核小体ELISA（NU-ELISA）是一种灵敏且定量的方法，用于检测天然完整核小体制备物中翻译后修饰的全局模式。这些修饰包括组蛋白特定氨基酸残基上的甲基化、乙酰化和磷酸化，因此NU-ELISA可提供一种全局蛋白质组学检测手段，用于分析特定细胞类型的总体染色质修饰状态。
本文内容
摘要
摘要
真核生物的基因组以染色质形式存在，其中包含DNA和蛋白质。染色质的基本单位是核小体，每个核小体包含一段146个碱基对的DNA，以及各两个拷贝的组蛋白H2A、H2B、H3和H41。组蛋白的N端尾部富含赖氨酸和精氨酸，可在转录后被乙酰化、甲基化及其他转录后修饰（PTMs）所修饰。核小体的PTM修饰模式可影响与其关联的DNA的转录活性，从而提供一种表观遗传性质的基因调控机制2,3。我们开发了一种称为核小体ELISA（NU-ELISA）的方法，用于定量测定从细胞中提取的核小体的全局PTM特征。与蛋白质印迹法相比，NU-ELISA具有更高的灵敏度和定量能力，适用于探究特定细胞类型的表观蛋白质组状态。本文视频期刊文章展示了执行NU-ELISA分析的详细步骤。
方案
1. 哺乳动物细胞培养
NU-ELISA 可在任何可在培养条件下生长的哺乳动物细胞类型上进行。我们倾向于制备中等到大批量的细胞，以便获得足量的核小体，用于制备多块加样量相同的ELISA板，从而可使用多种不同抗体（Abs）进行检测。以下培养规模可提供充足的材料：
对于小鼠胚胎干细胞，培养一至两块15 cm的细胞培养板，无需饲养层细胞。 对于成纤维细胞，培养5至10块15 cm的细胞培养板至细胞汇合。
2. 细胞核的分离
注意：除特别说明外，所有步骤均在冰上进行，并使用预冷的缓冲液。
- 每块培养板加入 3 ml 胰蛋白酶消化细胞，收集细胞并加入 20 ml 冰冷的 PBS/丁酸盐溶液。在 1000 rpm 条件下离心 5 分钟。
- 用 10 ml PBS/丁酸盐溶液重悬细胞，在 1000 rpm 条件下离心 5 分钟。
- 用 4 ml 含蛋白酶抑制剂（Sigma-Aldrich P-8340）的裂解缓冲液重悬细胞，在冰上使用 B 型杵头进行 20 次 Dounce 匀浆。
- 在 4°C 条件下以 2000g 离心 10 分钟。（上清液含有细胞质成分，本实验方案中不需要，但可根据需要保存用于其他用途）。
- 用 2 ml 冰冷的洗涤缓冲液 C（含蛋白酶抑制剂）重悬沉淀。
- 将重悬的样品铺在 5 ml 30% 蔗糖垫之上，使用摆桶转子在 2400g 条件下离心 5 分钟。细胞核将穿过蔗糖垫，而碎片则留在界面处。
- 小心移除所有液体体积，并将细胞核重悬于 250 μl 冰冷的洗涤缓冲液 C 加蛋白酶抑制剂中。
3. 通过分离核小体 原位 微球菌核酸酶（MNase）消化
我们采用一种染色质消化的实验方法 原位 通过用MNase灌注细胞核，随后进行低渗处理，使游离的完整核小体进入上清液。
- 向样品中加入 3 μl 0.1 M CaCl2，放入 37°C 金属浴中，使其温度升至 37°C。
- 加入 2 单位 MNase（微球菌核酸酶，Sigma-Aldrich，用 MNase 缓冲液溶解为 2 单位/10 μl），在 37°C 下孵育 12 分钟，期间频繁使用移液枪头混匀。
- 加入 6 μl 0.5 M Na-EDTA（pH 8.0）以终止反应，置于冰上。
- 在 2000g 离心 4 分钟，弃上清。将沉淀重悬于 300 μl 0.2 mM Na-EDTA 中，冰上放置 1 小时，期间偶尔轻柔吹打。 （这种低渗条件可使核小体从细胞核中释放出来）。
- 在 4°C 下以 3000 g 离心 4 分钟。将含有游离核小体的上清液保留并置于冰上。
- 再次用 300 μl 0.2 mM Na-EDTA 重悬沉淀，冰上放置 1 小时，期间偶尔轻柔吹打。
- 在 4°C 下以 3000g 离心 4 分钟。保留上清液，并与第 5 步所得的第一次上清液合并。所得的单核小体制备物可分装后于 -80°C 保存。
注意：可通过测量10 μl样品加入990 μl水后的260 nm处吸光度来粗略定量染色质含量。A260=10（已校正1/100稀释倍数）约对应1 mg/ml的染色质。此外，在上述操作过程中，可保留少量样品，后续分析其DNA含量，以监测MNase消化的质量和程度，理想情况下主要含有长度为146 bp的DNA片段。出现梯状条带表明MNase消化不完全。
注意：图1展示了细胞核分离和MNase消化步骤的示意图摘要。
4. 核小体-ELISA（NU-ELISA）
我们检测固定在96孔ELISA微孔板上的天然完整核小体组分中的翻译后修饰。对于每个样本，我们进行一系列2倍稀释，并将这些稀释液以每组三个复孔的方式包被到微孔中。
