冠状动脉结扎与心肌内注射在小鼠心肌梗死模型中的应用

摘要

在小鼠急性缺血/再灌注损伤和慢性重塑的研究中，涉及多种基因操作和/或心肌内注射基因、蛋白质、细胞和/或生物材料，这些操作随时间维度叠加进行。本视频展示了缺血/再灌注、永久性冠状动脉结扎以及心肌内注射研究的显微外科操作步骤。

摘要

小鼠模型是研究心肌急性损伤和慢性重塑的宝贵工具。in vivo 条件下，随着对整体生物体或心肌进行的遗传修饰，以及多种生物和/或合成材料的出现，这些技术的任意组合有望减轻急性缺血性损伤的程度，并延缓因心肌重塑引发的心力衰竭进程。

本文介绍了可靠实施该显微手术所使用的方法与材料，以及用于暂时性（伴再灌注）或永久性冠状动脉闭塞研究和心肌内注射的相应改进。术中及实验结束时可观察到的心脏变化，结合组织学评估，将验证该方法的有效性。

简而言之，手术准备包括对小鼠进行麻醉，去除胸部毛发，然后对手术区域进行消毒。通过光纤光源经食管透照实现气管内插管。随后将导管连接至呼吸机。在胸部做一切口以暴露胸肌，并切开胸肌以观察肋骨。在缺血/再灌注研究中，将一段1 cm长的PE导管置于心脏上方，用于固定结扎线，从而可自定义阻塞与再灌注过程。对于心肌内注射，使用带有无菌30号斜面针头的汉密尔顿注射器。完成心肌操作后，依次关闭肋骨、胸肌和皮肤。在缝合皮肤前，向肌肉层施用0.25%布比卡因无菌生理盐水溶液，以实现局部阻滞镇痛。术后给予小鼠皮下生理盐水注射，并将其置于保温舱内，直至恢复胸卧位。随后将小鼠送回动物房，在标准条件下饲养，直至组织取材时间点。在处死时，对小鼠进行麻醉，用KCl或BDM使心脏停搏于舒张期，以生理盐水冲洗后浸入固定液中。之后按常规步骤进行组织处理、包埋、切片及组织学染色。

小鼠的非手术插管及所述显微外科操作使得该模型在学习和实现可重复性方面具有较高的技术难度。这些操作，加上在进行定时结扎阻断和再灌注或心肌内注射时难以保持操作的一致性，均可能影响动物存活率，因此优化操作流程并保持一致性至关重要。

