克隆形成实验：贴壁细胞

摘要

克隆形成实验用于评估细胞增殖活力的适用性已有50多年的历史。本文中，我们演示了使用贴壁细胞进行克隆形成实验的一般操作步骤。

摘要

克隆形成（或称集落形成）实验已建立超过50年；最早描述该技术的论文发表于1956年¹。除了记录该方法外，最初的里程碑式研究还首次生成了体外培养的哺乳动物（HeLa）细胞在X射线照射下的辐射剂量-反应曲线¹。克隆形成实验的基本原理是评估对照未处理细胞与经过不同处理（如电离辐射、各种化学化合物（例如细胞毒性试剂）或其他基因操作）的细胞之间在生殖存活能力（即单个细胞产生后代的能力；例如单个细胞形成包含50个或更多细胞的集落）上的差异。该实验已成为辐射生物学中最广泛接受的技术，并被广泛用于评估不同细胞系的辐射敏感性。此外，克隆形成实验也常用于监测辐射修饰化合物的效果，以及确定细胞毒性试剂和其他抗癌治疗手段对不同细胞系集落形成能力的影响。典型的使用贴壁细胞系进行的克隆形成存活实验包含三个主要步骤：1）在组织培养瓶中对细胞单层进行处理，2）制备单细胞悬液并将适量细胞接种至培养皿中，3）在适当的孵育期（根据细胞系不同，通常为1至3周）后固定并染色集落。本文中，我们以永生化人角质形成细胞系（FEP-1811）²为例，演示使用贴壁细胞系进行克隆形成实验的一般操作流程。同时，我们的目标还包括描述克隆形成实验的常见特征，例如计算接种效率和细胞经辐射暴露后的存活分数，并以一种天然抗氧化剂配方为例，展示其对辐射反应的修饰作用。

方案

1. 细胞培养与实验设置

1. 人角质形成细胞在含有15 mL角质形成细胞无血清培养基（K-SFM）（GIBCO，无血清培养基）的75 cm²组织培养瓶中以单层形式培养，培养基中添加L-谷氨酰胺（2 mM）、表皮生长因子（5 ng/mL）、牛垂体提取物（40 μg/mL）和20 mg/mL庆大霉素。细胞置于37°C、含5% CO₂的湿化环境中培养。
2. 将细胞接种至12个含有5 mL K-SFM培养基的25 cm²组织培养瓶中。

通过胰蛋白酶消化制备单细胞悬液。用磷酸盐缓冲液洗涤细胞，随后加入0.05%胰蛋白酶/EDTA溶液，孵育5-10分钟。当细胞开始变圆且约30%的细胞脱落时，加入3倍体积含10%胎牛血清的DMEM培养基以中和胰蛋白酶活性。通过反复吹打（20次）使细胞完全脱落。使用血细胞计数板对细胞进行计数。

根据细胞系的倍增时间（人FEP-1811角质形成细胞约为20小时）接种适量的细胞。实验当天应达到约90%的融合度（每瓶约10⁶个细胞）。

一个包含12个烧瓶的实验是单次克隆形成实验的最佳选择（六个未照射对照组和六个照射组），可在约四小时内完成。

2. 处理与辐照

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讨论

在此示例中，人FEP-1811角质形成细胞经不同浓度（最高达100 μg/mL）CPF处理；数据显示在37°C下用20 μg/mL CPF处理1小时的结果。处理后，细胞使用¹³⁷Cs源（Gammacell 1000 Elite辐照仪；Nordion International，ON，加拿大；1.6 Gy/min）进行4 Gy剂量的辐照。对照组（未处理组）和仅药物处理组每个培养皿接种100个细胞，辐照样本组每个培养皿接种1000个细胞。如上表所示，使用体视显微镜计数克隆，或使用ImageJ分析拍摄的数字图像（图1）进行计数。五个培养皿的平均克隆数用于计算接种效率和存活分数。数据表明，该天然抗氧化剂配方具有辐射防护作用（防护因子约为3）。

代表性结果

治疗

计数方法

细胞接种

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
角质形成细胞无血清培养基	生长培养基	Invitrogen	17005042	添加 2 mM L-谷氨酰胺、20μg/ml 硫酸庆大霉素、表皮生长因子和牛垂体提取物。
胰蛋白酶-EDTA		Invitrogen	15400-054	0.05% 胰蛋白酶/EDTA，用于解离贴壁细胞；10 倍储存液用不含 Ca2+/Mg2+ 的 PBS 稀释。
Dulbecco’s 改良必需培养基	生长培养基	Invitrogen	11885-084	添加 10% 胎牛血清和 20μg/ml 硫酸庆大霉素；用于中和胰蛋白酶/EDTA。
0.09% 生理盐水	溶液			用于洗涤克隆集落。
10% 中性缓冲福尔马林溶液	溶液	Sigma-Aldrich	HT501128	约含 4% 甲醛；用于固定克隆集落。
结晶紫	粉末	SPI Supplies	02577-MB	0.01% 结晶紫溶液，用 dH2O 配制，用于染色克隆集落。
Gammacell 1000 elite 放射源辐照仪		Nordion International Inc.
培养皿	60 × 15 mm	Falcon BD	353002
血细胞计数板		Hawksley；Medical and Laboratory Equipment	AC1000
克隆培养盒				塑料盒，盖子相对两侧打孔；用于长期孵育期间存放培养皿以形成克隆集落。
体视显微镜	型号 102	Nikon Instruments		用于计数由 >50 个细胞组成的克隆集落。