本文介绍了一种利用负染电子显微镜（EM）获取生物大分子三维（3D）结构的标准化方法。在本实验方案中，我们详细说明了如何采用随机锥形倾斜重建法（RCT），在中等分辨率下获得酿酒酵母外切体复合物的三维结构。
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摘要
摘要
单颗粒电子显微镜（EM）重构技术近年来已成为获取大分子复合物三维（3D）结构的常用工具。与X射线晶体学相比，该技术具有一些独特的优点。首先，单颗粒EM重构无需对蛋白质样品进行结晶，而结晶正是X射线晶体学中的瓶颈环节，尤其对于大分子复合物而言。其次，该技术不需要大量的蛋白质样品。相比晶体学通常所需的毫克级蛋白量，采用负染EM方法进行单颗粒EM重构仅需数微升纳摩尔浓度的蛋白质溶液。然而，尽管对于少数具有高对称性的大分子组装体可获得较高分辨率，但对于许多样品——尤其是缺乏对称性的样品——单颗粒EM通常只能达到相对较低的分辨率（低于1 nm）。此外，该技术还受限于所研究分子的大小，一般而言，负染样品的分子量下限约为100 kDa，冷冻水合样品约为300 kDa。
对于结构未知的新样品，我们通常使用重金属溶液通过负染色法将分子包埋。随后在透射电子显微镜下观察样品，获取分子的二维（2D）显微图像。理想情况下，蛋白质分子具有均一的三维（3D）结构，但在显微图像中呈现出不同的取向。这些显微图像被数字化，并在计算机中作为“单颗粒”进行处理。通过二维对齐和分类技术，将具有相同视角的均一分子聚类成不同类别。对各类别进行平均处理可增强分子二维形状的信号。在为颗粒分配适当的相对取向（欧拉角）后，即可将二维颗粒图像重构为三维虚拟体积。
在单颗粒三维重构中，一个关键步骤是正确确定每个单颗粒的取向。目前有多种方法可用于为每个颗粒分配视角，包括角重构法1和随机锥形倾斜（RCT）方法2。在本实验方案中，我们描述了利用负染电镜结合随机锥形倾斜法获得酵母外切体复合物三维结构的具体操作流程。需要指出的是，我们的电镜实验与图像处理流程遵循RCT的基本原理，但并非实施该方法的唯一途径。我们首先介绍如何将蛋白质样品嵌入厚度与蛋白质分子尺寸相当的甲酸铀酰层中，所用载网为带有连续超薄碳膜的多孔碳支持膜。随后将样品插入透射电子显微镜，采集未倾斜（0度）和倾斜（55度）的显微图像对，用于后续处理并获得酵母外切体的初始三维模型。为此，我们先进行随机锥形倾斜重构，再通过投影匹配优化方法3对初始三维模型进行精细优化。
方案
1. 随机锥形倾斜法的原理
- 随机锥形倾斜法的原理要求在电子显微镜内对样品的同一区域拍摄一对显微照片。其中一张照片为样品未倾斜状态下的图像（图1A），另一张照片为样品倾斜50至70度角时的图像（本实验中采用55度）（图1B）。
- 通过计算机将数字化的显微照片成对并列放置，并选取来自相同颗粒的图像（图1C）。
- 在三维坐标系中，未倾斜颗粒与其倾斜对应颗粒的图像通过倾斜轴方向和倾斜角度相互关联（图1D）。
- 对未倾斜颗粒图像进行对齐，可使倾斜颗粒图像到达其相应的方位角位置（图1E）。
- 利用填充了整个方位角空间的多个倾斜颗粒图像，可通过反投影算法重构出分子的三维结构（图1F）
图1. 随机锥形倾斜法（RCT）重构原理示意图。
2. 准备覆盖薄碳的载网铜网
原理：我们采用负染色法固定蛋白质样品，用于随机锥形倾斜重构。为了在干燥过程中尽可能保持大分子结构，避免过度压平，我们尝试....
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讨论
本文中，我们详细介绍了一种利用负染色电子显微镜技术对外泌体复合物进行样品制备及三维重构的实验方案。通过该方法，我们在无需任何先验结构信息的情况下，采用随机锥形倾斜法获得了外泌体的三维重构图像。随机锥形倾斜法并不要求样品必须均一，但后续的投影匹配精细优化步骤则需要样品具备均一性，才能实现高分辨率的重构结果。
对于负染样品，染色层的厚度对于实现随机锥形倾斜法至关重要。染色过薄会导致在高倾斜角度下分子出现黑色晕圈，从而在重构过程中引入伪影；染色过厚则会降低显微照片中颗粒的信噪比。我们所使用的覆盖有一层薄连续碳膜的载网（带孔碳膜）有助于更轻松地实现最佳染色条件。自制的带孔碳膜载网可用 commercially available 的 Quantifoil 或 C-flat 等商品化带孔载网替代。然而，自制带孔碳膜上不规则分布的孔洞可能有助于在低倍和高倍下对倾斜显微照片进行对齐。
在本实验方案中，应特别注意透射电子显微镜部分，其中必须仔细进行图像对齐，以获得倾斜与未倾斜显微照片的对应区域，并使倾斜与未倾斜显微照片之间的重叠区域最大化.......
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
作者感谢加州大学伯克利分校Nogales实验室成员在建立初始方案过程中提供的帮助，以及耶鲁大学Wang实验室成员在完善全部方案过程中给予的支持。我们同时感谢耶鲁大学医学院冷冻电镜设施和高性能计算中心工作人员提供的协助。HW是史密斯家族奖获得者。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 聚乙烯醇缩甲醛树脂 | Electron Microscopy Sciences | 63450-15-7 | |
| 甲酸铀酰 | Electron Microscopy Sciences | 22451 | |
| Superfrost 显微镜载玻片 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 4951F-001 | |
| 400 目常规网格 | SPI Supplies | 3040C | |
| 碳镀膜仪 Auto 306 | Edwards Lifesciences | ||
| Tecnai-12 透射电子显微镜 | FEI | ||
| 辉光放电器 | BAL-TEC | 溅射镀膜仪 SCD 005 |
参考文献
- van Heel, M. Angular reconstitution: a posteriori assignment of projection directions for 3D reconstruction. Ultramicroscopy. 21, 111-123 (1987).
- Radermacher, M. Three-dimensional reconstruction of single particles fr....
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