本文介绍了一种利用负染电子显微镜（EM）获取生物大分子三维（3D）结构的标准化方法。在本实验方案中，我们详细说明了如何采用随机锥形倾斜重建法（RCT），在中等分辨率下获得酿酒酵母外切体复合物的三维结构。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
单颗粒电子显微镜（EM）重构技术近年来已成为获取大分子复合物三维（3D）结构的常用工具。与X射线晶体学相比，该技术具有一些独特的优点。首先，单颗粒EM重构无需对蛋白质样品进行结晶，而结晶正是X射线晶体学中的瓶颈环节，尤其对于大分子复合物而言。其次，该技术不需要大量的蛋白质样品。相比晶体学通常所需的毫克级蛋白量，采用负染EM方法进行单颗粒EM重构仅需数微升纳摩尔浓度的蛋白质溶液。然而，尽管对于少数具有高对称性的大分子组装体可获得较高分辨率，但对于许多样品——尤其是缺乏对称性的样品——单颗粒EM通常只能达到相对较低的分辨率（低于1 nm）。此外，该技术还受限于所研究分子的大小，一般而言，负染样品的分子量下限约为100 kDa，冷冻水合样品约为300 kDa。
对于结构未知的新样品，我们通常使用重金属溶液通过负染色法将分子包埋。随后在透射电子显微镜下观察样品，获取分子的二维（2D）显微图像。理想情况下，蛋白质分子具有均一的三维（3D）结构，但在显微图像中呈现出不同的取向。这些显微图像被数字化，并在计算机中作为“单颗粒”进行处理。通过二维对齐和分类技术，将具有相同视角的均一分子聚类成不同类别。对各类别进行平均处理可增强分子二维形状的信号。在为颗粒分配适当的相对取向（欧拉角）后，即可将二维颗粒图像重构为三维虚拟体积。
在单颗粒三维重构中，一个关键步骤是正确确定每个单颗粒的取向。目前有多种方法可用于为每个颗粒分配视角，包括角重构法1和随机锥形倾斜（RCT）方法2。在本实验方案中，我们描述了利用负染电镜结合随机锥形倾斜法获得酵母外切体复合物三维结构的具体操作流程。需要指出的是，我们的电镜实验与图像处理流程遵循RCT的基本原理，但并非实施该方法的唯一途径。我们首先介绍如何将蛋白质样品嵌入厚度与蛋白质分子尺寸相当的甲酸铀酰层中，所用载网为带有连续超薄碳膜的多孔碳支持膜。随后将样品插入透射电子显微镜，采集未倾斜（0度）和倾斜（55度）的显微图像对，用于后续处理并获得酵母外切体的初始三维模型。为此，我们先进行随机锥形倾斜重构，再通过投影匹配优化方法3对初始三维模型进行精细优化。
方案
1. 随机锥形倾斜法的原理
- 随机锥形倾斜法的原理要求在电子显微镜内对样品的同一区域拍摄一对显微照片。其中一张照片为样品未倾斜状态下的图像（图1A），另一张照片为样品倾斜50至70度角时的图像（本实验中采用55度）（图1B）。
- 通过计算机将数字化的显微照片成对并列放置，并选取来自相同颗粒的图像（图1C）。
- 在三维坐标系中，未倾斜颗粒与其倾斜对应颗粒的图像通过倾斜轴方向和倾斜角度相互关联（图1D）。
- 对未倾斜颗粒图像进行对齐，可使倾斜颗粒图像到达其相应的方位角位置（图1E）。
- 利用填充了整个方位角空间的多个倾斜颗粒图像，可通过反投影算法重构出分子的三维结构（图1F）
图1. 随机锥形倾斜法（RCT）重构原理示意图。
2. 准备覆盖薄碳的载网铜网
原理：我们采用负染色法固定蛋白质样品，用于随机锥形倾斜重构。为了在干燥过程中尽可能保持大分子结构，避免过度压平，我们尝试将蛋白质分子包埋在较深的染色剂中，其厚度约为蛋白质分子的尺寸4。通常，制备负染样品时使用连续碳膜。然而，这种碳膜难以控制蛋白质颗粒周围染色剂的厚度。因此，我们使用自制的载有薄层碳膜（约5 nm厚度）的穿孔碳膜载网制备负染样品。载网上的小孔可形成微小凹坑，能够有效滞留蛋白质溶液和染色液，从而更易于将蛋白质包埋在理想的染色剂厚度中。此外，孔洞上方的薄碳层显著降低了背景噪声。
- 配制 0.5% Formvar 溶液。在通风橱中，向 100 mL 玻璃烧杯中加入 0.45 g 聚乙烯醇缩甲醛树脂和 90 mL 氯仿。用铝箔覆盖烧杯，并使用小磁力搅拌子在磁力搅拌器上助溶，溶解约需 15 分钟。
- 在 Formvar 溶解过程中，用甲醇清洗显微镜玻片，并用 Kimwipes 擦干。
