测量小鼠的运动协调能力

摘要

本文介绍了两种成熟的运动协调任务的实验方案：加速转棒实验和水平横杆实验，以及牛津大学近期开发的另外两种测试方法：静态杆实验和平行杆实验。这些测试不仅能够检测可能具有独立研究价值的运动功能障碍，还可作为其他行为学测试中潜在的影响变量。

摘要

小鼠在行为神经科学中的应用日益广泛，很大程度上已取代大鼠成为行为学研究的首选动物。然而，在评估情绪性或认知等行为特征之前，至关重要的是要确定其运动能力是否 例如 突变体或损毁模型小鼠可用于此类评估。在需要力量与协调能力的迷宫任务（如莫里斯水迷宫）中，小鼠的表现受损可能源于运动功能障碍而非认知功能障碍，因此必须将认知功能障碍与运动功能障碍进行选择性区分。例如，已有研究表明，由NMDA受体拮抗剂引起的感觉运动功能障碍会损害小鼠在水迷宫中的表现。².

传统上，小鼠和大鼠的运动协调能力通过转棒实验进行评估，该实验将动物置于一根绕其长轴旋转的水平棒上；动物必须向前行走以保持直立而不跌落。转棒实验有固定速度和加速两种版本。

本文所述的其他三项测试（水平横杆、静态杆和平行杆）均用于评估动物在静态装置上的协调能力。其中，水平横杆测试还需要动物具备足够的力量才能完成，尤其是前肢的力量，因为小鼠最初仅用前爪抓住横杆。

成年大鼠在静态杆和平行杆等测试中表现不佳（个人观察）；它们似乎比小鼠的协调性更差。然而，我仅测试了雄性大鼠，而雄性小鼠通常似乎比雌性协调性更差。小鼠的相对力量：体重比似乎高于大鼠；其拉丁学名 Mus musculus 似乎非常贴切。转棒实验、足错步测试的多种变体¹²或Catwalk（Noldus）¹⁵装置通常用于评估大鼠的运动协调能力。

引言

行为通过动作表现出来，而动作需要运动技能，包括身体的协调。动物行为学历史上最早的实验之一由美国克拉克大学的博士生柯林·斯图尔特（Colin Stewart）完成¹¹。他通过将大鼠放入一个滚筒内并记录滚筒转动的次数来测量其活动量。这种早期装置可能是跑轮以及目前使用的转棒实验的前身，尽管在斯图尔特装置中，大鼠位于滚筒内部，滚筒的转动由大鼠自身驱动；而在转棒实验中，动物则在外部一个由电机驱动的旋转滚筒或转棒上行走。

Dunham 和 Miya（1957）⁷ 最初使用的转棒具有固定转速，但如今已有可加速版本（Jones 和 Roberts，1968）⁹。固定转速转棒的缺点在于，一些协调性较差的动物会在测试开始时立即掉落，而对于能够持续停留的动物，测试很快会转而测量耐力而非协调性本身。由此产生的数据点双峰分布可能严重偏离正态，以致无法进行参数分析。当使用加速式转棒时，特别是当转速仅在达到特定标准（例如持续停留 10 秒）后才开始增加时，数据分布更倾向于符合高斯分布。可通过调整加速度，使运动疲劳对表现的影响不具显著性；小鼠在转棒上仅持续 2-3 分钟时，通常不会出现明显的疲劳。

“悬线试验”¹、“衣架试验”或水平杆试验用于测量前肢力量与协调性。所引用的两个别称与其发展历程有关；最初使用的是绳线，但作者指出实验结果在很大程度上取决于绳线的紧绷程度，因此后续研究者改用金属杆，通常为衣架制成的横杆。我们发现，小鼠抓握横杆的能力与其直径呈反比，因此我们通常采用直径为2 mm的横杆。在负重试验中（参见 JoVE 方案《小鼠力量的测量》），电水壶毛发/碎屑收集器所用的极细金属丝可使最强壮的动物牢固抓握，甚至能提起超过自身体重的负荷。然而，使用直径更大的水平横杆具有一定优势，因为试验的敏感性随之提高；仅使用2 mm横杆时，大多数正常的C57BL/6小鼠即可达到性能上限。因此，我们近期采用了一种三杆装置；这些横杆可轻松更换，因其可插入支撑柱顶部的凹槽中。横杆处于张力状态下（对于确保2 mm横杆的刚性尤为重要），因为只有在支撑柱略微向内收紧时（类似于长弓与其弓弦的关系），横杆才能卡入凹槽（见图3）。

