一种直接从血培养物中鉴定 Enterococcus 物种的1.5小时操作流程

摘要

一种利用肽核酸荧光原位杂交实验（PNA FISH）快速直接鉴定阳性血培养中粪肠球菌及其他肠球菌属物种的实验方案。

摘要

肠球菌是引起菌血症的常见原因 E. faecalis 以粪肠球菌为优势菌种，其次是屎肠球菌。由于对氨苄西林和万古霉素的耐药性 E. faecalis 与粪肠球菌中的耐药性相比，这种现象仍不常见，因此开发能够区分肠球菌种类的快速检测方法，对于合理治疗和耐药性监测具有重要意义。 E. faecalis OE PNA FISH 检测法（AdvanDx，Woburn，MA）采用针对特定物种的肽核酸（PNA）探针进行荧光原位杂交 原位 杂交格式，可在1.5小时内获得结果，有望为物种特异性治疗提供重要信息。已开展多中心研究以评估该1.5小时检测方法的性能 E. faecalis与原始的2.5小时检测程序及标准细菌学方法相比，OE PNA FISH程序直接从阳性血培养瓶中鉴定肠球菌。

方案

1. 标本采集与制备

1. 采集疑似脓毒症患者的静脉血，分别注入两支BACTEC（BD，Sparks，MD）血培养瓶中，一支需氧瓶和一支厌氧瓶，共同组成一套血培养标本。
2. 将血培养瓶放入BACTEC 9240仪器中，在35°C条件下孵育。
3. 继续孵育直至仪器因血培养瓶中微生物生长而触发报警。
4. 从血培养仪器中取出培养瓶。

2. 染色前试剂的准备

1. 向染色缸中直接加入 4 mL 的 60 倍浓缩洗涤液和 240 mL 新鲜的去离子水或蒸馏水，配制洗涤液。
2. 将染色缸放入 55°C 水浴中预热。
3. 将剩余的浓缩液储存在 2–8°C 环境中。
4. 从冰箱中取出封片介质，并恢复至室温。

3. 革兰氏染色

1. 轻轻旋转混匀血培养瓶。
2. 使用针头和注射器或转种装置，从瓶中取出血液（约 5 mL），并置于无菌螺口管中。
3. 用无菌移液管取一滴大量血液，滴加到玻璃显微镜载玻片上。
4. 将载玻片在空气中干燥，并用甲醇固定 10 秒。
5. 让载玻片自然晾干。
6. 对血膜进行革兰染色，以确定血培养瓶中生长微生物的形态特征。
7. 使用油镜观察载玻片。革兰染色显示成对或短链排列的革兰阳性球菌，最符合肠球菌属（enterococcus species）的特征。
8. 该革兰染色结果将指导选择合适的 PNA FISH 探针试剂盒用于细菌鉴定。本血培养样本将使用 E. faecalis/OE PNA FISH 染色法进行染色。

4. PNA FISH 染色

1. 在制备涂片前，轻轻旋转混匀含有血液的试管。
2. 在PNA FISH显微镜载玻片的凹槽中加入一滴固定液。
3. 从阳性血培养试管中转移10 μL或一小滴样本至固定液中，并轻轻混匀以形成乳状液。
4. 将涂片置于加热板上，在55°C下加热20分钟以进行固定。

5. 质量控制材料

每批染色切片必须同时检测一张阳性对照切片和一张阴性对照切片。

1. 为此目的，使用从 AdvanDx 购买的 E. faecalis/OE 对照载玻片，或使用 E. faecalis 和 E. faecium 参考菌株的液体培养物制备涂片，作为阳性对照，可分别置于不同的载玻片上，或混合于同一张载玻片上；同时使用 Staphylococcus spp 或 Streptococcus spp 作为阴性对照材料。

质量控制结果应能够监测适当的检测条件，特别是影响杂交严谨性和细胞壁通透性的条件，因为PNA方法旨在优化细胞壁通透性

6. 杂交

1. 在载玻片的涂片上滴加一滴 E. faecalis/OE PNA。
2. 加盖盖玻片，避免产生气泡。
3. 将载玻片置于加热板上，在 55 ± 1°C 条件下孵育 30 ± 5 分钟。
4. 孵育结束后，将载玻片放入染色架中。