- 待 Formvar 树脂在氯仿中完全溶解后，向溶液表面加入 1 mL 50% 甘油。调节所加甘油的体积可影响载网碳膜上孔洞的密度。将超声波破碎仪的探头插入溶液约 2.5 cm 深度，以最大功率超声 1 分钟，使甘油在 Formvar 溶液中形成乳液。此步骤后溶液呈乳白色。延长超声时间可使载网碳膜上的孔洞尺寸更小。
- 超声结束后立即垂直将清洗过的玻片浸入乳液中 1 秒，取出后用滤纸轻触玻片底部，以在玻片表面形成一层薄塑料膜。待氯仿完全挥发后，在光学显微镜下检查膜上孔洞的密度和大小，并根据需要调整制备条件。按本方案所述条件，通常可获得直径为 3~4 微米的孔洞，在 400 目网格的每个方格中约有 10~20 个孔。
- 待玻片干燥后，用刀片在玻片表面塑料膜边缘划痕，使其漂浮于去离子水表面。从斜角观察水面反射光，可看到水面上的薄膜。逐个将 400 目铜网放置于薄膜上，确保铜网光滑面朝下。
- 用一张纸将带有铜网的薄膜捞起，翻转后置于培养皿中晾干。将纸浸入甲醇中以去除孔洞中残留的甘油，再将纸在空气中晾干。
- 在碳蒸发仪中，在铜网上蒸镀一层厚度约为 20 纳米的碳膜。碳膜厚度可通过其灰度颜色判断。
- 将带有碳膜的铜网在氯仿中浸泡半小时以去除 Formvar。待铜网干燥后，即获得自制的多孔碳载网。
- 在新解理的云母表面蒸镀一层厚度约为 5 纳米的薄碳层。
- 小心将多孔碳载网置于去离子水下方，将薄碳层从云母表面缓慢转移至水面上，并使其缓慢沉积到多孔碳载网上。最后在通风橱中干燥载网。
3. 外泌体复合物的负染色法
原理：可用于负染电镜的重金属染色液有多种，包括醋酸铀酰、甲酸铀酰、磷钨酸、钼酸铵等。不同的染色液具有各自独特的性质。例如，醋酸铀酰可提供较高的颗粒反差，但可能破坏在酸性环境中不稳定的蛋白质复合物。对于此类样品，可选用中性 pH 的磷钨酸作为染色液。我们选择饱和的甲酸铀酰（UF）溶液，因其具有细腻的颗粒性和对分子结构良好的穿透能力。
- 将蒸馏水煮沸 1 分钟，然后缓慢冷却至室温。此步骤旨在去除水中的溶解氧。
- 新鲜配制 2% 的醋酸铀酰（UF）溶液。取 1 mL 水与 20 mg UF 加入 1.5 mL 离心管中，涡旋混合 10 分钟。
- 加入 2 微升 10 M 氢氧化钾将溶液 pH 值调节至 5.0，立即混匀。溶液颜色应变得更黄。溶液 pH 值不宜过高，否则会导致染色剂沉淀。
- 将离心管继续置于涡旋振荡器上振荡 10 分钟。
- 在台式离心机中以最大转速离心 10 分钟。
- 使用 0.2 微米 PVDF 膜过滤溶液。此即为新鲜配制的 UF 溶液。用铝箔包裹溶液管以避光。该溶液必须在当天内使用完毕。
- 使用辉光放电仪对覆有薄碳膜的载网进行辉光放电处理，电流为 25 mA，处理时间为 30 秒。
- 在实验台上放置一块干净的 Parafilm 膜，在其表面滴加 3 滴 50 微升的 UF 染色液。
- 使用稀释缓冲液（25 mM Tris-HCl pH 7.5，100 mM NaCl，2 mM DTT）将外泌体复合物稀释至浓度为 50 ~ 100 nM。取 4 微升稀释后的蛋白样品滴加至经辉光放电处理的载网上，静置 1 分钟。（注意：该终浓度通常可在负染载网上获得密度适中且分散良好的颗粒。对于醋酸铀酰或甲酸铀酰染色液，磷酸盐或高浓度盐（高于 0.5 M）通常不利于获得良好的染色效果。根据我们的经验，HEPES 或 PIPES 缓冲体系与铀酰染色液配合使用效果良好。）
- 用滤纸从载网边缘吸去残留液体，立即将载网翻转至染色液滴上，依次在每个液滴上漂洗约 10 秒。
- 最后一次漂洗后，让染色液在载网上停留 1 分钟，然后用滤纸吸去多余染色液，保留一层薄薄的染色液覆盖在载网表面，以获得良好的深染效果。将载网在通风橱中快速晾干。
4. 外泌体复合物的电子显微镜观察
原理：任何配备倾斜台的透射电子显微镜均可用于采集样品的倾斜对图像，以进行断层扫描重建。理论上，样品可倾斜的角度越大，越有利于数据采集。然而在实际操作中，由于样品 holder 的设计以及载网的几何结构限制，最大可用倾斜角度通常被限制在 50 至 70 度之间。本方案仅以 FEI Tecnai-12 电子显微镜为例描述我们的操作流程；对于其他型号的显微镜，需根据具体项目需求和仪器特性对操作进行相应调整。