- 将核小体用包被缓冲液稀释后，每孔50 μl，于4°C过夜包被MaxiSorp板。建议的核小体系列两倍稀释液从最上排至最下排依次为：0.1 μg、0.05 μg、0.025 μg、0.0125 μg、0.00625 μg、0.00313 μg、0.00156 μg，最下排仅加包被缓冲液（0 μg染色质）。（注意：此步骤需要使用酶标板盖。）
- 次日早晨，使用洗板机在室温下用PBS/0.5% Tween-20溶液每孔200 μl洗涤酶标板4次，总洗涤时间为10分钟。
- 每孔加入100 μl PBS/0.05% Tween-20/5% BSA，在室温下封闭1小时。
- 将酶标板倒置并用力在水槽上方震荡，以去除封闭液。盖好后可于-20°C保存，或直接进入下一步。
- 将一抗用PBS/0.05% Tween-20/5% BSA稀释1:1000（或按需稀释），每孔加入50 μl，置于旋转仪上室温孵育1小时。
- 使用洗板机在室温下用PBS/0.5% Tween-20溶液每孔200 μl洗涤酶标板4次，总洗涤时间为10分钟。
- 加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗，用PBS/0.05% Tween-20/5% BSA稀释1:5000（或按需稀释），每孔加入适量体积，室温下置于旋转仪上孵育1小时。
- 使用洗板机在室温下用PBS/0.5% Tween-20溶液每孔200 μl洗涤酶标板4次，每次洗涤总时间为10分钟。
- 每孔加入50 μl TMB底物溶液，室温避光显色10分钟。每孔加入50 μl 2N H2SO4终止反应，并在450 nm波长下读取吸光度。（提示：读板前可使用酶标板转子以1500 rpm离心2分钟，以消除孔内气泡。）
- 将读数导出至电子表格文件，用于定量和统计分析。
试剂
| PBS/丁酸盐 |
| 135 mM NaCl |
| 2.5 mM KCl |
| 8 mM Na2HPO4 |
| 1.5 mM KH2PO4 |
| 10 mM Na-丁酸盐 |
| 裂解缓冲液 |
| 250 mM 蔗糖 |
| 10 mM Tris-HCl, pH 7.4 |
| 10 mM 丁酸钠 |
| 4 mM MgCl2 |
| 0.1% Triton X-100 |
| 洗涤缓冲液 C |
| 250 mM 蔗糖 |
| 10 mM Tris-HCl, pH 7.4 |
| 10 mM 丁酸钠 |
| 4 mM MgCl2 |
| 蔗糖垫 |
| 含30% (w/v) 蔗糖的洗涤缓冲液C |
| 微球菌核酸酶缓冲液 |
| 5 mM NaPO4 缓冲液，pH 7.0 |
| 0.025 mM CaCl2 |
| 包被缓冲液 |
| 80 ml 溶液 A + 170 ml 溶液 B + 250 ml dH2O |
| 溶液 A: 0.2 M Na2CO3 |
| 溶液 B: 0.2 M NaHCO3 |
5. 代表性结果
采用NU-ELISA方法，制备一系列完全相同的微孔板，可用于加载以单核小体形式制备的染色质。我们通常制备多块加样相同的微孔板，以便分别使用针对不同组蛋白翻译后修饰（PTM）的特异性抗体（Abs）进行检测。我们还始终制备一块使用可识别组蛋白而不依赖其修饰状态的抗体进行检测的微孔板，作为总染色质上样量的对照。该对照对于后续定量比较来自不同样本的核小体中PTM含量至关重要。为了定量特定染色质样本中PTM的水平，我们采用以下方法对原始吸光度值进行校正：首先，利用未加染色质的对照孔所获得的数值扣除背景信号（背景信号通常可忽略不计）；然后，将PTM特异性信号标准化为使用识别与修饰状态无关的核小体抗体检测的、加样量相同的微孔板所获得的NU-ELISA结果（为此目的，我们曾使用针对组蛋白H2A或H2B的多克隆抗体）。随后，我们计算每种染色质稀释度的均值和方差，并采用ELISA检测中线性区段的数据。此前已有文献详细报道过NU-ELISA的数学与统计分析方法4
图1. NU-ELISA 步骤示意图。A. 收获哺乳动物细胞； B. 通过Dounce匀浆法将细胞核从细胞中分离出来， C. 破碎的细胞被加在30% w/v蔗糖垫的上方， D. 离心后，细胞核沉积在沉淀中； E，F。 染色质被消化 原位 通过微球菌核酸酶（MNase）处理为主要生成单核小体； G, H, I通过低渗处理和对残留核物质进行反复离心提取可溶性单核小体。 J. 来自不同样本（本例中标记为样本1和2）的单核小体被依次包被在等量上样的微孔板上，并使用特异性识别组蛋白修饰位点的抗体（PTM特异性抗体）和不依赖组蛋白修饰的抗体（PTM非依赖性抗体）进行检测，以确定染色质的总上样量。 K. 两种样本的PTM含量不同但总体染色质含量相似（通过抗H2B免疫反应性判断），其差异性信号检测水平的示意图。
