °C 30 秒，50 °C 1 秒，最后 85 °C 5 分钟以灭活 MMLV-RT，然后在 4 °C 无限期保存。 - 保存于 -20 °C，待用。
反向茎环引物列表可在 http://urology.ucsf.edu/blellochlab/protocols.htm 找到
5. 预扩增（预PCR）
（采用 Tang 等人2 的方案并加以修改。）
| 试剂名称 | 公司 | 产品/目录号 | 评论 |
| dNTP（100 mM） | 应用生物系统公司 | 4368814 | High cap. cDNA文库试剂盒 |
| 2x 通用型 PCR 预混液（含 NoAmpErase UNG） | Applied Biosystems | 4324018 | |
| x-plex 正向引物混合物（450 nM）* | Integrated DNA Technologies | 自定义 | 序列 * |
| 通用反向引物（100 μM) | Integrated DNA Technologies | 自定义 | 序列2 |
| AmpliTaqGold 聚合酶（5 U/μl) | Applied Biosystems | 4311806 | |
| MgCl2 (100 mM) | |||
| DEPC 处理水 |
反应体积：27.5μl（22μl MM + 5.5μl RT-产物）
注意：预扩增对于增强信号强度是必要的，尤其是在起始RNA浓度有限的情况下。输入的RNA量决定了预PCR循环的最佳次数。在每轮PCR扩增效率相对一致的前提下，每轮循环应使最终产物的浓度增加一倍。由于某些miRNA的表达水平较高，应避免过度扩增。然而，扩增不足可能导致检测灵敏度下降，特别是对于低水平表达的微小RNA（microRNA）。在我们的实验中，使用100 ng总RNA进行12个预扩增循环似乎已足够。以血清作为起始材料时，12个循环可检测到miRNA水平，但15个循环效果更佳。最后，以3个卵母细胞（每个卵母细胞约含400 pg总RNA3）为起始材料，16个预扩增循环成功使我们能够检测微小RNA的表达水平4.
* 正向引物列表可在以下网址找到：http://urology.ucsf.edu/blellochlab/protocols.htm
按下表准备混合液（每反应体积）：
| 1. 2x 通用反应混合液 | 13.75 μl |
| 2. DEPC处理水 | 0.792 μl |
| 3. MgCl2 (100 mM) | 0.55 μl |
| 4. dNTP (100 mM) | 1.1 μl |
| 5. 多重正向引物混合液 (450 nM) | 3.06 μl |
| 6. 通用反向引物 (100 μM) | 1.375 μl |
| 7. AmpliTaqGold 聚合酶 (5 U/μl) | 1.375 μl |
- 混匀并短暂离心。
- 向每份 5.5 μl 的 RT 产物中加入 22 μl 的主混合液（Master-Mix）。
- 进行以下预 PCR 反应：
95 °C 10 分钟，55 °C 2 分钟，随后进行 10 - 18 个循环（95 °C 1 秒，65 °C 1 分钟），4 °C 保存。
6. PCR 前产物的纯化
通过10%非变性聚丙烯酰胺凝胶按分子大小进行纯化
| 试剂名称 | 公司 | 货号/产品编号 |
| 40% 丙烯酰胺/双丙烯酰胺溶液 | Bio-Rad | 161-0144 |
| TEMED | Bio-Rad | 161-0801 |
| 10 bp DNA 标记物 | Invitrogen | 10821-015 |
| SYBR Gold 核酸凝胶染料 DMSO 中 10,000 倍浓缩液 | Invitrogen | S11494 |
| 糖原（20 mg/ml） | Roche | 10 901 393 001 |
| Buffer-EB | ||
| 10% 过硫酸铵（APS） | ||
| TEN 缓冲液 | ||
| 6x 橙 G | ||
| DEPC 处理水 | ||
| ddH2O |
a. 凝胶制备
配制10 ml 10%聚丙烯酰胺混合液，加入
| 1. ddH2O | 6.5 ml |
| 2. 10x TBE | 1 ml |
| 3. 聚丙烯酰胺 (40%) | 2.5 ml |
| 4. 过硫酸铵 (10%) | 80 μl |