7. 严格洗涤

1. 将载玻片架浸入预热至 55°C 的洗涤液中，并小心移除盖玻片。通常，轻轻晃动载玻片即可使盖玻片自行滑落。偶尔需用镊子轻轻推下盖玻片。
2. 在 55 ± 1°C 条件下于洗涤液中孵育 30 ± 5 分钟。
3. 从洗涤液中取出载玻片
4. 让载玻片自然风干

8. 封片

1. 在每张载玻片上加入一滴封片剂。
2. 加盖盖玻片，避免产生气泡。
3. 在2小时内使用荧光显微镜观察载玻片。
4. 请勿将载玻片暴露于直射阳光或其他强光源下，以免导致荧光淬灭。

9. 结果解读

用于玻片检查的荧光显微镜必须配备AdvanDx双波段滤光片以及60倍或100倍油镜物镜。应首先检查质控玻片，以确认杂交反应确实发生。E. faecalis应表现为多个视野中明亮的绿色荧光球菌，而E. faecium则表现为明亮的红色荧光球菌。非肠球菌对照玻片应无荧光。在确认对照样本系统正常后，可开始检查患者玻片。最初血膜可能呈红色，但明亮的红色和绿色球菌将非常明显。

图1. 绿色阳性 E. faecalis（左）、红色阳性 E. faecium（中）和阴性（右）检测结果的代表性示例。

10. 代表性结果

本研究纳入了三家机构开展的一项多中心临床试验，旨在评估这种PNA FISH染色法，并将2.5小时方案与刚刚审阅过的缩短至1.5小时的方案进行比较。研究共纳入152例常规检测中呈革兰阳性成对或链状排列的球菌（GPC）血培养瓶阳性样本。改良法与原始检测方法在E. faecalis/其他肠球菌（OE）PNA FISH结果上完全一致，达到100%（152/152）：其中E. faecalis为41/41，其他肠球菌为33/33，其他GPC为78/78（表1）。在本项临床试验中，该染色方法表现出极高的灵敏度和特异性（表2）。

	常规方法	E. faecalis /OE PNA FISH 标准操作程序	E. faecalis/OE PNA FISH 简明操作流程
E. faecalis	41	41（绿色阳性）	41（绿色阳性）
E. faecium	27	27（红色阳性）	27（红色阳性）
E. casseliflavus	2	2（红色阳性）	2（红色阳性）
E. gallinarum	2	2（红色阳性）	2（红色阳性）
其他 肠球菌属 spp.	2	2（红色阳性）	2（红色阳性）
S. pneumoniae	17	17（阴性）	17（阴性）
S. viridans	33	33（阴性）	33（阴性）
S. mitis	1	1（阴性）	1（阴性）
S. pyogenes	3	3（阴性）	3（阴性）
S. bovis	2	2（阴性）	2（阴性）
S. salivarius	1	1（阴性）	1（阴性）
S. sanguinis	2	2（阴性）	2（阴性）
S. agalactiae	7	7（阴性）	7（阴性）
其他 链球菌 种（spp.）	7	7（阴性）	7（阴性）
Abiotrophia 属 spp.	3	3（阴性）	3（阴性）
Peptostreptococcus 属	2	2（阴性）	2（阴性）
总计	152	152/152 100% 一致	152/152 100% 一致

表1. 使用标准（2.5小时）和快速（1.5小时）方案检测的细菌列表。

E.faecalis 的敏感性	其他 Enterococcus spp. 的敏感性	特异性
100% (41/41) 95% CI (93.0-100)	100% (33/33) 33/33 95% CI (91.3-100)	100% (78/78) 95% CI (96.2-100)

