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用于胚胎植入前遗传学诊断的荧光原位杂交技术

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DOI：

10.3791/2570

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2011年2月23日

 ,  , 
1Department of Cytogenetics, GSTS-Pathology, Guy’s & St Thomas’ NHS Foundation Trust, Guy’s & St Thomas’ Centre for Preimplantation Genetic Diagnosis

本文内容

摘要

本文介绍了在临床环境中应用于胚胎植入前遗传学诊断（PGD）的单细胞FISH探针选择、卵裂球细胞核铺展技术、原位杂交以及信号判读方法。

摘要

胚胎植入前遗传学诊断（PGD）是产前诊断的一种成熟替代方案，涉及从辅助生殖技术（ART）产生的胚胎群体中选择胚胎进行植入。当存在家族性单基因遗传病（如囊性纤维化）或一方伴侣携带染色体结构重排（如双向相互易位）时，可能需要进行此类选择。对于既往生育过患病子女的夫妇，或存在染色体重排、反复流产或不孕情况的夫妇，均可接受PGD。在卵巢刺激后获取的卵母细胞通过体外受精 体外 将受精卵浸入精液（IVF）或通过单个精子胞质内注射（ICSI）进行受精。在胚胎植入前的卵裂期进行活检，通常于受精后第3天移除一个细胞，对该活检细胞进行检测以确定胚胎的遗传状态。荧光 原位 荧光原位杂交（FISH）利用特异性DNA探针对活检细胞的固定细胞核进行检测，是识别与染色体重排相关的染色体数目异常以及在无特异性突变检测手段的X连锁遗传病家族中选择女性胚胎的首选技术。FISH也曾被用于对胚胎进行自发性染色体非整倍体筛查（亦称PGS或PGD-AS），以期提高辅助生殖技术的效率；然而，采用本文所述的铺片与FISH技术进行该检测的预测价值在多数情况下可能过低，因此不推荐用于常规临床实践。本文描述了单细胞FISH适用探针的选择、卵裂球细胞核的铺片技术以及 原位 杂交与信号评分在临床环境中应用于胚胎植入前遗传学诊断（PGD）。

方案

1. 从活检的卵裂球中裂解并铺展细胞核

  1. 用于贴壁细胞的裂解缓冲液（含0.2% Tween20的0.01 M HCl，pH 2.0）应提前24小时配制，并于-20°C保存。配制100 mL，使用无菌20 mL注射器和注射器滤器将20 mL过滤至30 mL无菌通用容器中。将滤液以1 mL分装至10–15个1.7 mL无菌微量离心管中，分装后立即盖紧并标记管子，再进行冷冻。建议同时准备两批缓冲液以供使用：一批为新配制的，另一批为已验证合格的前一批次，以便在新批次不合格时使用。
  2. 在活检操作前30分钟，将裂解缓冲液于室温下解冻。出于操作便利性考虑，工作温度应介于室温与手温之间。
  3. 使用金刚石笔在氨基涂层载玻片（例如Genetix）的底面划出一个小圆圈（直径约5 mm），并用病例编号、唯一载玻片编号和活检日期预先标记载玻片。每个卵裂球使用单独的载玻片，并按数字顺序标记胚胎编号。载玻片应使用硬度较高的铅笔（如4H）进行标记，然后用乳胶手套轻轻擦拭（“ blotting”）以去除石墨粉尘。
  4. 在圆圈内加入少量裂解缓冲液。
  5. 将活检所得的卵裂球转移至裂解缓冲液中。如有必要，可在圆圈内补充裂解缓冲液，直至细胞开始裂解；细胞应完全裂解，且在缓冲液干燥前胞质应充分分散。
  6. 观察细胞核，确保其保留在圆圈内且未丢失；若细胞无细胞核或多核，则需另取一个细胞进行活检。
  7. 将载玻片置于室温下自然干燥。