| 5. 四甲基乙二胺 (TEMED) | 4 μl |
- 制备 DNA 分子量标记物：
- 0.5 μl 10 bp DNA 分子量标记物
- 4.5 μl 缓冲液（EB）
- 1 μl 6x 橙色G
- 向每份 27.5 μl 的 Pre-PCR 产物中加入 5.5 μl 6x 橙色G。
b. 运行凝胶电泳
- 以150V电压电泳55-60分钟。
注意： 溴酚蓝作为指示剂，其迁移位置对应于20 bp区域。
c. 染色凝胶
- 在摇床上用 SYBR-Gold 染色凝胶 25 分钟。
注意：SYBR-Gold 对光敏感。
d. 切胶
- 从60-80 bp处切下Pre-PCR产物条带，并转移至标记好的离心管中。
注意： 对于RNA起始量较低的Pre-PCR产物，可能无法观察到明显的条带。 - 压碎凝胶条带（例如采用套管离心法）。
e. 重新提取 cDNA
- 加入 300 μl TEN 缓冲液，在旋转摇床上 37 °C 孵育 4 小时。
- 将液体转移至已标记的收集管中，向含有凝胶的管中再加入 300 μl TEN 缓冲液，将所有样品置于 4 °C 旋转摇床上过夜孵育。
- 吸去剩余液体，按前述方法转移至已标记的收集管中，并记录回收的总体积。
f. 乙醇沉淀
- 加入3倍体积的室温100%乙醇。
- 加入0.5 μl甘原蛋白（20 mg/ml）。
- 涡旋振荡。
- 在干冰上孵育至少2小时，或在-80 °C过夜。
- 在4 °C下以微量离心机离心30分钟，使cDNA沉淀。
- 弃去上清液，加入700 μl室温75%乙醇，离心10分钟。
- 弃去液体后再次离心5分钟。
- 用移液器小心吸除上清液，避免扰动沉淀，随后空气干燥10分钟。
- 将沉淀溶解于无菌水中。
注意：浓缩 cDNA 溶液所需体积取决于实验设计，且应包含对照实验。
7. PCR前产物的纯化
通过酶消化引物后使用离心柱进行纯化（遵循生产商的说明书）
| 试剂名称 | 公司 | 货号/目录号 |
| ExoSAP-IT | USB-Affymetrix | 78250 |
| MinElute PCR Purification Kit | Qiagen | 28004 |
注意：在我们的实验中，仅使用酶法纯化可有效去除引物，但也导致了预扩增产物的部分降解，这可能是因为在酶失活步骤中温度升至80 °C时，较短的扩增产物发生了部分变性。避免加热失活，直接使用离心柱从酶反应体系中纯化PCR产物，可在不引起产物降解的情况下完全去除引物。
- 将5 μl PCR产物与2 μl ExoSAP-IT混合。
- 在37 °C孵育15分钟，以降解残留的引物和核苷酸。
- 向1体积的PCR反应液中加入5体积的PB缓冲液并混匀；如果PB缓冲液中已添加pH指示剂I，请检查混合液颜色是否为黄色。
- 将MinElute离心柱放入所提供的2 ml收集管中，并置于合适的支架上。
- 将样品加入MinElute离心柱中，离心1分钟。
- 弃去穿流液，将MinElute离心柱重新放回同一收集管中，加入750 μl PE缓冲液进行洗涤，然后离心1分钟。
- 弃去穿流液，将MinElute离心柱重新放回同一收集管中，在最大转速下额外离心1分钟。
- 将MinElute离心柱转移至一个洁净的1.5 ml微量离心管中。
- 为洗脱DNA，向膜中心加入10 μl经DEPC处理的水，静置1分钟，然后离心1分钟。
8. Fludigim 96.96 qRT-PCR 分析
| 试剂名称 | 公司 | 产品/目录号 | 备注 |
| Fluidigm 96.96 动态阵列试剂盒 96.96 动态阵列 96.96 控制液管线 20x 加样试剂 | Fluidigm Corporation | ||
| 混合液： 通用反向引物 (1 μM) 正向引物 (1 μM) TaqMan 探针 (0.2 μM) | Integrated DNA Technologies | 定制 | 序列 (1) |
| 2x 通用 PCR 主混合液 含 NoAmpErase UNG | Applied Biosystems | 4324018 | |
| Tween |
1. 启动 96.96 动态阵列 IFC
- 向芯片上的每个蓄液池中注入150 μl控制液。
- 将芯片放入集成流体电路（IFC）控制器中，运行Prime (136x)程序，使控制液充分灌注芯片。
