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共振与自发拉曼显微光谱中荧光背景的抑制

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DOI：

10.3791/2592

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2011年5月18日

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1Center for Biophotonics Science and Technology, University of California, Davis, 2Department of Pathology and Laboratory Medicine, University of California, Davis

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

我们讨论一种复杂的非线性光学系统的构建与运行，该系统利用超快全光开关来分离拉曼信号与荧光信号。通过该系统，我们能够利用保持在生物安全范围内的脉冲能量和平均功率，成功分离拉曼信号和荧光信号。

摘要

拉曼光谱常常受到强烈荧光背景的干扰，尤其是对于生物样品而言。如果使用一串超快脉冲激发样品，通过能够在皮秒时间尺度上对光谱重叠信号进行时间分辨的系统，即可将及时到达的拉曼散射光与延迟到达的荧光光分离。本文讨论了一种复杂的非线性光学系统的构建与操作，该系统采用低功率光学克尔门形式的全光开关，以分离拉曼信号与荧光信号。系统使用单一的808 nm激光器，平均功率为2.4 W，重复频率为80 MHz；该激光束被分束后，约200 mW的808 nm光被转换为< 5 mW的404 nm光并照射到样品上，用于激发拉曼散射。剩余未转换的808 nm光则被导入非线性介质，作为全光快门的泵浦光。该快门的开关时间为800 fs，峰值效率约为5%。利用此系统，我们能够在80 MHz的重复频率下，使用保持在生物安全范围内的脉冲能量和平均功率，成功分离拉曼信号与荧光信号。由于系统在光学功率方面无冗余余量，我们详细说明了若干有助于最大化系统通量的设计与准直考虑因素。我们还介绍了在克尔介质内实现信号光与泵浦光空间和时间重叠的操作流程，以及光谱采集的详细步骤。最后，我们报告了使用该时间门控系统在强荧光背景下成功获取的若干代表性拉曼光谱结果。

方案

1. 在制备和放置拉曼样品时，必须对此系统格外小心。

  1. 由于该系统通常使用数值孔径极高且工作距离极短的物镜，因此样品需置于盖玻片上。生物样品通常放置在艾托氟（Attofluor）细胞培养皿（Invitrogen，Carlsbad，CA）中编号为1的盖玻片上。
  2. 液体样品，特别是对人类有毒的样品，应置于小型玻璃瓶中，并用硅酮环氧树脂将盖玻片密封在瓶口。测量时将瓶子倒置。
  3. 由于我们的系统依赖于泵浦光脉冲和信号光脉冲的精确时序，因此不能使用显微镜传统的调焦方式，即上下移动物镜，因为这会改变系统的光程。取而代之的是，我们将样品置于安装在显微镜载物台顶部的二级载物台上，该二级载物台具有独立的调焦控制功能。