2. 原位 单个卵裂球细胞核的杂交

  1. 使用无菌蒸馏水配制乙醇系列溶液（70%、90% 和 100%）。
  2. 打开热块仪（例如 Hybaid Omnislide 或 Vysis Hybrite），并将其设定为 75°C。
  3. 解冻探针，涡旋混匀后离心。在配制探针混合液前，应核对并确认试剂正确无误。按照制造商指定的体积，用移液器将试剂加入 0.65 mL 无菌微量离心管中配制探针混合液，使用前再次涡旋混匀并离心。探针混合液的总体积应足以提供每个待测细胞核 2 μL，并向上取整至最接近的 10 μL，以留出安全余量。
  4. 在 Coplin 染色缸中用磷酸盐缓冲盐水（PBS）（pH 7.0：0.14 M NaCl，3 mM KCl，10 mM Na2HPO4，2 mM KH2PO4）于室温下对载玻片进行预清洗，持续 5 分钟。
  5. 用无菌蒸馏水将载玻片冲洗两次。
  6. 依次用乙醇系列溶液（70%、90% 和 100%）在室温下各脱水 2 分钟，然后空气干燥。确保载玻片完全浸入溶液中；如有石墨粉尘浮起，用干净纸巾吸除。
  7. 使用相差显微镜观察，记录细胞核在圆圈内的位置。
  8. 用 100% 乙醇在室温下再脱水 2 分钟，然后空气干燥。
  9. 加入 2 μL 探针混合液，并覆盖 9 × 9 mm 盖玻片（可使用 18 × 18 mm 一号盖玻片的四分之一）。
  10. 用橡胶胶水（例如 Cow Gum；Cow Proofing）密封盖玻片边缘。
  11. 将载玻片置于热块仪上，在 75°C 下共变性 5 分钟，随后在 37°C 湿润密闭盒中杂交过夜（16–20 小时）。若探针混合液完全由着丝粒探针组成（例如用于性染色体相关病例），杂交 60 分钟即可获得满意结果。
  12. 准备水浴锅，放入足够数量的 Coplin 染色缸，并加热至 71°C。
  13. 配制 0.4x 标准柠檬酸钠溶液（SSC）严格洗涤液（71°C 时 pH 7.0，0.06 M NaCl，6 mM C6H5Na3O7·2H2O），并放入水浴锅中加热。
  14. 每只 Coplin 染色缸中加入 50 mL 严格洗涤液，使用前用洁净温度计立即检查温度是否达到 71°C。
  15. 小心去除每张载玻片上的橡胶胶水，并用室温下的 4x SSC/0.05% Tween20（pH 7.0）冲洗去除盖玻片。
  16. 在 71°C 下用 0.4x SSC 严格洗涤液洗涤载玻片 5 分钟。每只 Coplin 染色缸中洗涤的载玻片不得超过 6 张。
  17. 在室温下用 4x SSC/0.05% Tween20 洗涤载玻片 2 分钟。
  18. 若探针混合液中含有间接标记的探针，沥干载玻片上多余液体，并在 Parafilm 膜（20 × 20 mm 方形）下加入 20 μL 荧光标记的抗体。
  19. 在 37°C 湿润密闭盒中孵育 15 分钟。
  20. 移除 Parafilm 膜，并在室温下用 4x SSC/0.05% Tween20 洗涤一次，持续 2 分钟。
  21. 在室温下用 PBS 洗涤两次，每次 2 分钟，然后沥干载玻片。
  22. 在 22 × 22 mm 0 号盖玻片上加入 6 μL DAPI/Vectashield（含 160 ng 4',6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐的 1 mL Vectashield 封片剂，Vector Laboratories），然后将载玻片倒置覆盖在盖玻片上。
  23. 吸去多余液体，并用透明指甲油密封盖玻片边缘。