静态的杆或横梁常被用于测量协调性，但以往总是需要额外的动机来促使动物穿过杆。它们会通过一条水平横梁以到达期望的目标，例如回到笼舍、躲避强光或获取食物（如果事先使其处于饥饿状态）。然而，在研究这类测试的过程中，我发现当小鼠被放置在悬臂杆的“开放”端时，会自发地转身，然后沿着杆行进直至到达被支撑的一端。该技术无需训练（此前所述的测试变体则需要），因为小鼠被放置在高架杆末端附近时，其本能反应就是试图到达被支撑的一端。当然，这种方法并不能消除动机变化可能影响表现的问题，而这在此类实验程序中始终是一种可能性。

目前，纸板隧道被广泛用于笼内环境富集，但在本实验情境下存在一个缺点：动物不可避免地会练习在可绕其长轴晃动的圆柱体上保持平衡，这种技能与在转棒上保持平衡所需技能相似。因此，笼内环境富集可能会掩盖某种行为表型；例如，环境富集可改善亨廷顿病的表型¹⁴。此外，动物通常会沿着这些隧道的长轴行走，类似于在高架静止横梁上行走的情况。因此，我设计了一对高架平行杆，将小鼠置于中间位置，使其前肢位于一根杆上，后肢位于另一根杆上，这种情形是它们此前从未经历过的。小鼠必须在保持直立姿势的同时行进至平行杆的末端支撑处，才算通过测试。一种类似装置是将一系列平行杆放置在小鼠笼内，用于评估瘙痒病诱导的运动功能障碍的发展情况¹³。

我们已在牛津对数百只小鼠进行了运动功能测试。这些小鼠接受了多种处理，包括药物干预或来自人类的组织（血浆）被动转移，但主要是经过基因改造的动物。一些小鼠在力量任务上的表现比协调性任务更差，而另一些则相反。有些小鼠在转棒试验中的表现比在静态基质（如静态杆和平行杆）上更差，而其他小鼠则表现出相反模式。因此，本文及配套的 JoVE 实验方案《小鼠力量的测量》描述了如何表征不同处理和突变对小鼠运动功能产生的差异性影响。除转棒仪外，本文所述设备结构简单、成本低廉，特别适用于非专门从事运动技能测试的实验室。对于精细步态分析，Catwalk 系统远比旧方法（例如诱导小鼠穿过墨水浴后行走于纸张上）更为先进，但它是一种价格昂贵的设备。

所有这些测试旨在测量协调性而非力量，尽管显然小鼠需要具备一定程度的最低肌张力才能使用其四肢。若需评估力量，则倒置网格实验¹⁰更为合适；若需要更分级的测量方法，可采用负重测试或其自动化版本——拉杆测试（详见 JoVE 实验方案“小鼠力量的测量”）。唯一的例外是水平横杆测试，该测试的成功完成既需要力量也需要协调性。

方案

1. 仪器设备

所有实验中，装置底部均放置柔软的垫子，以缓冲意外掉落的小鼠。注意：图中未显示此垫子，以免遮挡装置的任何部分。在测试数百只正常和突变小鼠的过程中，我们从未观察到因从通常高30-50 cm的装置上掉落而造成的任何损伤。此外，务必在每只小鼠测试之间清洁并消毒设备。

1.1 旋转杆实验

市场上有多种该装置的商用版本，但其中一些存在缺点，例如无法以足够快的速度加速，从而难以检测运动失调（而非耐力）。另一个常见问题是滚筒离底座的高度不足，导致小鼠容易掉落或跳下。

图 1 所示的转棒仪由牛津大学药理学系工程部门根据作者的设计制作而成。转棒直径为 3 cm，支撑于仪器底座上方 30 cm 处。棒的表面沿纵向轴线设有若干平行的滚花棱纹，使小鼠能够有效抓握（Figure 2）。注意：棱纹的深度是一个关键细节；若小鼠无法牢固抓握，测试将变得困难得多；反之，若抓握力过强，小鼠会因被动紧握转棒而出现“翻跟头”现象。对于“非专业转棒仪制作者”，了解以下信息可能有所帮助：市面上可购得适合小鼠使用的、具有滚花表面的木质圆棒；当然，使用前需涂覆良好的防水清漆进行处理。起始转速设定为 4 rpm，加速度设定为 20 rpm/min。最高速度为 40 rpm。

两个挡板可防止小鼠离开圆杆。挡板直径为30 cm（可能可减小至20 cm）。挡板间距设置为6 cm（最大值），但如果未成年小鼠在圆杆上容易转身，则可能需要将间距调小。

1.2 三条水平横线（图3）

这些横杆由黄铜制成，长38厘米，通过两端的木制支撑柱固定在实验台面上方49厘米处。支撑柱固定在厚重的木质底座上。提供三种横杆直径：2毫米、4毫米和6毫米。我们通常使用2毫米直径的横杆作为标准，但许多小鼠在此直径上可达到最高分。因此，引入了较大直径的横杆以改进测试，因为小鼠在较粗的横杆上抓握能力较差。