注意：芯片在打开包装后需在24小时内使用。 务必避免溢出对照线液体，因为对照线液体若沾到芯片或入口处，将导致芯片无法使用。 芯片在引液后需在60分钟内完成加载。
2. 样品制备
2.1 样品前处理
在一次性塑料管中，按照下表中的组分配制样品预混液（每个入口的体积）。
| 2x TaqMan Universal Master Mix | 2.5 μl |
| 20x 加样试剂 | 0.25 μl |
注意：最终体积为 2.75 μl，以补偿移液过程中的损耗
2.2 样品制备
在96孔板中，将每个样品与预样品混合液按每入口体积进行混合。
| 预混液 | 2.75 μl |
| 样本 | 2.25 μl |
注意：短暂涡旋并离心96孔板以收集液体。
每个进样口终体积为 5 μl，准备时需略微增加体积以补偿移液损失。
2.3 准备13x检测体系
- 使用 96 孔板准备 13x 检测。按照下表中的 1x 浓度，按比例放大至 13x。
| 通用反向引物 | 1 μm (1x) | 见文献2 |
| 正向引物* | 1 μm (1x) | * |
| 基因特异性TaqMan探针# | 0.2 μm | # |
* 正向引物列表可在以下网址找到：http://urology.ucsf.edu/blellochlab/protocols.htm
TaqMan 探针列表可参见 http://urology.ucsf.edu/blellochlab/protocols.htm
- 在新的96孔板中，将含Tween的13x检测体系分装液混合，使Tween终浓度为0.25%
注意： 每个加样孔的终体积为5 μl，需准备足够体积（5.5 μl），以补偿液体转移过程中的损耗。 - 充分混匀，避免产生气泡，并短暂离心以收集液体。
3. 加载芯片
注意：为确保样本和检测的正确加载，请正确放置芯片。将缺口对准左上角较为方便。
在上样芯片前，确保所有检测和样品溶液均已混匀。可在96孔板中进行混匀，并在上样前对板子进行离心。注意记录芯片加样图谱，以备后续参考。
未使用的样品进样口应加入2.75 μl样品混合液和2.25 μl无DNA水。
未使用的检测入口应填充 2.5 μl 检测上样试剂和 2.5 μl 水
移液时不要超过第一档，以免引入气泡。
- 上样并加入检测试剂（每个入口的体积：5 μl），运行 Load Mix 脚本（136x）以将样品和检测试剂加载至芯片中。
- 脚本运行结束后，从 ICF 控制器中取出芯片。
- 从已加载样品的芯片底部撕下蓝色保护膜。
- 清除芯片表面的任何灰尘颗粒或碎屑。
4. 96.96 qRT-PCR
- 将芯片转移至 BioMark 系统，并使用以下扩增条件：
55 °C 保持 2 分钟，95 °C 保持 10 分钟，随后进行 40 个循环：95 °C 15 秒，55 °C 1 分钟。 - 按照制造商提供的数据采集软件操作说明进行操作。
5. 使用 qPCR 分析软件
RT-PCR 后，专有软件会为每个孔提供扩增曲线、热图和 Ct 值。请参阅软件手册以进行数据分析。
9. 代表性结果：
图1. 实验流程的示意图。 图示为多重qRT-PCR方案的逐步说明，包括在实时检测（步骤F）之前，从多重逆转录（步骤C）和多重预扩增（步骤D）中纯化过量引物（步骤E），从而获得用于qRT-PCR的纯化cDNA模板。FP：miRNA特异性正向引物，URP：通用反向引物，R-SLP：miRNA特异性反向茎环引物。
点击此处查看大图。
图2. 预扩增后qRT-PCR模板的聚丙烯酰胺凝胶纯化。 仅在野生型（WT）样本中可见预扩增产物大小的条带，而在microRNA缺陷型DGCR8-/-或Dicer-/-样本中则未见（箭头），该结果来自96重反转录及12个预扩增循环后。请注意，在所有样本中均发现来源不明的非特异性产物（空心箭头）以及过量引物（星号）。
图3. 多重预扩增后的纯化显著提高了qRT-PCR结果的准确性。 a) 野生型小鼠胚胎干细胞（WT mESC）相对表达水平的比较 Dgcr8-/- （缺乏经典微小RNA的）mESC揭示了1）检测到更多的微小RNA，以及2）假阳性信号的消失 Dgcr8-/- 去除预扩增产物中的引物后，a）背景信号显著降低。b）纯化后，两种基因的相对表达水平 DGCR8 -/-/WT 和 Dicer -/-/WT 显示出假阳性信号的减少，并允许对稀有事件进行正确分类 Dgcr8 独立的 / Dicer 依赖性小RNA（miR-320、-484、-877）。5
