克隆形成实验用于评估细胞增殖活力的适用性已有50多年的历史。本文中，我们演示了使用贴壁细胞进行克隆形成实验的一般操作步骤。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
克隆形成（或称集落形成）实验已建立超过50年；最早描述该技术的论文发表于1956年1。除了记录该方法外，最初的里程碑式研究还首次生成了体外培养的哺乳动物（HeLa）细胞在X射线照射下的辐射剂量-反应曲线1。克隆形成实验的基本原理是评估对照未处理细胞与经过不同处理（如电离辐射、各种化学化合物（例如细胞毒性试剂）或其他基因操作）的细胞之间在生殖存活能力（即单个细胞产生后代的能力；例如单个细胞形成包含50个或更多细胞的集落）上的差异。该实验已成为辐射生物学中最广泛接受的技术，并被广泛用于评估不同细胞系的辐射敏感性。此外，克隆形成实验也常用于监测辐射修饰化合物的效果，以及确定细胞毒性试剂和其他抗癌治疗手段对不同细胞系集落形成能力的影响。典型的使用贴壁细胞系进行的克隆形成存活实验包含三个主要步骤：1）在组织培养瓶中对细胞单层进行处理，2）制备单细胞悬液并将适量细胞接种至培养皿中，3）在适当的孵育期（根据细胞系不同，通常为1至3周）后固定并染色集落。本文中，我们以永生化人角质形成细胞系（FEP-1811）2为例，演示使用贴壁细胞系进行克隆形成实验的一般操作流程。同时，我们的目标还包括描述克隆形成实验的常见特征，例如计算接种效率和细胞经辐射暴露后的存活分数，并以一种天然抗氧化剂配方为例，展示其对辐射反应的修饰作用。
方案
1. 细胞培养与实验设置
- 人角质形成细胞在含有15 mL角质形成细胞无血清培养基（K-SFM）（GIBCO，无血清培养基）的75 cm2组织培养瓶中以单层形式培养，培养基中添加L-谷氨酰胺（2 mM）、表皮生长因子（5 ng/mL）、牛垂体提取物（40 μg/mL）和20 mg/mL庆大霉素。细胞置于37°C、含5% CO2的湿化环境中培养。
- 将细胞接种至12个含有5 mL K-SFM培养基的25 cm2组织培养瓶中。
通过胰蛋白酶消化制备单细胞悬液。用磷酸盐缓冲液洗涤细胞，随后加入0.05%胰蛋白酶/EDTA溶液，孵育5-10分钟。当细胞开始变圆且约30%的细胞脱落时，加入3倍体积含10%胎牛血清的DMEM培养基以中和胰蛋白酶活性。通过反复吹打（20次）使细胞完全脱落。使用血细胞计数板对细胞进行计数。
根据细胞系的倍增时间（人FEP-1811角质形成细胞约为20小时）接种适量的细胞。实验当天应达到约90%的融合度（每瓶约106个细胞）。
一个包含12个烧瓶的实验是单次克隆形成实验的最佳选择（六个未照射对照组和六个照射组），可在约四小时内完成。
2. 处理与辐照
- 使用相关的辐射修饰化合物对细胞进行适当时间的处理，然后将细胞暴露于电离辐射中，如γ射线或X射线。
通常六个培养瓶用于作为铺板效率（未处理）和仅药物对照，另外六个培养瓶进行辐照处理。
在此示例中，人角质形成细胞在37°C下用不同浓度的肉桂素PF（CPF；Integrity Nutraceuticals International，美国田纳西州斯普林希尔；下方显示20 μg/mL的代表性数据）处理1小时，CPF是一种水溶性天然抗氧化剂配方。细胞使用137Cs源（Gammacell 1000 Elite辐照仪；Nordion International，加拿大安大略省）以4 Gy剂量进行辐照（1.6 Gy/min）。
3. 涂布
- 处理后，按前述方法制备单细胞悬液。
- 使用血细胞计数板精确计数各样本中的细胞数量，并稀释至适当浓度，以便将适量的细胞接种到培养皿中（每种条件设5个重复，接种于15 mm培养皿中）。
在确定每皿接种细胞数量时，应预先估计接种效率和/或存活分数。目标是使形成的菌落数量在20–150个之间。
将培养皿置于加湿的塑料克隆盒中，在37°C、5% CO2环境中孵育以形成克隆集落。
不同细胞系的集落形成孵育时间各异，通常为1至3周；一般认为孵育时间应至少相当于六次细胞分裂。本示例中，人角质形成细胞的对照培养皿需要八天时间，才能形成由50个或更多细胞组成的足够大的克隆。
4. 固定并染色菌落
在通风橱中完成以下步骤。
- 通过抽吸轻柔地移除每块平板中的培养基。
- 用 5 mL 0.9% 生理盐水洗涤每块平板。
- 加入 5 mL 10% 中性缓冲甲醛溶液，固定菌落 15–30 分钟。
- 加入 5 mL 0.01% (w/v) 结晶紫水溶液（dH2O），染色 30–60 分钟。
- 用 dH2O 洗去多余的结晶紫，并使培养皿自然晾干。
5. 菌落计数
体视显微镜
- 使用体视显微镜计数包含超过50个单细胞的克隆集落。
使用成像软件进行数字成像和计数
- 使用相机或扫描设备获取菌落的数字图像
- 使用如下所述的图像分析软件包对菌落进行计数