3. 使用配备有适用于所用探针的适当滤光片的荧光显微镜进行分析。

  1. 通过荧光显微镜结合针对每种荧光染料的单一带通滤光片直接观察并判读信号。每个细胞核应由两名分析人员分别判读。一般指导原则为：当两个信号间距小于一个信号域（信号宽度）时，应记为一个信号；然而，对于信号大小、强度和间距各异的情况，需凭借经验进行判断和解释。
  2. 使用成像软件（例如 Isis、MetaSystems、Altlussheim、德国；CytoVision、Genetix）捕获细胞核图像，以确认目视诊断结果，并作为实验室质量保证计划的一部分进行图像存档。

4. 代表性结果：

应检测培养的外周血淋巴细胞的中期和间期细胞核，以确认所选探针特异性针对易位染色体，能够明确显示断裂点位置（端粒近端探针应仅与易位片段杂交，着丝粒探针应仅与着丝粒片段杂交），且间期细胞核中的信号应明亮且清晰可辨。建议对每种样本的100个间期细胞核中每种探针的信号数量进行计数，以评估检测的效率。在此情况下，每种探针在95%至99%的细胞核中均观察到2个信号。图1显示了染色体5和9短臂之间相互易位样本制备中的一个中期和一个间期细胞核。

来自胚胎卵裂球间期细胞核的信号应明亮且清晰，需使用针对所用颜色的独立带通滤光片进行计数。图2显示了一个具有正常信号模式的卵裂球细胞核（所有检测位点均为2个拷贝），表明其5号和9号染色体的染色体组成正常或平衡；另一个细胞核则显示异常信号模式，符合染色体易位产生的不平衡产物，即5号染色体易位片段为单体性（1个拷贝），9号染色体易位片段为三体性（3个拷贝）。

染色体畸变分析；FISH技术；染色体标示为der(9)和der(5)的示意图。
图1. 来自一名携带5号与9号染色体短臂间相互易位的个体外周血淋巴细胞培养物所制备的中期分裂相及间期细胞核图像，其断裂点位于5p14.3和9p24.1：46,XY,t(5;9)(p14.3;p24.1)。ish t(5;9)(5ptel48-,9ptel30+;9ptel30-,5ptel48+,9cen+)。荧光原位杂交（FISH）探针分别针对两个易位片段（5p14.3→5pter，红色Cytocell亚端粒5ptel48 TexasRed；9p24.1→9pter，绿色Cytocell亚端粒9ptel30 FITC）以及9号染色体的着丝粒区段（9p24.1→9qter，蓝色Abbott CEP 9 alpha卫星SpectrumAqua）进行选择。

用于染色体易位检测的荧光原位杂交（FISH）分析示意图。
图2. 使用不同滤光片分别捕获每种荧光染料信号后合并形成的第3天胚胎间期卵裂球细胞核的复合图像。(A) 每种探针显示两个信号，表明每个位点有两个拷贝，符合易位染色体正常或平衡的核型。(B) 一个红色信号、三个绿色信号和两个蓝色信号，提示5号染色体易位片段有一个拷贝，9号染色体易位片段有三个拷贝，9号染色体着丝粒片段有两个拷贝，符合易位染色体邻近-1式分离所产生的不平衡产物，表现为5p14.3→5pter单体性和9p24.1→9pter三体性。

讨论

荧光的应用 原位 对单个胚胎细胞（卵裂球）进行荧光原位杂交（FISH）在实际操作和信号模式解读方面均带来特殊挑战。活检所得细胞需在载玻片预设区域内充分铺展，以便FISH后准确定位；必须格外注意确保细胞完全裂解、胞质充分分散，且细胞核清晰可见并保持完整；由于诊断结果完全依赖于该单细胞的检测结果，因此必须采用严格的信号计数与判读标准。然而，在经验丰富的操作者手中，FISH仍是一项可靠的临床植入前遗传学诊断（PGD）技术。FISH用于PGD的基本原理在于，可使用针对特定DNA序列、标记不同荧光染料或半抗原的探针，检测特定基因座的拷贝数，从而识别与染色体重组在减数分裂过程中分离异常相关的染色体失衡（1），包括罗伯逊易位、相互易位、倒位及复杂重排（2）。FISH还可用于X连锁遗传病家系中无特异性突变检测手段时的女性胚胎筛选（3, 4）。更具争议的是，FISH也曾被用于筛查偶发性染色体非整倍体，以期提高辅助生殖技术的效率（5, 6）；然而，多数情况下该检测方法的预测价值可能过低，因此不推荐在常规临床实践中应用（7）。本文重点讨论FISH在临床单细胞诊断中的技术要点及其局限性。