方案

1. 将无菌外科器械（表1）和3英寸棉签置于无菌垫巾上。打开 bead 消毒器（Germinator 500）。
2. 对小鼠（年龄：>6周；体重：>18g）进行腹腔注射三溴乙醇（250mg/kg，剂量为20μl/g体重，作用时间约40分钟）以实施麻醉。
3. 当小鼠对脚趾夹捏无反应时，向其眼部涂抹无菌润滑剂（Tears Renewed）以防止角膜干燥，并在胸部左侧皮肤涂抹脱毛剂（如Nair）以去除毛发。
4. 用温水冲洗掉脱毛剂，并使用碘伏/酒精棉片对术区进行消毒。
5. 将小鼠置于固定在亚克力手术台上的温控恒温垫（Deltaphase isothermal pad）上。用胶带固定四肢，并将一根粗线水平置于上门齿下方，以固定上颌位置。
6. 将手术台垂直放置，并使用光纤光源直接照射颈部区域以实现经食管透照。需精确调整光源位置，使咽喉开口呈现为明亮的孔道，从而便于观察气管，以利于插入PE导管。
7. 将导管连接至呼吸机（通入95% O₂/5% CO₂），以提供持续正压通气（TOPO呼吸机；呼吸频率125次/分钟；峰值吸气压10–12 cmH₂O；*注：参数设置因品系和性别而异1–3）。确认胸部同步起伏表明通气成功后，用胶带将连接处固定于垫巾上，以防术中导管脱落。
8. 使用有齿镊提起胸部皮肤，用安装在#3刀柄上的#10无菌手术刀片沿胸骨平行方向做1.5cm切口。
9. 使用弯头Vanna显微剪剪开胸大肌，并在肋间肌上剪出一个小孔。
10. 使用直头钝头显微剪剪断3根肋骨。
11. 使用9mm小儿眼科开睑器撑开肋骨。
12. 用弯头镊将心包从心脏表面轻轻提起，再用有齿镊小心撕开心包膜。
13. 使用Castroviejo持针器，将6mm锥形尖端3/8弧度针穿入8-0聚乙烯缝线，于左前降支冠状动脉下方（沿心脏长轴方向）与其垂直穿线。
    1. 若需建立可解除的临时结扎以实现定时再灌注，可在心脏上平行于冠状动脉放置一段无菌PE90管（长0.5–1cm）。先将缝线从冠状动脉下方穿过并打结固定于导管上。需要解除结扎时，松开结扎线即可。此操作可根据需要重复进行，并可调整缺血/再闭塞的时间⁴。根据实验持续时间和所用麻醉剂类型，可能需要追加麻醉。
    2. 若需永久性闭塞，则直接将穿过冠状动脉下方的缝线打结固定。此时可见心肌变白及运动异常，随后剪除缝线的长端^5–10。
    3. 若需进行心肌内注射，使用带有30号无菌斜面针头的无菌Hamilton注射器，从结扎线右侧损伤区域上方的心脏基底部进针。将针头推进至损伤区域后稍回撤，使针尖斜面位于梗死边缘带附近。先注入部分注射液（2–3μl），保持针头不动；再将针头后退1–3mm，注入剩余液体。保持针头位置直至注射形成的隆起消散，然后拔出针头。若出现出血，用棉签轻轻按压穿刺点直至止血^5–7。
14. 完成心肌操作后，取出肋骨牵开器，使用6-0 Surgipro缝线以2–3针褥式缝合法关闭胸腔。
15. 再以2–3针褥式缝合关闭胸大肌，在肌肉上滴加0.25%布比卡因与无菌生理盐水1:10稀释液1–3滴（0.1ml/25g小鼠），然后以2–3针褥式缝合关闭皮肤。
16. 将小鼠脱离呼吸机。确认出现节律性、快速而浅表的呼吸后，可拔除气管插管。
17. 向背部皮下注射0.5ml温热无菌生理盐水，并将小鼠置于笼内加热垫上，直至其恢复活动能力（至少1小时）。
18. 对于存活实验，将小鼠放回笼中并送回动物房直至预定处死时间。术后前两天，将湿润食物置于笼底以便取食（避免抬身取食引起疼痛），并每6–12小时给予一次布托啡诺。术后护理还包括术后第一周每日监测，以确认其活动能力、理毛行为和进食情况正常。
19. 手术器械用乙醇擦拭干净后，插入 bead 消毒器中，为下一次手术做准备。
20. 处死时，使用戊巴比妥钠（65mg/ml，55–65 mg/kg）对小鼠实施麻醉。待达到适当麻醉深度后，打开胸腔。
21. 在心脏仍在跳动时，使用装有23号针头的注射器，内含冷钾氯化物溶液（KCl，30mM）或2,3-丁二酮单肟（BDM；10mM），穿刺心室后基底部，缓慢将溶液注入心腔，直至心脏停搏于舒张期。
22. 取出心脏后，使用含PBS的注射器逆行灌注冲洗心脏，以清除残留血液。对于急性实验，在再灌注结束时，于原闭塞部位重新结扎LAD，并经主动脉注射含1%伊文思蓝的溶液。取出心脏后，将其横向切成三个等厚切片，浸入1% 2,3,5-三苯基四氮唑氯化物（TTC）中孵育，随后进行形态计量学成像分析¹¹。对于慢性实验，心脏则浸入固定液中，按常规流程处理、包埋。切片可进行组织学染色，并使用Scion、NIH Image J或Image Pro Plus软件进行形态计量学成像分析^9,10,12。