- 将样品载网放入样品 holder 中，然后将 holder 插入 FEI Tecnai -12 透射电子显微镜。显微镜在 120 kV 下运行。我们使用 Gatan Ultrascan4000 CCD 相机拍摄图像。请确保在 Digital Micrograph 界面的“config camera”对话框中未选中“Flip around vertical axis”（垂直翻转）选项，以保证手性判断的正确性。（注意：这一点尤其重要，特别是当使用者依赖 SPIDER RCT 重构流程获取三维模型时。）
- 在低倍率下检查样品载网，寻找染色效果最佳的方格区域。理想的方格应包含约十几个直径为 1~2 微米的孔洞，并具有较深的染色区域。（图 2）
图 2. 显示染色效果好与差的方格的低倍显微图像。 - 开启 FEI 用户界面的低剂量模式，并在低剂量模式下对齐搜索、聚焦和曝光位置。我们使用 150,000 倍用于聚焦，52,000 倍用于曝光，衍射模式下相机长度设为 1.5 米。曝光时间调整为 1 秒。将聚焦位置设置在沿倾斜轴方向距离曝光位置约 2 微米处。
- 在搜索模式下找到染色良好的孔洞，并保存其位置。通常在搜索模式下观察到具有明显深色染色梯度的孔洞为优质孔洞。对选定方格拍摄一张 CCD 图像，然后将样品倾斜 55 度，再拍摄另一张图像。比较两张图像，识别出两幅显微图像中对应的配对孔洞。（图 3）
图 3. 搜索模式下方格的一组倾斜配对显微图像。已标示出对应的配对孔洞。 - 将样品台转回 0 度。使用低剂量模式在高倍率下对搜索模式中已识别的每个孔洞进行成像。所用的离焦量约为 -0.7 微米。
- 完成所有未倾斜图像的采集后，将样品台倾斜至 55 度，在与未倾斜图像相同的放大倍数下拍摄倾斜样品的显微图像，离焦量约为 -1.2 微米。根据低倍显微图像中的特征模式，识别对应的倾斜图像配对。自制的多孔碳膜载网所具有的不规则图案有助于图像匹配。检查倾斜配对的显微图像，剔除染色不良的图像，例如染色过浅的区域（在倾斜条件下，颗粒周围出现光晕现象）。（图 4）
图 4. 样品在高倍率下的两组倾斜配对显微图像。已标记出质量良好与较差的显微图像。
5. 数据的图像处理
原理：在计算机中进行随机圆锥倾斜（RCT）重构有多种选择和软件包，其中最常用的是 SPIDER5。可在以下网页找到在 SPIDER 中执行 RCT 的基本方案：http://www.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/techs/rancon/recn.html。Shaikh et al.6 的文章中描述了在 SPIDER 中进行 RCT 的详细方案。在本方案的视频版本中，我们结合使用 IMAGIC-57 和 SPIDER；同时，在文本版本中我们还提供了一种仅使用 SPIDER 的替代流程。
- 设置程序。我们使用 EMAN8 软件包中的 proc2d 将图像格式从 Gatan 数字图像转换为 SPIDER 图像格式。使用 IMAGIC-5 进行二维比对。使用 SPIDER 进行三维重构与优化。
子步骤 1：挑选颗粒的倾斜对。
- 使用 EMAN 中的 proc2d 命令将 *.dm3 Gatan 数字图像转换为 SPIDER 图像格式。倾斜对和未倾斜对的图像分别按 ***t.spi 和 ***u.spi 的命名模式命名。
- 使用 SPIDER 程序包中提供的“WEB”程序挑选粒子对。请参考网页 http://www.wadsworth.org/spider_doc/web/docs/web.html 和 http://www.wadsworth.org/spider_doc/web/docs/particles.html 中的说明。未倾斜和倾斜粒子的坐标将自动保存在 dcu***.spi 和 dct***.spi 文件中。另一个文件 dcb***.spi 包含倾斜与未倾斜粒子之间的倾斜角度信息。（注意：在 WEB 中对倾斜对进行拟合时得到的三个角度不能保证最终重构结果具有正确的手性，因为 theta 角没有符号（仅为正值），而 phi 和 gamma 角依赖于初始设定值。通过检查倾斜显微照片上离焦梯度的方向，有助于在拟合前设定正确的 phi 和 gamma 初始值，从而获得正确手性的重构结果。图5说明了正确的约定。）