2. 为了获取时间门控拉曼光谱，必须对激发光束进行适当准备。

  1. 我们使用来自一台 2.4 W 可调谐脉冲钛宝石激光器（Chameleon，Coherent Systems，美国加利福尼亚州圣克拉拉）的光开始实验。在 80 MHz 的脉冲序列中，每个脉冲的能量为 30 nJ，脉宽为 140 fs，光谱中心波长为 808 nm，光谱带宽约为 6 nm。
  2. 为防止背向反射光重新进入激光谐振腔，光束需通过一个法拉第隔离器。在法拉第隔离器前放置一个半波片，可连续调节进入系统的总功率。
  3. 由于 6 nm 的带宽过宽，无法分辨大多数拉曼模式，因此将光束通过一个中心波长为 808 nm、带宽极窄（0.8 nm FWHM，Andover Corporation，美国新罕布什尔州塞勒姆）的带通滤光片。
  4. 随后，光束由一个消色差双胶合透镜（f = 100 mm）聚焦到一块 5 mm 长的 β-偏硼酸钡（BBO）晶体（CASIX，中国福建省福州市）上，使波长从 808 nm 减半至 404 nm。BBO 晶体安装在具有俯仰和倾斜调节功能的支架上，并固定于平移台上。为最大化波长转换效率，晶体必须精确对称地位于双胶合透镜的焦点处，且其晶体轴需与入射光束的偏振方向对齐。
  5. 由于波长转换效率依赖于偏振态，可在法拉第隔离器后放置第二个半波片，以控制照射到样品上的光强。通过旋转该波片，可独立调节照射到样品上的光强，而不影响泵浦光束的强度（下文将讨论）。
  6. 波长转换后的光束由第二个消色差双胶合透镜（f = 500 mm）重新准直，选择该透镜以确保出射光束足够大，能够充满显微镜物镜的后光阑，并通过两个转向镜导入倒置显微镜（IX-71，Olympus，美国宾夕法尼亚州中心谷）。
  7. 显微镜物镜作为系统中最整体化光学组件内的光学元件，定义了光轴。为将激发光束对准该光轴，需在显微镜的样品平面放置一面反射镜。通过观察连接在显微镜成像端口的 CCD 相机（μEye，IDS，德国奥伯苏尔姆）上反射回来的激光光斑，迭代调节两个转向镜。假设相机上的图像位于显微镜视场中心，则当焦点位于显微镜芯片中心，且沿 z 轴移动物镜时离焦光束的中心位置不变时，光束即处于光轴上。
  8. 当样品置于样品平面并被激光照射时，会发生拉曼散射。在显微镜物镜下方放置一个二向色镜，将发生波长偏移的拉曼散射光（以及荧光）与激发光束分离，并将拉曼散射光导向显微镜的侧端口。显微镜经过改装，移除了该光路中的所有透镜，使信号光以准直状态从显微镜出射。
  9. 由于从显微镜出射的信号光束直径大于格兰-汤普森偏振器的通光孔径，因此使用由两个消色差双胶合透镜（f1 = 75 mm，f2 = 35 mm）构成的 0.47 倍望远镜系统缩小光束。
  10. 信号光随后由一个在实验室坐标系中相对于垂直方向取向为 0° 的格兰-汤普森偏振器进行偏振，并被导向一个二向色镜，在此处与泵浦光束重新合并。

为了使光学门以最高效率运行，还必须仔细制备泵浦光束（克尔光束）。

  1. 泵浦脉冲首先通过一个由两个消色差双合透镜（f1 = 35 mm，f2 = 100 mm）构成的望远镜系统放大0.35倍，以匹配信号光束的最终尺寸。
  2. 随后，泵浦光束进入一个延迟线，该延迟线由一个安装在直线平移台上的直角棱镜组成，可通过调节平移台确保泵浦脉冲与信号脉冲在时间上重叠（具体调节方法将在下文讨论）。
  3. 经过延迟线后，光束穿过一个半波片和一个在实验室坐标系中相对于垂直方向呈45°取向的偏振片。这可确保泵浦光束到达非线性介质时具有正确的偏振态。
  4. 随后，光束经由两个转向镜反射，其中一个带有压电控制装置，用于精细调节泵浦光束的位置，使其在空间上与信号光束完全重叠。通过在两个位置观察泵浦光束和信号光束的重合情况——一个靠近、一个远离用于合束的二向色镜——可实现精确对准：利用第一个转向镜使两束光在近点重合，再通过压电控制的转向镜使它们在远点重合，从而确保泵浦光束与信号光束完全共线。
  5. 当两束光实现合束后，设置克尔门控及收集系统，以最大化收集到的时间门控信号。