使用 ImageJ（Fiji 版本 1.44a）进行细胞计数
- 在 Fiji 中打开图像文件，依次点击 文件 -> 打开。
- 如有需要，将图像转换为 8 位格式，依次点击 图像 -> 调整... -> 阈值。
- 调整阈值以降低非特异性背景的强度，使仅有菌落被检测到。
- 使用以下步骤计数菌落：依次点击 处理 -> 二值化 -> 寻找最大值。
对于此图像格式，可将噪声容限设置为 0。确保勾选亮背景选项，并预览检测到的极大值，以确认所有细胞克隆均已被正确识别。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
在此示例中，人FEP-1811角质形成细胞经不同浓度（最高达100 μg/mL CPF）处理，结果显示在37°C下用20 μg/mL CPF处理1小时的效果。处理后，细胞使用137Cs源（Gammacell 1000 Elite辐照仪；Nordion International，ON，加拿大；1.6 Gy/min）进行4 Gy辐照。对照组未处理组及仅药物处理组每个培养皿接种100个细胞，辐照样本每皿接种1000个细胞。如上表所示，使用体视显微镜计数克隆，或使用ImageJ分析拍摄的数字图像（图1）进行计数。五个培养皿的平均克隆数用于计算接种效率和存活分数。数据表明，该天然抗氧化剂配方具有辐射保护作用（保护因子约3）。
代表性结果
| 治疗 | 计数方法 | 细胞接种 | 1 |
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
未声明任何利益冲突。
致谢
感谢澳大利亚核科学与工程研究所的支持。TCK 获得了 AINSE 奖项资助。表观基因组医学实验室由澳大利亚国家卫生与医学研究委员会（566559）资助。HR 获得了澳大利亚研究生奖和 BakerIDI 明日之星奖。本研究由生物医学成像发展有限公司合作研究中心（CRC-BID）资助，该中心根据澳大利亚政府合作研究中心计划建立并获得支持。CO 获得了澳大利亚研究生奖和 CRC-BID 补充奖学金。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 | |
|---|---|---|---|---|
| 角质形成细胞无血清培养基 | 生长培养基 | Invitrogen | 17005042 | 添加 2 mM L-谷氨酰胺、20μg/ml 硫酸庆大霉素、表皮生长因子和牛垂体提取物。 |
| 胰蛋白酶-EDTA | Invitrogen | 15400-054 | 0.05% 胰蛋白酶/EDTA，用于解离贴壁细胞；10 倍储存液用不含 Ca2+/Mg2+ 的 PBS 稀释。 | |
| Dulbecco’s 改良必需培养基 | 生长培养基 | Invitrogen | 11885-084 | 添加 10% 胎牛血清和 20μg/ml 硫酸庆大霉素；用于中和胰蛋白酶/EDTA。 |
| 0.09% 生理盐水 | 溶液 | 用于洗涤克隆集落。 | ||
| 10% 中性缓冲福尔马林溶液 | 溶液 | Sigma-Aldrich | HT501128 | 约含 4% 甲醛；用于固定克隆集落。 |
| 结晶紫 | 粉末 | SPI Supplies | 02577-MB | 0.01% 结晶紫溶液，用 dH2O 配制，用于染色克隆集落。 |
| Gammacell 1000 elite 放射源辐照仪 | Nordion International Inc. | |||
| 培养皿 | 60 × 15 mm | Falcon BD | 353002 | |
| 血细胞计数板 | Hawksley；Medical and Laboratory Equipment | AC1000 | ||
| 克隆培养盒 | 塑料盒，盖子相对两侧打孔；用于长期孵育期间存放培养皿以形成克隆集落。 | |||
| 体视显微镜 | 型号 102 | Nikon Instruments | 用于计数由 >50 个细胞组成的克隆集落。 |
参考文献
- Puck, T. T., Marcus, P. I. Action of x-rays on mammalian cells. J Exp Med. 103, 653-666 (1956).
- Hurlin, P. J. Progression of human papillomavirus type 18-immortalized human keratinocytes to a malignant phenotype. Proc Natl Acad Sci U S A. 88, 570-574 (1991).
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
标签
