培养的海马神经元树突棘中荧光标记蛋白的光漂白后荧光恢复（FRAP）

摘要

FRAP 已被用于定量培养细胞中绿色荧光蛋白（GFP）标记蛋白的移动性。我们通过分析光漂白后荧光恢复的百分比，来检测 GFP 的可移动组分与不可移动组分。在本研究中，FRAP 实验在海马神经元的树突棘上进行。

摘要

FRAP 已被用于量化 GFP 标记蛋白的移动性。通过使用强激发激光，使目标区域内的 GFP 标记蛋白荧光发生淬灭。当区域外未淬灭的 GFP 标记蛋白扩散进入目标区域时，该区域的荧光随之恢复。通过测量荧光恢复速率，可分析蛋白的移动性。该技术可用于表征蛋白的移动性和周转速率。

在本研究中，我们在培养的海马神经元中表达（增强型绿色荧光蛋白）EGFP 载体。使用蔡司 710 共聚焦显微镜，我们对单个树突棘中的 GFP 蛋白荧光信号进行光漂白，随后采集时间序列图像以记录光漂白后的荧光恢复情况。最后，通过 ImageJ 和 Graphpad 软件分析成像数据，估算出树突棘中 GFP 可移动组分和不可移动组分的百分比。

本FRAP实验方案展示了如何进行基本的FRAP实验以及如何分析数据。

方案

1. 神经元转染

1. 在涂有聚-D-赖氨酸的MatTek 35 mm玻璃底培养皿中培养胚胎第18天（E18）的大鼠海马神经元¹。体外培养16–18天（DIV）后，使用Clontech CalPhos哺乳动物转染试剂盒对神经元进行转染。首先，在转染前0.5小时，将每35 mm培养皿中的培养基更换为1.5 ml Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）。将原始培养基保存在无菌的15 ml离心管中，以备后续使用（步骤1.6）。
2. 将10 μg pEGFP-N1质粒DNA与无菌H₂O（Clontech）和12.4 μl 2 M氯化钙溶液（Clontech）混合，总体积为100 μl。
3. 在中等速度涡旋振荡2×HBS的同时，将步骤1.2中的混合液逐滴加入100 μl 2×HBS中。
4. 室温静置混合物20分钟，然后将步骤1.3所得终混合液加入含DMEM的神经元培养物中。
5. 将神经元放回37 °C培养箱中孵育1–1.5小时。
6. 移除含磷酸钙的培养基，用DMEM洗涤细胞三次。在将培养皿放回培养箱前，将DMEM更换为之前保存的原始培养基。

2. 树突棘上的FRAP实验

1. 转染后两到四天使用神经元进行荧光漂白恢复（FRAP）实验。
2. 用预热的Tyrode溶液替换35 mm玻璃底培养皿中的培养基，该溶液含有（单位为 mM）NaCl 145、KCl 5、HEPES 10、葡萄糖 10、甘氨酸 0.005、CaCl₂ 2.6 和 MgCl₂ 1.3（用 NaOH 调节 pH 至 7.4）。
3. FRAP实验使用蔡司LSM 710共聚焦显微镜。使用蔡司TempModule系统控制工作环境的温度（37°C）、湿度和CO₂浓度（5%）。确保CO₂气罐已连接，并且用于调节湿度的水瓶已加满水。
4. 使用100×物镜（αplan-APOCHROMAT 100×/1.46 油镜）寻找已转染的成熟树突。如果培养皿中转染的细胞较稀疏，可先用40×物镜（plan-NEOFLUAR 40×/1.3 油镜）寻找目标细胞，然后切换至100×物镜进行成像。
5. 使用5倍光学放大和256×256像素分辨率对包含多个树突棘的一段短树突进行成像。图像采集时采用标称速度9（像素驻留时间为3.15 μsec），完成一次扫描需0.5秒。将针孔设为2 μm以获得较强的荧光信号。成像时应尽量使用较低的激光透射率（例如1–5%），以避免整个图像发生光漂白。
6. 选择感兴趣的树突棘。在本实验中，我们选择头部直径约为1 μm的蘑菇状树突棘。
7. 进行FRAP实验时，先采集5张漂白前的对照图像，然后以100%标称激光透射率对目标树突棘进行10次漂白[氩离子激光功率为30 mW，其中488 nm激光线占50%（15 mW），经488 nm激光线到达显微镜的功率约为3–4 mW]，漂白后立即连续采集一系列图像。本实验中，漂白后每1秒采集一次图像，持续15秒。时间间隔应根据不同的靶蛋白和实验设计进行调整（图1）。
8. 保存图像。