表2. 1.5小时PNA FISH实验方案的灵敏度与特异性。

讨论

的 E. faecalis/OE PNA FISH 检测法对肠球菌的鉴定比标准培养方法提前 2-3 天。该检测的简化流程（1.5 小时）可实现快速鉴定，有助于优化抗菌治疗方案并改善患者预后。Forrest 等人开展的一项研究为此提供了支持。 等 (6). 从2005年开始的连续两年中，微生物学实验室通过传统微生物学方法鉴定出血液培养瓶中生长的成对和链状排列的革兰阳性球菌，2006年增加了 E. faecalis/OE PNA FISH。此外，由本机构抗菌药物团队（AMT）制定了一项治疗流程算法，以及时有效地利用实验室生成的PNA FISH数据。主要评估结局为实施有效抗菌治疗的时间，即从血培养采集至有效抗菌治疗开始的时间，在PNA FISH引入实验室工作流程前后的变化。同时评估了疾病严重程度、患者所在科室及经验性抗菌治疗情况。共纳入224例医院获得性肠球菌菌血症患者，其中干预前阶段129例，PNA FISH阶段95例。PNA FISH鉴定出 E. faecalis 比传统培养方法提前3天（1.1天 vs. 4.1天，p<0.001）。PNA FISH 鉴定出屎肠球菌的中位时间早 2.3 天（1.1 天 vs. 3.4 天，p<0.001），并与启动有效治疗的时间显著缩短相关（1.3 天 vs. 3.1 天，p<0.001）以及降低30天死亡率（26% vs. 45%，p=0.04）。该组研究者得出结论认为 E. faecalisOE PNA FISH 检测联合 AMT 治疗方案可促进医院获得性粪肠球菌菌血症患者更早启动适当的经验性抗菌治疗。

1. 试剂不得在标签上标注的有效期后使用，且不得以任何方式修改试剂。不使用时应将其保留在冰箱中，否则可能导致试剂失效。
2. 采样前需混匀血培养瓶。
3. 滴管瓶瓶口不得接触血涂片，以免造成载玻片之间的交叉污染或试剂污染。
4. 确保水浴箱和加热块始终保持在恒定的 55°C。
5. 必须使用双波段滤光片，否则颜色将无法清晰分辨。
6. 必须使用显微镜载玻片，否则杂交反应将无法发生。
7. 显微镜必须处于正常工作状态。确保显微镜灯泡的使用时长在允许范围内。

• 某些罕见的肠球菌种类无法被针对其他肠球菌种类的PNA探针检测到，例如 E. asinii、E. dispar、E. haemoperoxidus、E. cecorum、E. columbae、E. saccharolyticus、E. solitarius 和 E. sulfurous。
• 由于序列相似性，E. moraviensis 被鉴定为 E. faecalis。
• 由于序列相似性，某些 Streptococcus anginosus 菌株会产生假性的绿色荧光阳性结果。
• 在临床研究期间未评估VersaTREK血培养瓶的性能。使用VersaTREK血培养瓶检测 E. faecalis 及其他肠球菌属物种的能力尚不明确。
• 若使用标准的FITC滤光片而非双波段滤光片，可能会出现假阳性绿色自发荧光。
• 由于混合生长或实验操作技术错误，可能会偶尔出现假阴性结果。
• 所用仪器的类型和状态会影响所获得图像的视觉外观。荧光强度可能因所用显微镜类型、光源以及细胞中rRNA含量的不同而有所差异。
• 需要在固体培养基上进行分离培养，以区分与其他微生物的混合生长，并识别产生阴性结果的阳性血培养样本。
• 该产品尚未在除血培养以外的其他标本类型中进行过验证。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
试剂 E. faecalis/– PNA FISH 由以下试剂盒组分组成： <李>固定液 固定液 含去垢剂的3 mL磷酸盐缓冲液。 <李>E. faecalis/– PNA E. faecalis/– PNA 1.5 mL PNA探针杂交液，含30%甲酰胺。 <李>60倍洗涤液 60倍洗涤液 50 mL 含去垢剂的Tris缓冲盐水 <李>封片剂 含3 mL 甘油的光漂白抑制封片剂 <李>质量控制切片 <李>AdvanDX