代表性结果：

若操作得当，小鼠（雄性：8–10周龄，22–28 g；雌性：10–12周龄，20–26 g）的存活率如下：急性缺血/再灌注和缺血预处理实验中超过90%，永久性动脉结扎研究中超过85%，心肌内注射实验中约为80%。由于早期损伤更多表现为代谢改变而非结构变化，因此在缺血/再灌注和缺血预处理实验中，通过向主动脉灌注1%伊文思蓝染料来确定梗死面积，该染料可灌注非左前降支（LAD）供血的心肌区域（图1A）。心脏取出并沿横向平分后，将组织置于1% 2,3,5-三苯基四氮唑氯化物溶液中孵育，以测定梗死面积（图1B）。使用Scion或NIH图像分析软件测量各区域面积，可通过在相同放大倍数下拍摄的显微测微尺图像进行校准。这些数据用于计算风险区/左心室面积以及梗死面积/风险区面积比值¹¹。不同品系小鼠可能存在体重和心脏大小的差异，因此在比较时应注意将这些指标归一化至心脏重量、体重或胫骨长度。

永久性动脉结扎会导致明显的结构改变，例如坏死、管壁变薄和心腔扩张。在永久性闭塞模型中（图2A），可通过Scion或NIH成像软件测量不同处理方法和/或时间对梗死面积及坏死程度的影响，具体参数包括相对于左心室的梗死范围、心腔面积、室间隔壁以及左心室游离壁厚度。采用苦味品红-亮绿（picrosirius red/fast green）胶原染色（图2B）可评估间质性纤维化，该指标与心壁僵硬度的功能指数密切相关^8-10。图3显示了在永久性动脉结扎后，将6 µl溶液（伊文思蓝）注射至心脏边缘区后的分布情况。可见染料沿损伤方向扩散，同时向心肌基底部以及跨壁方向延伸。

图1. A. 切除前向主动脉注射伊文思蓝。 该图像显示心脏灌注区域（被染色）和梗阻区域（未染色）。B. 急性缺血/再灌注损伤后伊文思蓝和TTC染色结果。这是一张代表性图像（20倍放大），显示蓝色染料分布情况，未梗阻区域被染成蓝色，代谢活性组织经TTC染色呈红色。坏死区域不着色，因此呈现苍白（已标出）。

图 2. A. 苏木精-伊红染色。 这是一张代表性图像（20×），显示小鼠心肌梗死（MI）后第4天梗死区域横切面的H&E染色结果（20×）。* 表示组织坏死，箭头指向肉芽组织，RV = 右心室，LV = 左心室。B. 天狼星红-快绿染色。 这是一张代表性图像（20×），显示小鼠心肌梗死（MI）后第4周心脏横切面的天狼星红/快绿染色结果。细胞质呈绿色，胶原纤维呈红色。

图 3. 经心肌内注射 6 µL 伊文思蓝染料后的染色分布情况。该图为冠状动脉结扎后立即在梗死边缘区进行 6 µL 心肌内注射伊文思蓝染料后，染料在整个心脏中全局性及透壁性分布的代表性图像（12×）。

讨论

冠心病仍然是一个在流行病学和财政上具有重要意义的公共卫生问题。要将潜在治疗方法推进到临床应用，仍需进行大量的基础研究，以理解损伤和重塑过程的机制，以及这些治疗方法如何调节上述过程。啮齿类动物是最常用的模型，而目前可获得的大量基因修饰小鼠使该物种成为更具吸引力的模型。