3. 数据分析

1. 使用 ImageJ 软件打开图像。
2. 在 ImageJ 中使用对齐工具（“插件” →“堆栈-混洗” →“对齐堆栈中的切片” →“平移”和/或“刚体”）对图像堆栈进行对齐，使目标树突棘保持在图像中的同一位置，不发生漂移。
3. 使用 ImageJ 的“强度随时间变化监测”工具（“插件” →“堆栈-混洗” →“强度随时间变化监测”），在时间序列图像中测量目标树突棘的相对荧光强度（F_s）、一个转染但未漂白的区域（对照）以及一个背景区域（F_b）的荧光强度。对照区域可选择一段清晰对焦的远端树突，背景区域应为无荧光信号的区域。
4. 通过比较对照区域在光漂白前（F_c0）和光漂白后（F_c）的荧光强度，计算光漂白速率（r）：
   r = F_c/F_c0。
5. 按以下方式对目标树突棘的荧光强度（F）进行归一化处理：
   F = (F_s - F_b) / r。
6. 使用 Graphpad Prism 软件（图 2）或其他类似软件，将目标树突棘的荧光强度数据拟合为单相指数方程曲线。
7. 通过以下公式计算可移动组分比例（f_m）和不可移动组分比例（f_i）：
   f_m = F_∞/ F_0,
   其中 F_∞ 为完全恢复后的荧光强度，F₀ 为光漂白前的荧光强度。
   f_i = 1 - f_m。

4. 代表性结果：

在本研究中，我们对成熟的海马神经元进行荧光漂白恢复（FRAP）实验。在体外培养18-22天时，蘑菇状树突棘已经形成。利用我们的方法，可以记录树突棘等微小区域中荧光强度的动态变化。

为分析EGFP的荧光恢复过程，我们在光漂白前采集5张图像作为对照，光漂白后立即每1秒采集1张图像，持续15秒。图像分辨率足以进行定量分析。标记荧光蛋白的荧光恢复曲线具有高度可重复性。

我们还简要展示了如何使用 ImageJ 和 Graphpad Prism 软件来定义荧光蛋白的可移动组分和不可移动组分。本文展示的 FRAP 方法及分析可广泛应用于神经科学、细胞生物学及其他相关研究领域。

图1. 培养的海马神经元树突棘中EGFP荧光的FRAP测量结果。红色箭头指示光漂白的时间点。照片显示光漂白前（Pre）以及光漂白后0、5、10、15秒同一区域的图像。树突棘区域、对照区域和背景区域分别用字母S、C和B标记。实验期间神经元保持在37°C。比例尺，1 μm。

图2. EGFP荧光在15秒内的FRAP曲线。绿色线条表示原始曲线；红色线条表示归一化曲线。曲线上的点表示每1秒采集一次的FRAP数据。曲线通过单相指数方程进行拟合。光漂白前的平均荧光强度计为100%。本实验中，可移动组分（MF）为94%，不可移动组分（IF）为6%。

讨论

FRAP 分析已被广泛使用 体内 和 体外^1-2研究中。该技术通常使用 GFP 融合蛋白，尽管也可使用红藻融合蛋白³该分析方法具有高灵敏度，可用于表征GFP标记蛋白的迁移特性。

为了获得有意义的FRAP分析结果，在FRAP实验之前和过程中应避免不必要的光漂白。实现这一点有两种方法。首先，寻找和观察目标神经元的过程应尽可能迅速。特别是，长时间使用100倍物镜观察神经元会显著导致荧光漂白。其次，高激光功率和频繁扫描往往会增加光漂白的可能性。因此，有必要在对照区域计算光漂白速率，然后对实验区域的FRAP曲线进行归一化处理。该归一化方法已在实验方案中描述（详见步骤3.3–3.5）。

光漂白步骤对于获得良好的FRAP结果也至关重要。在本实验中，我们在100%激光透射率下对目标树突棘进行10次光漂白。该条件足以将固定样品中树突棘的荧光漂白至背景水平。因此，我们将光漂白后0秒时的荧光强度设定为与背景相同的数值。根据首次扫描速度的不同，若目标蛋白具有高度流动性，则可能在光漂白后立即检测到显著的荧光恢复。

已开发出多种荧光蛋白探针，用于通过荧光漂白后恢复技术（FRAP）研究蛋白质动态。一种互补的方法是使用光激活型绿色荧光蛋白（PA-GFP）或光转换变体。结合FRAP技术，这些工具在活细胞成像研究中正变得不可或缺^4-6。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
35 mm 玻璃底培养皿	MatTek Corp.	P35GC-1.0-14-C
CalPhos 哺乳动物转染试剂盒	Clontech Laboratories	631312
pEGFP-N1 质粒	Clontech Laboratories	6085-1
蔡司共聚焦显微镜	Carl Zeiss, Inc.	LSM 710
蔡司 TempModule 系统	Carl Zeiss, Inc.	N.A.
ImageJ 软件	美国国立卫生研究院	N.A.
GraphPad Prism 软件	GraphPad Software Inc.	N.A.