讨论
NU-ELISA 提供了一种用于确定特定细胞类型中核小体蛋白质翻译后修饰（PTM）整体状态的方法。NU-ELISA 研究表明，在不同细胞类型的比较中，核小体的整体修饰状态存在差异4。此外，当细胞暴露于表观遗传调控剂（如曲古抑菌素A）或小鼠胚胎干细胞发生分化时，NU-ELISA 检测到的 PTM 谱也会发生变化4。该方法已成功应用于人类胚胎干细胞染色质的研究5。需要注意的是，NU-ELISA 在目前的形式下仅能检测细胞表观基因组总和中存在的 PTM 综合特征。这与全基因组染色质免疫沉淀技术有显著区别，后者可确定特定 PTM 在特定基因位点上的分布情况。
NU-ELISA 实验的初始步骤借鉴了先前从哺乳动物细胞核中分离单核小体的方法6,7。这些改进后的方法能够快速地从哺乳动物细胞中获得高质量且完整的单核小体，所得组分在染色质内容上具有代表性，但同时含有大量其他核内物质。由于该实验使用特异性抗体，因此与需要更高纯度的质谱分析方法不同，NU-ELISA 实验能够较好地耐受非核小体来源的污染物质。然而，NU-ELISA 比蛋白质印迹法更敏感且更具定量性4，因此为检测核小体上的翻译后修饰提供了优于蛋白质印迹和质谱分析的良好替代方案。
致谢
NU-ELISA 方法的开发得到了美国国立卫生研究院（NIH）资助项目 RO1AG023687 的支持。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 微球菌核酸酶 | Sigma-Aldrich | N3755 | 配制成每10μl缓冲液含2 U的分装液，于-20°C保存 |
| Nunc MaxiSorp 微孔板 | Fisher Scientific | 12-565-135 | 粘性板盖也可通过Fisher订购 |
| 自动洗板机 | |||
| 1-Step TMB-ELISA底物 | Pierce, Thermo Scientific | 34028 | 4°C保存，使用前或按说明书要求恢复至室温 |
| 微孔板读板仪 | Bio-Rad | 大多数比色法微孔板读板仪型号均适用 |
参考文献
- Luger, K., Mader, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 A resolution. Nature. 389, 251-260 (1997).
- Jenuwein, T., Allis, C. D. Translating the histone code. Science. 293, 1074-1080 (2001).
- Turner, B. M. Histone acetylation and an epigenetic code. Bioessays. 22, 836-845 (2000).
- Dai, B., Rasmussen, T. P. Global epiproteomic signatures distinguish embryonic stem cells from differentiated cells. Stem Cells. 25, 2567-2574 (2007).
- Tanasijevic, B. Progressive accumulation of epigen etic heterogeneity during human ES cell culture. Epigenetics. 4, 330-338 (2009).
- Thomas, J. O. Isolation and fractionation of chromatin and linker histones. Chromatin: a practical approach. Gould, H. , Oxford University Press. Oxford. 12-14 (1998).
- Thorne, A. W., Cary, P. D., Crane-Robinson, C. Extraction and separation of core histones and non-histone chromosomal proteins. Chromatin: a practical approach. Gould, H. , Oxford University Press. Oxford. 38-39 (1998).
重印与许可