用于铺展和固定单个卵裂球的方法包括甲醇/乙酸（5, 8）、Tween/盐酸（9）以及Tween/盐酸与甲醇/乙酸的联合使用（10）。技术上的变异包括在铺展前对细胞进行低渗处理，和/或在固定后进行胃蛋白酶和多聚甲醛处理。该方法应在实验室中进行适当验证（14）。本文详细描述了Tween/盐酸法。该方法在技术上简便，并在不同实验室中具有高度可重复性。此方法可用于制备单个细胞核，以进行性别的荧光原位杂交（FISH）诊断及染色体重排的检测，诊断准确性可达到可接受水平（7）。

探针混合物可包含直接标记和间接标记的探针，以及来自不同制造商的探针。应避免使用针对已知多态性染色体区域（11, 12）的探针，或已知会与其他染色体发生显著交叉杂交的探针（13），但如果通过先前对生育双方的测试证实其具有特异性并适用于植入前遗传学诊断（PGD），则仍可使用。可用于区分探针的现有荧光染料/半抗原及策略包括：德克萨斯红（TR）、异硫氰酸荧光素（FITC）、SpectrumGreen（Vysis）、SpectrumOrange（Vysis）、SpectrumAqua、生物素标记探针（通过TR-亲和素、FITC-亲和素或Cy-5链霉亲和素检测，后者使用远红滤光片观察）、红绿探针混合产生黄色信号、进行第二轮杂交，以及通过依次使用TexasRed和SpectrumGold滤光片捕获SpectrumOrange信号以生成第三种颜色。

建议使用包含三个探针的探针组进行性别鉴定（14），这些探针分别特异性结合X和Y染色体的着丝粒区域以及一条常染色体；其中常染色体探针用于确定倍性，从而区分三体X（2n，47,XXX）与三倍体（3n，69,XXX），以及四体X（48,XXXX）与四倍体（4n，92,XXXX）。在此类应用中常用的探针组为Abbott AneuVysion混合探针，包含α-卫星X、Y和18号染色体探针；该探针组已被证实具有极低的多态性发生率，因此无需对生殖伴侣进行预处理前的筛查（14）。

针对任何特定染色体重排的探针混合物应满足以下要求：理想情况下，应包含足够的探针，以检测该重排所产生的所有预期不平衡染色体产物。若无法实现这一点，则可接受那些未检测的不平衡产物在可识别妊娠中被认为无法存活且可能极为罕见的探针组合（14）。探针混合物需在双方生育伴侣的培养淋巴细胞中期相上进行测试。应至少分析十个中期分裂相，以评估探针的特异性、多态性及交叉杂交情况；对于携带染色体重排的个体，还需确认探针能够如预期般与重排的不同片段发生杂交。此外，应计数这些样本中至少100个间期细胞核，以评估信号的特异性、亮度和清晰度（14）。

市面上可提供商业化的PGS探针组合（例如Abbott MultiVysion PB或PGT），其靶向在妊娠产物中最常出现非整倍体的染色体，且每条靶向染色体仅包含一个探针。通常细胞核可进行第二次杂交，加入针对其他染色体的探针，从而实现对染色体13、15、16、18、21、22及XY（14）的检测。采用本文所述的铺片与FISH技术，该检测的预测价值在大多数操作者手中可能显著偏低，因此不建议用于常规临床实践（7, 15）。