4. 当两束光合并后，设置克尔门控和收集系统，以最大化收集到的时间门控信号。

  1. 首先，泵浦光束和信号光束需通过一个在 404 nm 处具有 6 个光密度（OD）的二向色滤光片，以防止任何残余的激发光在非线性介质中引发拉曼散射。
  2. 随后，泵浦光束和信号光束均由一个消色差双胶合透镜（焦距 f = 35 mm）聚焦，进入一个光程为 1 cm 的石英比色皿，其中装有非线性材料。任何具有足够高非线性折射率（高于 CS2）且具有足够短时间响应（<2 ps）的非线性材料均可在此使用。在本实验中，我们采用二硫化碳（CS2），其非线性折射率 n2 = 3.1 × 10−18 m2/W。随后，光束由第二个与第一个焦距相同的双胶合透镜重新准直。
  3. 接着，光束通过安装在旋转支架上的格兰-汤普森偏振分析器，再通过一组吸收滤光片和干涉滤光片，这些滤光片在 808 nm 处的总光密度（OD）为 10。
  4. 最后，信号光由一个消色差双胶合透镜（焦距 f = 35 mm）聚焦进入一根 50 μm 的多模光纤，该光纤安装在一个可在 x、y 和 z 方向上平移的载物台上。光纤随后连接至商用成像光谱仪及其配套的 CCD 相机（分别为 SP2300i 和 Pixis 100B，均由美国新泽西州普林斯顿仪器公司制造）。
  5. 为对准收集系统以最大化采集到的信号，将分析器设置为 0°，并在样品平面放置甲苯测试样品。通过调节光纤支架的 x、y 和 z 控制旋钮，优化采集到的拉曼信号。
  6. 为确保泵浦光束与信号光束在空间和时间上的正确重叠，需在显微镜的样品平面放置一面反射镜，并从系统中移除 404 nm 滤光片。将分析器旋转至 90°，使后向反射的 404 nm 光束进入光谱仪，并调节其强度，使其不致使相机饱和。在关闭泵浦光束的情况下，旋转分析器以最小化透射的 404 nm 信号。随后重新打开泵浦光束，缓慢调节延迟线，直至 404 nm 光的透射开始增强。然后通过反复调节延迟线、压电控制反射镜以及光纤支架的 x、y 和 z 控制，使信号达到最大。
  7. 由于后向反射的 404 nm 光束与拉曼散射光在系统中可能经历略微不同的光路，因此需将一种强拉曼散射样品（如甲苯）置于样品台上，通过微调延迟线、压电反射镜以及光纤的 x、y 和 z 控制，进一步优化拉曼信号，完成最终的对准调整。

5. 采集单个时间门控拉曼光谱需要获取多个光谱，以校正系统伪影。

  1. 将检偏器设置为 0°，激发光束打开，泵浦光束关闭，采集“未时间门控”光谱，该光谱表示在不使用时间门控系统的情况下所获得的光谱。
  2. 将检偏器设置为 90°，激发光束和泵浦光束均关闭，采集背景光谱，该光谱表示系统中杂散光通过偏振片及其他光学元件的泄漏量。
  3. 保持检偏器在 90°，所有光束均打开，采集“时间门控”光谱，该光谱表示由于泵浦光束的存在，拉曼散射光通过交叉偏振片后被允许通过的信号。
  4. 最后，保持检偏器在 90°，关闭激发光束，打开泵浦光束，采集第二个背景光谱，该光谱表示进入光谱仪的残余 808 nm 光对“时间门控”光谱的贡献。
  5. 此外，关闭所有激光器，采集一个光谱，用于表征相机和电子设备的基线“暗”信号水平。
  6. 由于光谱通常需要较长的积分时间，必须将总积分时间划分为多个片段（帧），以便对宇宙射线进行有效校正——这是在数分钟时间尺度上采集数据时常见的问题。

6. 数据采集后，进行若干处理步骤有助于提升数据的质量和呈现效果。

  1. 首先，通过减去“暗”光谱对所有光谱进行暗电流校正。
  2. 为了校正宇宙射线干扰，将构成一次采集的多个帧在像素基础上逐一对比。对于任意帧中某个像素，若其值偏离所有帧中该像素中位数值超过2个中位数偏差，则用所有帧中该像素的中位数值替换该像素的值。
  3. 经宇宙射线校正后的帧随后通过Savitzky-Golay滤波器1进行平均和平滑处理。
  4. 为了提取“真实”的门控光谱，我们从测得的门控光谱中减去“仅激发”和“仅泵浦”光谱。
  5. 最后，门控和非门控光谱通过减去一个5th阶多项式进行背景校正，该多项式采用Lieber和Mahadevan-Jansen2提出的方法确定。

7. 代表性结果：

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图1. 克尔门控系统的示意图。泵浦光束路径以红色表示，二次谐波产生（SHG）路径以蓝色表示。拉曼和荧光重叠的路径以绿色表示，而荧光被时间滤除后的路径以黄色表示。缩写如下：BPF，带通滤波器；CCD，电荷耦合器件；DCM，二向色镜；FI，法拉第隔离器；λ/2，半波片；LPF，长波通滤波器；NLM，非线性介质；P，偏振器；SHG，二次谐波产生晶体。