图 5. 说明在 WEB 倾斜对粒子挑选拟合模式中，由离焦梯度决定的角度约定示意图。H 表示高离焦区域，L 表示低离焦区域。箭头表示倾斜轴。每种情况下对应的正确初始 PHI 和 GAMMA 角度均已标出。 - 使用修改版的 SPIDER 脚本裁剪出所有已挑选的粒子，该脚本示例见网页 http://www.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/partpick.html。脚本将未倾斜和倾斜的粒子堆栈分别保存为 u.spi 和 t.spi。粒子来源的显微照片编号应保存在 particle_list.spi 文件中。（注意：这对于为 RCT 生成正确的欧拉角文件至关重要。）
第2小节：未倾斜粒子图像的二维对齐与分类。
- 使用 Imagic-5 软件包中的 em2em 程序将未倾斜的颗粒转换为 IMAGIC-5 格式。使用 IMAGIC-5 程序迭代地对颗粒进行对齐和分类，以获得同质的类别（参见附录 A）。使用 IMAGIC-5 中的 msa-names-in-class 命令生成颗粒的类别查找表，并将其保存为 imagic_classes.lis。（注意：分类与对齐的目的是增加具有相同形状的颗粒数量，并减少每个类别内的变异程度。每个类别的方差图可提供有关该类别质量的信息。）
- 使用 IMAGIC-5 中的 header 命令生成每个颗粒对齐的平移与旋转值的绘图文件（在视频演示中为 ali_50.plt）。
- 使用在 http://cryoem.berkeley.edu 提供的 Perl 脚本 lis2spi.pl，将类别查找表转换为 SPIDER 文档文件 base_file***.spi。
- 使用在 http://cryoem.berkeley.edu 提供的脚本 plt2spi.pl，将第 5.6 步生成的平移与旋转值绘图文件中的每个颗粒的对齐参数转换为 SPIDER 文档文件 ali_50.spi。
我们使用 IMAGIC-5 进行二维对齐和分类，因为在本实验条件下其表现最佳。SPIDER 中用于二维对齐和分类的替代策略可参见 http://www.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/align.html。我们也曾使用 SPIDER 对外泌体的未倾斜颗粒进行二维分析。以下为一个简化的操作流程。
替代步骤 5.5）参照网页 http://www.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/align.html#refree 和 http://www.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/reffreealign.html 中描述的无参考对齐方法对图像进行对齐。两个简单的脚本可从 http://www.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/techs/rancon/proc/b05.aps 和 http://www.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/techs/rancon/proc/b06.rts 获取。将所有颗粒的旋转与平移参数保存在一个文档文件 angular_file.spi 中。
替代步骤 5.6）参照网页 http://www.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/techs/MSA/index.htm 和 http://www.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/techs/classification/tutorial.html 中描述的方法，将已对齐的颗粒按相同视角分类。我们采用 K-均值法（K-means method）进行分类。根据分类结果生成 base_file***.spi。