应用于单细胞的比较基因组杂交（CGH）等技术能够检测每条染色体的拷贝数（Wilton et al. 2001），而单核苷酸多态性（SNP）芯片结合定量分析（Wells et al. 2008）或“核型图谱”（karyomapping）基因分型技术（Handyside et al. 2009）则是检测染色体非整倍性的有前景的替代方法。然而，这些技术在片段不平衡检测方面的分辨率和准确性仍不明确，因此对于涉及小片段的染色体重排，荧光原位杂交（FISH）很可能仍将是首选技术。

披露

未声明任何利益冲突。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
盐酸，2.5 LVWR 国际公司101254H
氯化钠，5千克VWR 国际公司443827W
氯化钾，250克VWR 国际公司26764.232
无水磷酸氢二钠，500gVWR 国际公司102494C
磷酸二氢钾，500gVWR 国际公司10203 4B
氢氧化钠颗粒，500 gVWR 国际公司28245.265
Tween 20，500 mLVWR 国际公司663684B
乙醇，2.5 LVWR 国际公司8.18760.2500完税
三水合柠檬酸钠，5KgVWR 国际27833.363
牛皮胶，250 mLCow Proofings Ltd.已不再提供旧的库存仍然可以在美术用品商店中找到
DAPI/抗荧光淬灭剂 ES，0.125μg/mL，500 μLCytocell Ltd.DES500L150μl vial rec’与每种Cytocell TEL探针一起使用
指甲油，12 mL靴子10088316001
氨基涂层载玻片，25GenetixK2615
DAPI，0.1 mLSigma-AldrichD-9542
Vectashield，10 mLVector LaboratoriesH1000
Texas-Red-avidin，0.001 mLVector LaboratoriesA-2016
FITC-avidin，0.001 mLVector LaboratoriesA-2011
Cy-5 链霉亲和素，0.001 mLGE HealthcarePA45001
微型离心管，1.75 mL，每盒500个蓟科学公司AX-MCT-175-C
0.6 mL 微型离心管，每盒 1000 个Thistle ScientificAX-MCT-060-C-CS
30 ml 广口瓶，每盒 400 个Sterilin128B可从 NHS 供应链获取，货号 KCP053
加热块
酒精灯 酒精灯插座 酒精灯灯芯VWR 国际公司451-0107 451-3112 451-3111
堵塞的玻璃移液管Fisher ScientificPMK-300-052R
体视显微镜Wild Heerbrugg
组织，100盒NHS 供应链MJT058
金属培养皿
塑料三聚氰胺托盘VWR 国际公司682-009
烘箱
移液管吹吸头科学实验室用品有限公司HAE3700
导管
注射器滤器，0.2μm 孔径，25 mm 直径Fisher ScientificFDM-340-010U
金刚石笔VWR 国际公司818-0021
载玻片加热板赛默飞世尔科技公司HBOSBB
杂交室
组织卷NHS 供应链MJT004
Schieferdecker JarVWR 国际公司631-9313
考普林罐VWR 国际631-9331
精细镊子VWR 国际232-2123
钝头镊子VWR 国际232-2113
1000 mL 烧杯VWR 国际公司213-1642
相差显微镜尼康仪器公司E200
无纤维印迹卡，每盒100张Fisher ScientificSDE1
蓝色磨砂载玻片，每盒100片科学实验室用品有限公司MIC3022
盖玻片，18×18 mm，1号，每盒200片科学实验室用品有限公司MIC3110
盖玻片，22×22 mm，0号，每盒200片科学实验室用品有限公司MIC3104
盖玻片，22×50 mm，0号，每盒100片科学实验室用品有限公司MIC3206
1 mL注射器，每盒100支NHS 供应链FWC045
1 mL 移液器吸头，10 盒，每盒 1000 个Thistle ScientificAX-T-1000-C-L-R
培养箱LEEC
水浴锅资助设备W22
酒精温度计多种可用来源
pH计Jenway3305
pH电极VWR 国际公司662-1759BNC 插头，适用于 Jenway pH 计 3305
加热搅拌器BibbyHC502
1 mL 帕斯德吸管，每盒 500 支科学实验室用品有限公司PIP4202
Parafilm，50 mm × 75 mVWR 国际公司291-1214

参考文献

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