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研究膜蛋白的构象动力学 原位 采用位点特异性荧光标记

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DOI：

10.3791/2627

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2011年5月29日

 , 
1Department of Chemistry and Biochemistry, Worcester Polytechnic Institute

本文内容

摘要

我们将介绍一种在单细胞水平上结合荧光技术测量膜蛋白离子转运动力学及构象变化位点特异性分析的方法。该技术适用于离子通道、转运蛋白和离子泵，并可用于确定蛋白质亚基之间的距离限制。

摘要

双电极电压钳电生理学（TEVC）是一种强大的工具，可用于研究多种膜蛋白（包括离子通道）介导离子转运的机制¹2离子泵3和转运蛋白4最近的研究将位点特异性荧光标记与双电极电压钳技术（TEVC）相结合，可同时检测单个细胞表面特定残基的构象动态及这些蛋白的功能。

我们将介绍一种通过电压钳制荧光法同时监测荧光和电流变化来研究膜蛋白构象动力学的方法。该方法可用于在半胱氨酸替换及位点特异性荧光标记后，针对特定位置检测膜蛋白的分子运动5,6。此外，该方法还可用于确定特定残基之间的距离限制7,8。 这是通过将供体和受体荧光团选择性地连接至两个感兴趣的突变半胱氨酸残基来实现的。

简而言之，这些实验是在目标蛋白于Xenopus leavis卵母细胞表面实现功能性表达后进行的。这些卵母细胞具有较大的表面积，便于进行功能性测量并产生较强的荧光信号5。此外，可轻松改变细胞外环境条件（如pH值、配体或阳离子/阴离子），从而进一步揭示膜蛋白的作用机制4。最后，近年来的技术进展还实现了在共表达第二种蛋白后对特定胞内离子的操控9。

本方案分为多个部分。首先，在跨膜区与胞外区界面处的残基上进行半胱氨酸扫描突变，随后进行荧光团标记。后续实验旨在鉴定那些在蛋白质构象变化时荧光强度发生显著改变（<5%）3的残基。其次，将这些荧光强度的变化与膜蛋白的动力学参数进行比较，以关联构象动态与蛋白质功能10。这使得能够对目标蛋白的分子运动进行严格的生物物理分析。最后，可对全酶上的两个残基分别标记供体和受体荧光团，利用供体光漂白方法测定距离限制。此外，通过使用供体和受体荧光团标记，还可监测蛋白质亚基之间的相对运动。

方案

1. 蛋白质表达

将目标膜蛋白基因克隆至适用于表达的载体中 Xenopus laevis 卵母细胞表达，例如 pTLN11 或 pSG01MX12优化的载体包含 5' 和 3' Xenopus laevis β-珠蛋白非翻译区11,12，一个独特的限制性酶切位点，以及位于5'非翻译区之前的RNA启动子位点11这些组分分别用于卵母细胞中基因的最佳表达、质粒在mRNA合成前的线性化以及mRNA的合成。