第3小节：利用倾斜粒子图像进行三维重构。
- 使用 IMAGIC-5 对倾斜颗粒进行带通滤波、掩膜处理并居中，方法与未倾斜颗粒相同。为倾斜颗粒生成新的数据集。（注意：此步骤为可选步骤，也可在 SPIDER 中完成。）
- 利用附录 B 中的 SPIDER 脚本，根据分类查找表文件 ali_50.spi、步骤 5.3 中通过网页生成的 dcb***.spi 文件以及步骤 5.4 中的颗粒列表文件 particle_list.spi，创建角度信息文档文件。
- 使用 SPIDER 中的重构脚本，按照 http://www.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/techs/rancon/recn.html 所述方法对每一类颗粒进行三维重构。每一类颗粒对应生成一个三维重构体积。可在 UCSF-Chimera9 中查看这些三维模型。将三维模型在欧拉角 (0,0,0) 下的二维投影与未倾斜颗粒对应的二维分类平均图像进行比较，以验证重构质量。找出相似的体积，对其进行比对并合并，按照 http://www.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/techs/rancon/recn.html 中所述流程生成初始体积。
第4小节：利用未倾转的颗粒图像优化三维重构。
- 使用 SPIDER 脚本，将合并后的初始体积与所有未倾斜的粒子进行投影匹配精修，以获得更高分辨率的体积结构，消除缺失锥和扁平化伪影，具体方法参见 http://www.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/techs/recon/refine.html。
6. 代表性结果：
利用 RCT 方法，我们从总共 5,000 对倾斜图像中获得了约 50 个外泌体的重构结果（图 6）。在这 50 个三维模型中，可以观察到该复合物以不同取向吸附在载网上，主要呈现两种正交视角。许多重构体积中还可检测到垂直于碳膜表面方向上的压扁假象。我们对这些三维体积进行了对齐与合并，生成了两个正交视角下的初始体积。利用这 5,000 张未倾斜的颗粒图像，我们从两个初始模型均获得了相同的最终外泌体三维重构结果，分辨率约为 18 埃（图 7）。该结构揭示了酵母外泌体的架构，并为 RNA 底物招募通路提供了见解10。
图6. 通过RCT重构获得的50个外泌体复合物的三维模型。
图7. 外泌体复合物经精细优化后的三维重建。
附录：
附录 A. 在 IMAGIC-5 中进行二维比对与分类的脚本文件。
文件：auto_align_i.sh
点击此处获取文件
附录 B. 在 SPIDER 中生成三维重构角度文件的脚本文件。
文件：generate_angular_file.spi
点击此处获取文件
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
本文中，我们详细介绍了一种利用负染色电子显微镜技术对外泌体复合物进行样品制备及三维重构的实验方案。通过该方法，我们在无需任何先验结构信息的情况下，采用随机锥形倾斜法获得了外泌体的三维重构图像。随机锥形倾斜法并不要求样品必须均一，但后续的投影匹配精细优化步骤则需要样品具备均一性，才能实现高分辨率的重构结果。
对于负染样品，染色层的厚度对于实现随机锥形倾斜法至关重要。染色过薄会导致在高倾斜角度下分子出现黑色晕圈，从而在重构过程中引入伪影；染色过厚则会降低显微照片中颗粒的信噪比。我们所使用的覆盖有一层薄连续碳膜的载网（带孔碳膜）有助于更轻松地实现最佳染色条件。自制的带孔碳膜载网可用 commercially available 的 Quantifoil 或 C-flat 等商品化带孔载网替代。然而，自制带孔碳膜上不规则分布的孔洞可能有助于在低倍和高倍下对倾斜显微照片进行对齐。
在本实验方案中，应特别注意透射电子显微镜部分，其中必须仔细进行图像对齐，以获得倾斜与未倾斜显微照片的对应区域，并使倾斜与未倾斜显微照片之间的重叠区域最大化...