图4. Fluidigm高通量qRT-PCR miRNA表达谱分析。 采用96.96 Fluidigm qRT-PCR微流控芯片对前列腺癌患者血清中miRNA水平变化进行筛查的示例截图。实时qPCR分析软件提供扩增曲线、颜色编码的热图以及循环阈值（Ct）。
讨论
miRNA 是一类短链（18-24 个核苷酸）非编码 RNA，可通过使信使 RNA（mRNA）去稳定化及抑制其翻译，在转录后水平调控基因表达。6 事实上，至少三分之一的人类基因在其 3'非翻译区（3'UTR）含有保守的 miRNA 结合位点，且 miRNA 与多能性、增殖和凋亡相关基因之间存在明显的相互作用，这表明 miRNA 在细胞命运决定、组织稳态以及癌症等疾病中具有关键作用。6,7 因此，精确的 microRNA 表达谱具有广泛的研究价值。
为了验证已发表的多重qRT-PCR miRNA表达谱分析方案2，我们使用小RNA缺乏的小鼠胚胎干细胞（mESC）作为阴性对照。DGCR8-/- 细胞缺乏所有经典的microRNA，而Dicer-/- 细胞则同时缺乏经典和非经典的microRNA8,9。
通过比较野生型 mES 细胞与 DGCR8-/- 细胞中的表达水平，我们发现准确性存在不足，因为一些已知表达的10 microRNA 在野生型细胞中未能被检测到11。有些 microRNA 甚至在敲除细胞中表现出相对更高的表达水平（图 3a）。我们推测，这种准确性不足可能是由于在单重 RT-定量之前，两步连续的多重反应（逆转录和预扩增 PCR）中存在大量引物残留所致。然而，多重预扩增对于增强信号强度是必要的，尤其是在起始 RNA 浓度有限的情况下。通过在天然聚丙烯酰胺凝胶上进行基于分子大小的选择，将预扩增 PCR 产物与引物分离（图 2），我们显著提高了检测准确性，能够在 Dgcr8-/- 和 Dicer-/- 背景下检测到更多的 microRNA，并消除假阳性信号（图 3a 和 3b）。此外，改进后的定量 RT-PCR 方法还实现了对罕见的 Dgcr8 非依赖性但 Dicer 依赖性小 RNA 的正确分类（图 3b）11。因此，在每份样品使用大量多重引物组时，增加一步纯化以去除预扩增产物中过量引物显然具有显著优势。
最佳的预扩增循环次数由输入的RNA浓度决定。应根据特定实验的具体情况，把握避免扩增不足或过度扩增的平衡。
目前已知的微小RNA（microRNA）超过一千种，使用标准的384孔板进行大规模microRNA表达谱分析可能并非最佳选择，尤其是在比较多个样本时。Fluidigm动态阵列集成流路芯片（Dynamic Array IFC）可在单次实验中实现最多96个独立样本与96种不同microRNA的检测（共9216个反应），反应体系为纳升级（6.7 nL），显著减少了移液步骤和所需试剂用量。每次运行后，分析软件可提供扩增曲线、颜色编码的热图以及循环阈值（Ct值）。这种大规模并行检测可降低实验间的变异，并支持采用平均表达值进行标准化，其标准化效果优于使用小RNA对照的其他标准化策略12。
与 commercially available 384 孔板平台（预设 TaqMan 探针）相比，高通量分析平台结合定制引物组可提供更高的实验灵活性。
优化的多重qRT-PCR方法结合动态阵列平台，成功实现了对48例前列腺癌患者血清中384种miRNA水平变化的同步筛查（图4），并在无需外加内参对照（即合成的微小RNA）的情况下完成数据归一化。11
尽管从样本制备到获得表达谱结果的步骤有所增加，但所述方法仍是一种高效、经济的高通量方法，可用于大规模样本的miRNA表达水平分析，即使起始材料有限也能实现。
披露
Alan Mir 是 Fluidigm Corporation 的员工。除此之外，我们没有需要披露的财务利益。
致谢
我们感谢Blelloch实验室对本文提出的修改意见。本研究获得了以下资助：RB获得美国国立卫生研究院（NIH）（K08 NS48118和R01 NS057221）、加州再生医学研究所（CIRM）（种子基金RS1-00161、新教员奖RN2-00906）以及佩韦慈善信托基金的支持；F.M.获得德国泌尿科学学会（Wissenschaftlich Urologische Gesellschaft eV）的资助。
参考文献