1.3 静态杆

将五根长度均为60 cm、直径不同（分别为35（杆1）、28、22、15和9（杆5）mm）的木质圆杆，用G形夹固定在实验室架子上，使圆杆水平悬空伸出（图4）。靠近实验台一端的杆上，在距末端10 cm处做一标记，作为终点线。圆杆距地面的高度为60 cm。

如果需要更短且更简略的测试，可仅使用最大、最小和中等尺寸的圆棒。Van Dellen 等¹⁴ 在评估小鼠亨廷顿病进展时仅使用了单根圆棒。

1.4 平行杠

两根平行的钢条，长度为1米，直径为4毫米，通过两端的木制支撑柱固定，中心间距为30毫米（图5）。钢条距离地面60厘米。

2. 实验步骤

所有实验前，将小鼠提前5-20分钟移至实验室内，以确保其完全清醒。通常情况下，每次运动测试后，应将小鼠放回饲养笼中休息，以便其肌肉力量恢复并使觉醒水平恢复正常。

2.1 旋转杆实验

将转棒的起始速度设为4 rpm，加速度为20 rpm/min。用手抓住小鼠尾巴，将其放置在旋转杆上，使小鼠朝向与旋转方向相反，从而必须向前行走以保持直立。最简便的操作方式是将小鼠以低于水平方向约45°的角度从下方接近转棒；若尝试从上方垂直放下小鼠，会导致其后肢张开并抓握法兰边缘。当小鼠接近转棒时，迅速在转棒上死点前方稍偏上位置释放，使其能够轻松抓住转棒。另一种（可能更简便且更可靠）的方法是使用一根细棒（直径10–15 mm）。用一只手握住小鼠，将其放至与转棒长轴平行的细棒上，细棒倾斜约30°，使小鼠头部略向下，以便其在释放后有更充足的时间抓住转棒。将小鼠和细棒一起从转棒的法兰之间放下，当越过旋转杆后，迅速将细棒向下抽出，小鼠即会抓住转棒并向前行走。

将小鼠放置于转棒上10秒后开始加速（前提是小鼠朝向前方；若未朝向前方，则需等待其调整方向后再开始加速），并记录小鼠掉落时的速度。若小鼠在10秒前掉落，记录掉落时间，并可重复尝试，最多共三次，取10秒后第一次掉落时的速度进行记录。然而，若在5秒前掉落是由于实验操作者放置不当所致，则不应记录该次数据。以掉落时的平均速度作为最终数据；采用平均速度而非最大速度，可校正因失败试验中额外练习所带来的影响，从而更准确地反映小鼠的真实表现。例如，某小鼠第一次在10秒前掉落，第二次坚持到12 rpm才掉落，则其得分为(4+12)/2 = 8 rpm；若某小鼠前两次均在10秒前掉落，第三次坚持到10 rpm，则得分为(4+4+10)/3 = 6 rpm。若某小鼠连续三次在10秒内均无法抓握转棒，则赋予其4 rpm的得分。

一个问题在于，小鼠有时会停止向前行走，转而紧紧抓住转棒，从而被动地翻滚，尽管大多数小鼠最终会掉落。因此，记录首次发生此类翻转时的速度可能具有参考价值。一个可能的解决方案是使用直径更大或表面凸起较不明显的转棒。

2.2 水平条

由于小鼠最容易抓握2 mm的细杆，建议首先使用该杆进行测试。用手握住小鼠的尾部，将其放置在仪器前方的实验台上，迅速向后滑动约20 cm（使其身体与横杆垂直），然后快速上提，使其仅用前肢抓住横杆中央位置，随即松开尾部，同时启动秒表。此操作可能较难熟练掌握；部分小鼠在尾部突然松开时抓握更牢固；若其感觉仍被支撑，则可能无法有效抓握。判定终点为小鼠在到达横杆任一末端立柱前跌落，或前肢触碰到立柱的时间。最长测试时间（截止时间）为30秒。

如果小鼠首次未能正确抓握横杆，且该情况似乎归因于实验操作者的技术而非小鼠自身原因，则可在稍作休息后（在此期间测试另外一至两只小鼠）重新尝试一次，并且此次跌落不作记录。如果小鼠在5秒前跌落，且显然并非由于实验操作者放置不当所致，则可重复测试最多三次，以获得一次>5秒的成绩。若第二次尝试已达到>5秒，则无需进行第三次试验。以最佳成绩作为最终数据。若某只小鼠多次尝试均无法持续支撑自身超过>5秒，则记为1分。

