演示用于记录新生啮齿类动物脊髓电生理信号的细胞外吸吮电极的制备与使用方法 体外
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
可利用新生啮齿类动物脊髓中央模式发生器（CPG）活动来研究神经环路和运动功能的发育。本文演示一种制备吸吮电极的方法，用于检测离体啮齿类动物脊髓中的CPG活动，即“虚拟”运动。将啮齿类动物的脊髓置于人工脑脊液中，并将腹根吸入吸吮电极内。该电极通过对市售吸吮电极进行改良而制成：采用更粗的银丝替代原装的标准导线，并将市售电极的玻璃尖端替换为塑料尖端以提高耐用性。我们制备了手工拉制的电极以及采用特定规格导管制成的电极，以确保实验的一致性和可重复性。数据通过放大器和神经图记录软件进行采集。记录过程在气浮台上进行，并置于法拉第笼内，以分别避免机械和电学干扰。
方案
离体脊髓的电生理记录可揭示神经回路的遗传和发育变化1。我们此前已报道了一种分离新生小鼠脊髓的方法2。本文介绍一种制备吸吮电极的方法，该电极可用于记录离体脊髓中的拟态运动3。
可通过低温酒精灯手工将塑料管电极的尖端拉制成极细的尖端3-5。将塑料管（PE90，Clay Adams IntramedicTM）置于火焰上方加热，使其软化至可塑状态。当管材开始熔化并变得半透明时，即从热源移开，并轻轻将两端拉伸。从火焰中移出管材的时机至关重要，以确保塑料在拉伸过程中不会塌陷或开裂。根据标本的年龄或脊髓节段水平所要求的内径，用剃刀片切割出所需长度的细管部分。为便于在管上安装O形圈，可用剃刀片在管的粗端切出一个45°的斜面。在粗端安装卡套和O形圈，以便将电极尖端连接至电极筒体上。
为了获得特定尺寸的电极并避免手工拉制电极尖端的困难，可使用小口径导管插入较粗导管（PE90）中来制备电极。导管的长度根据记录装置的具体需求而定，可作调整。我们在此列出本实验中所采用的尺寸1-3,5。使用剃刀切割一段1 cm长的PTFE细导管（Zeus, Small Parts）和一段10 cm长的PE90导管。应检查细导管两端，确保其未被压扁或封闭；如有必要，可用昆虫针（Fine Science Tools）将其开口。在PTFE导管的中点位置滴加一滴粘合剂（JB Weld）。通过用嘴对PE90导管施加负压，将PTFE导管及粘合剂吸入PE90导管内。在导管较粗的一端做45°斜切，并如前所述安装套管和O型圈。
将市售的吸电极上的套圈和BNC连接器拧下。将BNC连接器浸泡在二甲苯中一小时，以去除蜡封。随后用清水冲洗连接器并使其干燥。
必须在电极管侧面以较低角度开一个侧向端口。使用本生灯加热一根金属棒，并以较低角度压入电极管侧面已有的孔中。截取一段15 cm长、直径0.010英寸的银丝（A-M Systems），将其浸泡在漂白剂中15分钟，以形成氯化银涂层，从而增强信号传导能力6。随后用清水冲洗银丝并使其干燥，然后焊接至BNC接头。将BNC接头和银丝插入吸电极管内，确保BNC接头保留在管侧留有足够空间。将吸管插入侧向端口约2-3 cm。向电极管内注入约2-3 cm深的硅胶密封剂。将BNC接头旋入电极管体内，推动密封剂向前移动。
现在将电极的尖端穿入电极的前端。还可以在侧端口的吸管线上加装热缩管以加强固定。
电极安装在连接于磁性支架的显微操作器上，并置于记录皿附近。BNC同轴电缆连接至一个与放大器相连的前置放大器头级。放大器连接到一个适配器（Polyview），该适配器连接至一台PC计算机中的模拟-数字转换卡（National Instruments），并通过数据采集软件（Polyview）进行信号采集。
记录电生理数据时，必须消除所有外部干扰。将记录皿、放大器和前置放大器置于法拉第笼内的气浮台上，分别以防止电干扰和机械干扰。
代表性结果：
图 1. 可通过添加更粗的银丝以及在酒精灯上手工拉制的塑料尖端，对市售的吸电极进行改造，或使用特定尺寸的市售塑料管自行构建。此外，将石蜡密封剂替换为更耐用的硅酮密封胶。
图 2. 吸引电极与气浮台（用于机械隔离）、法拉第笼（用于电隔离）、放大器及计算机之间关系的示意图。需要注意的是，记录皿处设有一个接地点，另一个接地点则与气浮台和法拉第笼相连。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
可以利用分离的啮齿类动物脊髓来研究神经系统发育。在神经递质存在的情况下，脊髓能够产生模式化的电活动，从而形成虚拟步态运动1,3。这些节律性放电的频率为0.2至0.5 Hz，并表现出左右侧以及屈肌-伸肌之间的交替模式。在不同的发育阶段，这种活动的稳定性及其模式会有所变化1。基因突变也可能破坏该活动的模式化特征3,5,7。对该活动进行转基因和发育学研究，有助于深入了解中枢模式发生回路的组织结构，并为神经发育研究提供重要信息。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