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图 2. 上图：香豆素溶解在浸油中的原始光谱。红色曲线表示门控打开时测得的光谱（检偏器设置为最大透过率）。黑色曲线表示检偏器对准至最小透过率并施加泵浦光束时测得的光谱（门控光谱）。蓝色曲线表示检偏器对准至最小透过率但未施加泵浦光束时测得的光谱（门控关闭）。绿色曲线表示仅施加泵浦光束时测得的光谱。虚线洋红色线表示下图所示的光谱区域。所有光谱均使用11点、3阶Savitzky-Golay滤波器进行了平滑处理。下图：扣除荧光背景后香豆素溶解在浸油中的光谱。红色曲线为门控打开时的光谱，蓝色曲线为门控光谱。门控光谱清晰地显示出油类物质特有的重叠的高波数峰。

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讨论

近年来，生物医学拉曼光谱学领域因其在解决生物诊断中若干难题方面所展现出的潜力而受到越来越多的关注。例如，拉曼光谱已被证明在癌症检测中具有诊断价值3, 4, 5, 6。拉曼光谱技术还被用于细菌定量7, 8和细菌药物反应分析9。此外，该技术已广泛应用于其他多种生物医学领域，从骨骼健康10到生物流体分析11, 12均有涉及。

然而，尽管拉曼光谱具有如此巨大的潜力，但在大多数生物系统中仍存在一个巨大的应用障碍：其极弱的散射截面。因此，拉曼信号极易被即使较弱的荧光背景所掩盖。目前已有多种技术用于去除荧光谱形2, 13, 14。然而，这些技术均未能真正解决强荧光背景下的核心问题：荧光背景引入的散粒噪声会完全淹没拉曼信号，且无法通过减法消除。为增强拉曼信号强度，已发展出若干技术，例如相干反斯托克斯拉曼散射（CARS）和受激拉曼散射（或称逆拉曼散射）15, 16, 17。然而，这些技术主要适用于透明样品，且在化学灵敏度方面存在各自的背景干扰和其他...

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致谢

本工作由美国国家科学基金会（NSF）资助项目 DBI 0852891 支持。部分工作还由生物光子学科学与技术中心资助，该中心是美国国家科学基金会指定的科学与技术中心，由加州大学戴维斯分校根据合作协议编号 PHY0120999 进行管理。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
透镜Thorlabs Inc.Various所有透镜均镀膜，以确保每个透镜的最大透射损耗为1%
可调谐钛宝石激光器Coherent Inc.Chameleon30 nJ, 200 fs, 80 MHz
40倍油浸物镜Olympus CorporationUApo/340NA = 1.35
倒置显微镜Olympus CorporationIX-71经改装以移除侧端口中的所有透镜
半波片Thorlabs Inc.AHWP05M-600
格兰-汤普森偏振器Thorlabs Inc.GTH10M∼10% 透射损耗
光谱仪Princeton Instruments/ActonSP2300i
CCDPrinceton Instruments/ActonPixis 100B
数学软件MathworksMATLAB版本 2008a
法拉第隔离器EOTBB8-5I
压电驱动反射镜Newport Corp.AG-M100
BBO 晶体CASIXcustom厚度 1 mm
带通滤光片 1Andover008FC14808 ± 0.4 nm
二向色镜SemrockFF662-FDI01截止波长 662 nm
长通滤光片SemrockBLP01-405R截止波长 417 nm
带通滤光片 2SemrockFF02-447/60417–447 nm
CS2Sigma-Aldrich335266纯度 99%
香豆素 30Sigma-Aldrich546127纯度 99%
浸油Cargill Labs16242型号 DF

参考文献

  1. Savitzky, A., Golay, M. J. E. Smoothing and differentiation of data by simplified least squares procedures. Analytical Chemistry. 36, 1627-1639 (1964).
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  20. Matousek, P. Fluorescence suppression in resonance Raman spectroscopy using a high-performance picosecond Kerr gate. Journal of Raman Spectroscopy. 32, 983-988 (2001).
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