如果使用三杆版本，在小鼠首次于2 mm杆上得分为5分后，可让其在经过短暂休息后测试更粗的杆，休息期间可测试其他一至两只小鼠。4 mm和6 mm杆的评分系统与2 mm杆相同，最终得分为累计总分。例如，一只小鼠在2 mm杆上得分为5分，但在4 mm杆上13秒后掉落，则其得分为5+3=8分。

2.2.1

横杆评分标准：前两个时间区间的分值低于后两个区间，因为小鼠在初步掌握任务后较少发生坠落：
在1-5秒内坠落 = 1分
在6-10秒内坠落 = 2分
在11-20秒内坠落 = 3分
在21-30秒内坠落 = 4分
30秒后坠落 = 5分
前爪触及横杆支撑且未坠落 = 5分

需要注意的是，由于可选使用4 mm和6 mm的棒材是本方案中的新增步骤，我们目前尚无关于它们的丰富使用经验。

2.3 静态杆

将小鼠置于最宽的杆远端（鼻尖距离杆端约一个头长为宜）。记录两项指标：定向时间（从小鼠起始位置转向180°朝向平台所需的时间）和通过时间（小鼠行进至杆的平台端所需的时间，以鼻尖越过杆末端平台侧10 cm标记处为终点）。

方向感依赖于小鼠保持直立姿势；如果小鼠翻转至倒挂并抓附在杆的下方，则可任意为其赋予最大方向感评分120秒（用于统计目的）。此时不应再在较细的杆上进行测试；此外，穿行时间也应记为最大值，因为以直立姿势穿行的小鼠显然比倒挂穿行的小鼠具有更好的协调能力。

如果小鼠在定向后掉落，或已达到最长测试时间（人为设定为120秒），则不再在更细的杆上进行测试。出于统计目的，对于掉落的小鼠，该次及后续所有杆的得分均记为120秒，因为假设其在更细的杆上仍会掉落。如果小鼠在杆上翻转至腹面朝上，也需记录该事件；小鼠必须始终保持直立姿势，方能视为成功通过和完成定向。否则，应赋予其最高分值。当小鼠到达杆的末端或掉落时，将其移开。

在一根杆上测试完毕后，将小鼠放回其居住笼中休息，同时测试另一只小鼠。然后将其放置在下一根更细的杆上，以相同方式再次进行测试。若小鼠在杆上停留超过5秒后跌落，则停止测试。若小鼠在5秒内跌落，可将其重新放置并允许再次尝试（因为5秒内跌落可能是由于实验人员放置不当所致），最多进行三次尝试，并采用其中最佳的结果。

2.4 平行杠

将小鼠放置在两根横杆中央，使其身体长轴与横杆长轴垂直；两只前爪应位于同一根横杆上，两只后爪位于另一根横杆上。评分方法与静态横杆实验类似。记录两个指标：小鼠从起始位置转向90°所需的时间，以及随后到达任一端部支撑点所需的时间。若小鼠发生翻转倒挂，需记录该事件。与静态横杆实验相同，只有在未发生倒挂的情况下完成转向和通过，才视为有效；否则记为最长耗时。健康状况尚可的小鼠极少在5秒内坠落；若发生此情况，可能源于放置不当，应舍弃该数据并重新测试该小鼠。

结果

预期结果

最初使用静止杆来监测突变小鼠亨廷顿病的进展，这些小鼠在笼内有或无环境富集条件¹⁴。环境富集方案显著延缓了小鼠在静止杆上运动功能障碍的出现，这一现象伴随着后肢爪状收缩（神经系统损伤的普遍征象）发生时间的延迟。

感染羊瘙痒病的小鼠在注射后第16周开始出现水平杠性能下降，第18周开始在转棒实验中表现下降，至少从第19周起在静态杠实验中也出现下降⁸（更早时间点未进行测试）。KATP通道亚基Kir6.2基因敲除小鼠在静态杠和水平杠实验中表现受损，但在转棒实验中未受影响⁴。海马损伤对任何运动能力指标均无影响⁵，但与C57BL/6品系相比，129S2/Sv小鼠在转棒和静态杠实验中表现较差³。C57BL/10小鼠的运动表现也比C57BL/6小鼠差⁶，尽管其程度不及129S2/Sv小鼠。

图1. 转棒仪。

图 2. 转棒仪滚花杆的细节。

图3. 三根水平杆。 插入凹槽中的杆是基本的2 mm杆；其下方附加（仅用于演示）的是4 mm和6 mm的杆。实际操作中，每次仅将一根杆插入带凹槽的支撑架中。

图 4. 小鼠穿越一根静止的杆。

图5. 小鼠在平行杆上。 为演示目的省略了垫料。