共振与自发拉曼显微光谱中荧光背景的抑制

摘要

我们讨论一种复杂的非线性光学系统的构建与运行，该系统利用超快全光开关来分离拉曼信号与荧光信号。通过该系统，我们能够利用保持在生物安全范围内的脉冲能量和平均功率，成功分离拉曼信号和荧光信号。

摘要

拉曼光谱常常受到强烈荧光背景的干扰，尤其是对于生物样品而言。如果使用一串超快脉冲激发样品，通过能够在皮秒时间尺度上对光谱重叠信号进行时间分辨的系统，即可将及时到达的拉曼散射光与延迟到达的荧光光分离。本文讨论了一种复杂的非线性光学系统的构建与操作，该系统采用低功率光学克尔门形式的全光开关，以分离拉曼信号与荧光信号。系统使用单一的808 nm激光器，平均功率为2.4 W，重复频率为80 MHz；该激光束被分束后，约200 mW的808 nm光被转换为< 5 mW的404 nm光并照射到样品上，用于激发拉曼散射。剩余未转换的808 nm光则被导入非线性介质，作为全光快门的泵浦光。该快门的开关时间为800 fs，峰值效率约为5%。利用此系统，我们能够在80 MHz的重复频率下，使用保持在生物安全范围内的脉冲能量和平均功率，成功分离拉曼信号与荧光信号。由于系统在光学功率方面无冗余余量，我们详细说明了若干有助于最大化系统通量的设计与准直考虑因素。我们还介绍了在克尔介质内实现信号光与泵浦光空间和时间重叠的操作流程，以及光谱采集的详细步骤。最后，我们报告了使用该时间门控系统在强荧光背景下成功获取的若干代表性拉曼光谱结果。

方案

1. 在制备和放置拉曼样品时，必须对此系统格外小心。

1. 由于该系统通常使用数值孔径极高且工作距离极短的物镜，因此样品需置于盖玻片上。生物样品通常放置在艾托氟（Attofluor）细胞培养皿（Invitrogen，Carlsbad，CA）中编号为1的盖玻片上。
2. 液体样品，特别是对人类有毒的样品，应置于小型玻璃瓶中，并用硅酮环氧树脂将盖玻片密封在瓶口。测量时将瓶子倒置。
3. 由于我们的系统依赖于泵浦光脉冲和信号光脉冲的精确时序，因此不能使用显微镜传统的调焦方式，即上下移动物镜，因为这会改变系统的光程。取而代之的是，我们将样品置于安装在显微镜载物台顶部的二级载物台上，该二级载物台具有独立的调焦控制功能。

2. 为了获取时间门控拉曼光谱，必须对激发光束进行适当准备。

1. 我们使用来自一台 2.4 W 可调谐脉冲钛宝石激光器（Chameleon，Coherent Systems，美国加利福尼亚州圣克拉拉）的光开始实验。在 80 MHz 的脉冲序列中，每个脉冲的能量为 30 nJ，脉宽为 140 fs，光谱中心波长为 808 nm，光谱带宽约为 6 nm。
2. 为防止背向反射光重新进入激光谐振腔，光束需通过一个法拉第隔离器。在法拉第隔离器前放置一个半波片，可连续调节进入系统的总功率。
3. 由于 6 nm 的带宽过宽，无....

讨论

近年来，生物医学拉曼光谱学领域因其在解决生物诊断中若干难题方面所展现出的潜力而受到越来越多的关注。例如，拉曼光谱已被证明在癌症检测中具有诊断价值^{3, 4, 5, 6}。拉曼光谱技术还被用于细菌定量^{7, 8}和细菌药物反应分析⁹。此外，该技术已广泛应用于其他多种生物医学领域，从骨骼健康¹⁰到生物流体分析^{11, 12}均有涉及。

然而，尽管拉曼光谱具有如此巨大的潜力，但在大多数生物系统中仍存在一个巨大的应用障碍：其极弱的散射截面。因此，拉曼信号极易被即使较弱的荧光背景所掩盖。目前已有多种技术用于去除荧光谱形^{2, 13, 14}。然而，这些技术均未能真正解决强荧光背景下的核心问题：荧光背景引入的散粒噪声会完全淹没拉曼信号，且无法通过减法消除。为增强拉曼信号强度，已发展出若干技术，例如相干反斯托克斯拉曼散射（CARS）和受激拉曼散射（或称逆拉曼散射）^{15, 16, 17}。然而，这些技术主要适用于透明样品，且在化学灵敏度方面存在各自的背景干扰和其他.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
透镜	Thorlabs Inc.	Various	所有透镜均镀膜，以确保每个透镜的最大透射损耗为1%
可调谐钛宝石激光器	Coherent Inc.	Chameleon	30 nJ, 200 fs, 80 MHz
40倍油浸物镜	Olympus Corporation	UApo/340	NA = 1.35
倒置显微镜	Olympus Corporation	IX-71	经改装以移除侧端口中的所有透镜
半波片	Thorlabs Inc.	AHWP05M-600
格兰-汤普森偏振器	Thorlabs Inc.	GTH10M	∼10% 透射损耗
光谱仪	Princeton Instruments/Acton	SP2300i
CCD	Princeton Instruments/Acton	Pixis 100B
数学软件	Mathworks	MATLAB	版本 2008a
法拉第隔离器	EOT	BB8-5I
压电驱动反射镜	Newport Corp.	AG-M100
BBO 晶体	CASIX	custom	厚度 1 mm
带通滤光片 1	Andover	008FC14	808 ± 0.4 nm
二向色镜	Semrock	FF662-FDI01	截止波长 662 nm
长通滤光片	Semrock	BLP01-405R	截止波长 417 nm
带通滤光片 2	Semrock	FF02-447/60	417–447 nm
CS2	Sigma-Aldrich	335266	纯度 99%
香豆素 30	Sigma-Aldrich	546127	纯度 99%
浸油	Cargill Labs	16242	型号 DF