- Mitchell, P. S. Circulating microRNAs as stable blood-based markers for cancer detection. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 10513-10518 (2008).
- Tang, F. 220-plex microRNA expression profile of a single cell. Nat Protoc. 1, 1154-1159 (2006).
- Gertsenstein, M., Vintersten, K., Behringer, R. Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual. 3, Cold Spring Harbor Laboratory Press. 644-645 (2003).
- Suh, N. MicroRNA function is globally suppressed in mouse oocytes and early embryos. Curr Biol. 20, 271-277 (2010).
- Babiarz, J. E., Ruby, J. G., Wang, Y., Bartel, D. P., Blelloch, R. Mouse ES cells express endogenous shRNAs, siRNAs, and other Microprocessor-independent, Dicer-dependent small RNAs. Genes Dev. 22, 2773-2785 (2008).
- Babiarz, J. E. Small RNAs: their biogenesis, regulation and function in embryonic stem cells. StemBook. , (2009).
- Friedman, R. C., Farh, K. K., Burge, C. B., Bartel, D. P. Most mammalian mRNAs are conserved targets of microRNAs. Genome Res. 19, 92-105 (2008).
- Wang, Y., Medvid, R., Melton, C., Jaenisch, R., Blelloch, R. DGCR8 is essential for microRNA biogenesis and silencing of embryonic stem cell self-renewal. Nat Genet. 39, 380-385 (2007).
- Kanellopoulou, C. Dicer-deficient mouse embryonic stem cells are defective in differentiation and centromeric silencing. Genes Dev. 19, 489-501 (2005).
- Thomson, J. M., Parker, J., Perou, C. M., Hammond, S. M. A custom microarray platform for analysis of microRNA gene expression. Nat Methods. 1, 47-53 (2004).
- Moltzahn, F. Microfluidic based multiplex qRT-PCR identifies diagnostic and prognostic microRNA signatures in sera of prostate cancer patients. Cancer Res. 71, 550-560 (2011).
- Mestdagh, P. A novel and universal method for microRNA RT-qPCR data normalization. Genome Biol. 10, R64-R64 (2009).
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