尽管小鼠与其他物种之间存在差异，但使用小鼠模型仍具有诸多优势。借助简单的解剖显微镜或放大镜，并在光线充足的条件下，可清晰观察到血管结构（有关血管的大体解剖学详细信息，请参见 Salto-Tellez et al., 2004¹³）。为降低术后死亡风险，避免切断大血管至关重要，因为一只25g小鼠的总血容量不足2ml¹⁴。若发生大量出血，可通过轻柔加压或精准电灼止血。

该方案也可通过多种方式进行修改。例如，可使用异氟烷、氯胺酮/赛拉嗪或戊巴比妥钠对小鼠进行麻醉，具体选择应根据实验方案的持续时间而定^15-18趾夹反射是评估麻醉深度最常用的指标。此外，为了提高长期存活率，一些研究者使用抗心律失常药物（如利多卡因）来降低致死性心律失常的发生率。^19,20 然而，必须考虑到，最近已有研究表明，在急性模型中，此物质具有抗凋亡特性²¹此外，为减轻术后疼痛，可在手术后前48小时内给予布托啡诺等镇痛药。^{3,16,17,22,23}为维持手术期间（尤其是较长时间的实验方案）的体温，通常使用直肠探头与加热垫串联，以替代等温垫。对于缺血/再灌注及/或缺血预处理或后处理：可调整阻断和再灌注的持续时间；对于永久性阻断，可通过改变结扎位置来调节梗死面积；对于心肌内注射（如细胞、蛋白），可进行1–3个注射位点，每次注射体积最多可达15 μl。²⁴如果进行细胞注射，应使用针头的规格（通常为26-30号）^5,25,26 应根据细胞大小进行选择，以确保针头内径足够大，避免剪切效应。为避免手术引发的炎症反应造成干扰，一些研究者已报道使用可操控的套索 离体 在术后任意时间点对闭胸小鼠心脏进行阻断和再灌注^27-29。最近，Gao 等³⁰ 已表明，临时性和永久性阻断可在无需通气的情况下进行，一些实验室已开始使用超声进行闭胸心肌内注射^25,31.

自1954年Johns和Olson首次发表证明在小鼠中结扎冠状动脉可行性的研究以来³²许多其他研究者已采用此模型，并对其加以改进，以研究心肌损伤和重塑的各个方面^3,33-45小鼠因其体型小、繁殖能力强以及购买和维护成本相对较低，在多种生理学和病理生理学研究中成为一种极具吸引力的实验工具。随着成像技术的微型化发展 体内 进展^46-49，以及用于开展和分析大规模基因组学和蛋白质组学、药物筛选、基于细胞和/或蛋白质疗法的疗效，以及生物材料的方法^50-64结合普遍性或组织特异性转基因小鼠及基因突变/基因敲除小鼠日益广泛的遗传操作手段，心肌梗死的小鼠模型无疑将继续成为评估急性心脏损伤及长期心室重构的重要工具。因此，能够可靠且可重复地开展这些实验具有无可置疑的价值。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
长弯剪	George Tiemann & Co.	160-159
显微解剖剪	George Tiemann & Co.	160-161
镊子 – 直型，1×2 齿	George Tiemann & Co.	105-205
3 号手术刀柄	George Tiemann & Co.	105-64	#10 无菌刀片
镊子 – 半弧形带齿	George Tiemann & Co.	160-19
组织剪	George Tiemann & Co.	105-410
Castroviejo 持针钳	Miltex Inc.	18-1828
Cook 眼睑撑开器	Miltex Inc.	18-63
Surgipro II 8-0	Suture Express	VP-900-X
Prolene 6-0	Suture Express	8776
Germinator 500 珠式灭菌器	Cellpoint Scientific	65369-1
Deltaphase 恒温垫	Braintree Scientific, Inc.	39DP
Hamilton 微量注射器 - 25μl	Hamilton Co	80430
30 号斜面针头	Hamilton Co	7803-07
呼吸机	Kent Scientific	TOPO