本视频展示了一种方法，该方法结合了电穿孔技术和共聚焦显微镜技术，用于对发育中的斑马鱼前脑中的单个神经前体细胞进行活体成像。体内水平上对前脑神经前体细胞在克隆水平的发育过程分析可通过此方法实现。
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本文内容
摘要
摘要
神经前体细胞分裂、迁移和分化的精确模式对大脑的正常发育与功能至关重要1,2. 为了理解神经前体细胞在复杂环境中的行为 体内 环境，对完整大脑中神经前体细胞进行延时活体成像至关重要。在本视频中，我们利用斑马鱼胚胎的独特优势，可视化前脑神经前体细胞的发育过程 体内我们采用电穿孔技术对单个神经前体细胞进行稀疏的遗传标记。简言之，将编码荧光标记物的DNA质粒注射至受精后22小时（hpf）的斑马鱼胚胎前脑脑室中，随即施加电脉冲。6小时后，将电穿孔后的斑马鱼胚胎置于玻璃底培养皿中，用低熔点琼脂糖固定。随后，使用共聚焦显微镜配合水浸物镜，以固定时间间隔对荧光标记的神经前体细胞进行持续36小时的活体成像。该方法为研究神经前体细胞的动态行为提供了有效途径。 体内 前脑神经前体细胞的发育，并可应用于斑马鱼胚胎中枢神经系统的其他部分。
方案
1. 斑马鱼胚胎的制备
- 电穿孔前两天，使用隔板将野生型鱼按性别分开，设置交配笼。
- 电穿孔前一天，取出交配笼中前一日放置的隔板。
- 收集胚胎，将50个受精胚胎置于30 ml含0.003%苯硫脲（PTU）的胚胎培养基中培养，于 28.5°C.
- 电穿孔当天，当胚胎发育至22小时（22 hpf）时，使用精细镊子（Inox 5，Dumont Electronic，瑞士）手动去除胚胎的绒毛膜。随后将胚胎转移至10 ml电穿孔林格液中3 （180 mM NaCl，5 mM KCl，1.8 mM CaCl₂，5 mM Hepes pH 7.2）含 0.003% PTU。
- 添加 420 μl 将三卡因储备液（4 mg/ml）加入10 ml电穿孔林格液中，以麻醉胚胎。
2. 电穿孔的准备
- 使用 Sutter Instruments（美国加利福尼亚州诺瓦托）的 Flaming-Brown P897 拉针仪，从毛细管（外径 1.2 mm，内径 0.9 mm，带纤维）上拉制玻璃注射针。用镊子折断针尖，以获得如图 1D 所示的尖锐末端。针尖直径应约为 10 μm，锥角应约为 30 度。
- 在电穿孔林格溶液中配制 0.8% 和 1% 的低熔点琼脂糖（Shelton Scientific, Inc. 货号 #IB70050）。将....
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讨论
在本视频中，我们演示了一种在斑马鱼前脑发育过程中以克隆水平对神经前体细胞进行延时活体成像的方法。我们测试并改进了现有的电穿孔方案4-6，以实现对单个神经前体细胞进行遗传和荧光标记。由于仅使用相对较低的电穿孔电压，使少数细胞被稀疏标记，因此可以构建由克隆相关子代细胞组成的谱系树。除了EGFP外，通过将EGFP替换为其他荧光标记物，即可简单地实现神经前体细胞的亚细胞结构标记。例如，若将EF1α-GFF与UAS-E1B-膜-EGFP和UAS-E1B-H2B-mRFP共电穿孔，则单个前体细胞的细胞膜将被绿色荧光蛋白标记，而细胞核将被红色荧光蛋白标记。大多数被标记的前体细胞均保持健康状态，这由电穿孔胚胎整体发育正常以及活体成像过程中观察到的极少凋亡现象所证实。此外，使用低浓度琼脂糖固定胚胎，并在共聚焦活体成像过程中采用最低限度的激光功率，对于维持细胞健康也至关重要。该技术还可应用于中枢神经系统的其他区域，如后脑和脊髓。然而，该技术不能用于18小时后受精（hpf）之前的胚胎，因为DNA构建体必须被注射至脑室中才能进行电穿孔。
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
本工作由NIH基金NS042626资助。我们感谢Kurt Thorn和加州大学旧金山分校尼康影像中心在成像方面的协助。
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参考文献
- Temple, S. The development of neural stem cells. Nature. 414, 112-117 (2001).
- G#246;tz, M., Huttner, W. B. The cell biology of neurogenesis. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6, 777-788 (2005).
- Cerda, G. A., Thomas, J. E., Allende, M. L., Karlstrom, R. O., Palma, V.
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重印与许可
