演示用于记录新生啮齿类动物脊髓电生理信号的细胞外吸吮电极的制备与使用方法 体外
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摘要
摘要
可利用新生啮齿类动物脊髓中央模式发生器（CPG）活动来研究神经环路和运动功能的发育。本文演示一种制备吸吮电极的方法，用于检测离体啮齿类动物脊髓中的CPG活动，即“虚拟”运动。将啮齿类动物的脊髓置于人工脑脊液中，并将腹根吸入吸吮电极内。该电极通过对市售吸吮电极进行改良而制成：采用更粗的银丝替代原装的标准导线，并将市售电极的玻璃尖端替换为塑料尖端以提高耐用性。我们制备了手工拉制的电极以及采用特定规格导管制成的电极，以确保实验的一致性和可重复性。数据通过放大器和神经图记录软件进行采集。记录过程在气浮台上进行，并置于法拉第笼内，以分别避免机械和电学干扰。
方案
离体脊髓的电生理记录可揭示神经回路的遗传和发育变化1。我们此前已报道了一种分离新生小鼠脊髓的方法2。本文介绍一种制备吸吮电极的方法，该电极可用于记录离体脊髓中的拟态运动3。
可通过低温酒精灯手工将塑料管电极的尖端拉制成极细的尖端3-5。将塑料管（PE90，Clay Adams IntramedicTM）置于火焰上方加热，使其软化至可塑状态。当管材开始熔化并变得半透明时，即从热源移开，并轻轻将两端拉伸。从火焰中移出管材的时机至关重要，以确保塑料在拉伸过程中不会塌陷或开裂。根据标本的年龄或脊髓节段水平所要求的内径，用剃刀片切割出所需长度的细管部分。为便于在管上安装O形圈，可用剃刀片在管的粗端切出一个45°的斜面。在粗端安装卡套和O形圈，以便将电极尖端连接至电极筒体上。
为了获得特定尺寸的电极并避免手工拉制电极尖端的困难，可使用小口径导管插入较粗导管（PE90）中来制备电极。导管的长度根据记录装置的具体需求而定，可作调整。我们在此列出本实验中所采用的尺寸1-3,5。使用剃刀切割一段1 cm长的PTFE细导管（Zeus, Small Parts）和一段10 cm长的PE90导管。应检查细导管两端，确保其未被压扁或封闭；如有必要，可用昆虫针（Fine Science Tools）将其开口。在PTF....
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讨论
可以利用分离的啮齿类动物脊髓来研究神经系统发育。在神经递质存在的情况下，脊髓能够产生模式化的电活动，从而形成虚拟步态运动1,3。这些节律性放电的频率为0.2至0.5 Hz，并表现出左右侧以及屈肌-伸肌之间的交替模式。在不同的发育阶段，这种活动的稳定性及其模式会有所变化1。基因突变也可能破坏该活动的模式化特征3,5,7。对该活动进行转基因和发育学研究，有助于深入了解中枢模式发生回路的组织结构，并为神经发育研究提供重要信息。
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致谢
Samuel L. Pfaff 是索尔克生物研究所基因表达实验室的教授，同时也是霍华德·休斯医学研究所的研究员。本工作由克里斯托弗和丹娜·里夫基金会资助。索尔克研究所多媒体资源部门的 Joe Belcovson、Kent Schnoeker 和 Mike Sullivan 在摄影与编辑方面提供了协助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| PTFE 超细壁管（细管） | Zeus | 36AWG | 内径 0.005” × 壁厚 0.003”（小零件），也可提供 0.003” 至 0.006” 规格 |
| 粗管（0.86 mm（0.34”）） | BD Biosciences | 427420 | 外径 0.86 mm（0.34”），内径 1.27 mm（0.050”） |
| 电极管体 | A-M Systems | 573000 | |
| 粘合剂 | JB Weld | ||
| 粘合剂：硅酮密封胶 | |||
| 焊锡及电烙铁 | |||
| 漂白剂 | |||
| 二甲苯 | |||
| 银丝：0.010” | A-M Systems | ||
| 昆虫针：Austerlitz 0.1 mm | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| 磁力支架 | Narishige International | GJ-8 | |
| 显微操作器 | Narishige International | MN 151 | |
| 小型前置放大板（头戴式放大器） | Grass Technologies | F-15EB/B1 | |
| Polyview 适配器单元 | Grass Technologies | PVA 8 | |
| 双极式便携生理信号放大系统 | Grass Technologies | 15LT | |
| 模拟-数字转换卡 | National Instruments | 6035E | |
| 防震台；Vibraplane | Kinetic Systems |
参考文献
- Gallarda, B. W., Sharpee, T. O., Pfaff, S. L., Alaynick, W. A. Defining rhythmic locomotor burst patterns using a continuous wavelet transform. Ann N Y Acad Sci. 1198, 133-139 (2010).
- Meyer, A., Gallarda, B. W., Pfaff, S., Alaynick, W. Spinal cord electrophysiology. J Vis Exp. , (2010).
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