致谢
Samuel L. Pfaff 是索尔克生物研究所基因表达实验室的教授，同时也是霍华德·休斯医学研究所的研究员。本工作由克里斯托弗和丹娜·里夫基金会资助。索尔克研究所多媒体资源部门的 Joe Belcovson、Kent Schnoeker 和 Mike Sullivan 在摄影与编辑方面提供了协助。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| PTFE 超细壁管（细管） | Zeus | 36AWG | 内径 0.005” × 壁厚 0.003”（小零件），也可提供 0.003” 至 0.006” 规格 |
| 粗管（0.86 mm（0.34”）） | BD Biosciences | 427420 | 外径 0.86 mm（0.34”），内径 1.27 mm（0.050”） |
| 电极管体 | A-M Systems | 573000 | |
| 粘合剂 | JB Weld | ||
| 粘合剂：硅酮密封胶 | |||
| 焊锡及电烙铁 | |||
| 漂白剂 | |||
| 二甲苯 | |||
| 银丝：0.010” | A-M Systems | ||
| 昆虫针：Austerlitz 0.1 mm | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| 磁力支架 | Narishige International | GJ-8 | |
| 显微操作器 | Narishige International | MN 151 | |
| 小型前置放大板（头戴式放大器） | Grass Technologies | F-15EB/B1 | |
| Polyview 适配器单元 | Grass Technologies | PVA 8 | |
| 双极式便携生理信号放大系统 | Grass Technologies | 15LT | |
| 模拟-数字转换卡 | National Instruments | 6035E | |
| 防震台；Vibraplane | Kinetic Systems |
参考文献
- Gallarda, B. W., Sharpee, T. O., Pfaff, S. L., Alaynick, W. A. Defining rhythmic locomotor burst patterns using a continuous wavelet transform. Ann N Y Acad Sci. 1198, 133-139 (2010).
- Meyer, A., Gallarda, B. W., Pfaff, S., Alaynick, W. Spinal cord electrophysiology. J Vis Exp. , (2010).
- Gallarda, B. W. Segregation of axial motor and sensory pathways via heterotypic trans-axonal signaling. Science. 320, 233-236 (2008).
- Landmesser, L. The development of motor projection patterns in the chick hind limb. J Physiol. 284, 391-414 (1978).
- Myers, C. P. Cholinergic input is required during embryonic development to mediate proper assembly of spinal locomotor circuits. Neuron. 46, 37-49 (2005).
- Chanin, M. The determination of chloride by use of the silver-silver chloride electrode. Science. 119, 323-324 (1954).
- Goulding, M. Circuits controlling vertebrate locomotion: moving in a new direction. Nat Rev Neurosci. 10, 507-518 (2009).
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
标签