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
未声明任何利益冲突。
致谢
作者感谢加州大学伯克利分校Nogales实验室成员在建立初始方案过程中提供的帮助，以及耶鲁大学Wang实验室成员在完善全部方案过程中给予的支持。我们同时感谢耶鲁大学医学院冷冻电镜设施和高性能计算中心工作人员提供的协助。HW是史密斯家族奖获得者。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 聚乙烯醇缩甲醛树脂 | Electron Microscopy Sciences | 63450-15-7 | |
| 甲酸铀酰 | Electron Microscopy Sciences | 22451 | |
| Superfrost 显微镜载玻片 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 4951F-001 | |
| 400 目常规网格 | SPI Supplies | 3040C | |
| 碳镀膜仪 Auto 306 | Edwards Lifesciences | ||
| Tecnai-12 透射电子显微镜 | FEI | ||
| 辉光放电器 | BAL-TEC | 溅射镀膜仪 SCD 005 |
参考文献
- van Heel, M. Angular reconstitution: a posteriori assignment of projection directions for 3D reconstruction. Ultramicroscopy. 21, 111-123 (1987).
- Radermacher, M. Three-dimensional reconstruction of single particles from random and nonrandom tilt series. J Electron Microsc Tech. 9, 359-394 (1988).
- Penczek, P. A., Grassucci, R. A., Frank, J. The ribosome at improved resolution: new techniques for merging and orientation refinement in 3D cryo-electron microscopy of biological particles. Ultramicroscopy. 53, 251-270 (1994).
- Ohi, M., Li, Y., Cheng, Y., Walz, T. Negative staining and image classification - powerful tools in modern electron microscopy. Biol Proced Online. 6, 23-34 (2004).
- Frank, J., Radermacher, M., Penczek, P., Zhu, J., Li, Y., Ladjadj, M., Leith, A. SPIDER and WEB: processing and visualization of images in 3D electron microscopy and related fields. J Struct Biol. 116, 190-199 (1996).
- Shaikh, T. R., Gao, H., Baxter, W. T., Asturias, F. J., Boisset, N., Leith, A., Frank, J. SPIDER image processing for single particle reconstruction of biological macromolecules from electron micrographs. Nat Protoc. 3, 1941-1974 (2008).
- Heel, M. van, Harauz, G., Orlova, E. V., Schmidt, R., Schatz, M. A new generation of the IMAGIC image processing system. J Struct Biol. 116, 17-24 (1996).
- Ludtke, S. J., Baldwin, P. R., Chiu, W. EMAN: semiautomated software for high-resolution single-particle reconstructions. J Struct Biol. 128, 82-97 (1999).
- Pettersen, E. F., Goddard, T. D., Huang, C. C., Couch, G. S., Greenblatt, D. M., Meng, E. C., Ferrin, T. E. UCSF Chimera--a visualization system for exploratory research and analysis. J Comput Chem. 25, 1605-1612 (2004).
- Wang, H. W., Wang, J., Ding, F., Callahan, K., Bratkowski, M. A., Buttler, J. S., Nogales, E., Ke, A. Architecture of the yeast Rrp44 exosome complex suggests routes of RNA recruitment for 3' end processing. Proc Natl Acad Sci USA. 104, 16844-16849 (2007).
- Scheres, S. H., Nunez-Ramirez, R., Sorzano, C. O., Carazo, J. M., Marabini, R. Image processing for electron microscopy single-particle analysis using Xmipp. Nat Protoc. 3, 977-990 (2008).
- Yoshioka, C., Pulokas, J., Fellmann, D., Potter, C. S., Milligan, R. A., Carragher, B. Automation of random conical tilt and orthogonal tilt data collection using feature-based correlation. J Struct Biol. 159, 335-346 (2007).
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