2. 半胱氨酸突变

  1. 利用蛋白质的氨基酸序列，通过 Kyte-Doolittle 图谱（ProtScale, ExPASy）13 鉴定目标蛋白的跨膜结构域。数据以疏水性相对于序列编号的形式展示。显示正值的残基最可能位于跨膜结构域内。利用该图谱确定位于跨膜结构域与胞外结构域交界处、最有可能被突变为半胱氨酸的残基。由于仅凭 Kyte-Doolittle 图谱无法完全准确地预测跨膜结构域与胞外区域的交界位置，因此有必要考察一组被预测位于该交界区域的残基。选择蛋白的这一区域是基于荧光团在构象变化过程中可能发生的位置移动：荧光团将在亲水与疏水环境之间，或在水淬灭较强与较弱的环境之间移动。这些预测的环境变化均会导致荧光强度的改变。
  2. 使用 QuickChange 定点突变试剂盒（Stratagene）构建单个可被胞外接触的半胱氨酸突变体。简而言之，将 5 μL 10× 反应缓冲液、2 μL 浓度为 5 ng/μL 的质粒 DNA、各 1.25 μL 浓度为 100 ng/μL 的正向和反向引物、1 μL dNTP（100 mM）以及 39.5 μL 双蒸水混合。最后加入 1 μL PfuTurbo DNA 聚合酶（Stratagene）。此步骤所用引物应设计为在感兴趣的胞外残基位置引入半胱氨酸突变。
  3. 将热循环仪程序设置如下：95°C 预变性 30 秒，进行 1 个循环；随后进行 12–18 个循环，每个循环包括 95°C 变性 30 秒、55°C 退火 1 分钟、68°C 延伸（按质粒长度每 kb 延伸 1 分钟）。退火温度（55°C）根据每条引物的熔解温度直接计算得出。若反应需过夜进行，可设置最后一步在 4°C 保温。循环次数取决于突变类型：点突变使用 12 个循环，单个氨基酸替换使用 16 个循环，多个氨基酸插入则使用 18 个循环。
  4. 向反应体系中加入 1 μL DpnI（New England Biolabs），用移液器混匀后离心（6000 rpm）1 分钟。随后在水浴中 37°C 孵育 1 小时。
  5. 将 top 10 电转感受态细胞（Invitrogen）置于冰上融化，并将无菌 SOC 培养基（20 mg/mL 胰蛋白胨、5 mg/mL 酵母提取物、1 mg/mL NaCl、0.4 mg/mL KCl、0.02 M Mg2+、0.02 M 葡萄糖、ddH2O）在 37°C 预热备用。取 20 μL 感受态细胞分装至 1.5 mL 离心管中，加入 1 μL 经消化的 DNA。
  6. 向 Cell-Porator（Life Technologies）中加入冰水，将电容设置为 330 μF，充电速率设为快速，电压增强器的电阻设为 4 kΩ。
  7. 将 20 μL 细胞/DNA 混合液移入电穿孔比色皿中。将比色皿放入 Cell-Porator，关闭盖子，连接电源线，并将旋钮调至对应的比色皿位置。将电源设为充电状态，并持续按“上”键直至电压显示为 430。然后将旋钮转至“准备”（arm）位置并按下触发键。若出现爆裂声，则需重新进行电穿孔操作。
  8. 将比色皿中的细胞吸出并转移至 1.5 mL SOC 培养基中。在 37°C 摇床中孵育 1.5 小时。
  9. 取 30 μL SOC/细胞混合液涂布于 LB/氨苄青霉素琼脂平板（10 mg/mL 胰蛋白胨、5 mg/mL 酵母提取物、10 mg/mL NaCl、15 mg/mL 琼脂、ddH2O 和 100 ng/μL 氨苄青霉素）上。均匀涂布后，于 37°C 过夜培养。
  10. 从平板上挑取单克隆菌落，接种至含 LB/氨苄青霉素培养基（10 mg/mL 胰蛋白胨、5 mg/mL 酵母提取物、10 mg/mL NaCl、100 ng/μL 氨苄青霉素、ddH2O）的 5 mL 液体培养基中，于 37°C 摇床培养 16–20 小时。
  11. 使用 Nucleospin 质粒提取试剂盒（Macherey-Nagel）进行质粒小提。通过琼脂糖凝胶电泳对提取产物进行定性分析。使用 Nanodrop 2000c 分光光度计（Thermo Scientific）定量测定 DNA 产量。
  12. 通过 DNA 测序验证突变的正确插入。

3. mRNA 合成

  1. 为线性化 DNA，将 3 μg 质粒 DNA 溶于 50 μL 反应体系中，加入 5 μL 适当的缓冲液和 1 μL 限制性内切酶，在 37.0°C 下孵育 1 小时。
  2. 使用 High-Pure PCR Product Purification Kit（Roche Applied Science），向消化反应管中加入 350 μL 结合缓冲液，短暂涡旋混匀。该试剂盒含有异硫氰酸胍，可使产物达到 RNA 级纯度。
  3. 将离心柱放入收集管中，将消化后的 DNA 溶液加入柱中。在 18,000g 下离心 20 秒，弃去穿流液。
  4. 向柱中加入 500 μL 洗涤缓冲液。在 18,000g 下离心 20 秒，弃去穿流液。
  5. 向柱中加入 200 μL 洗涤缓冲液。在 18,000g 下离心 30 秒，或直至柱体完全干燥。
  6. 将离心柱转移至经高压灭菌的 1.5 mL 离心管中，向柱中加入 50 μL 经 DEPC 处理的水。在 18,000g 下离心 30 秒，洗脱 DNA。
  7. 将洗脱的 DNA 浓缩至约 15 μL，最终获得 3 μL 溶液中含有 0.5 μg DNA。
  8. 根据质粒 DNA 中的启动子序列（SP6 或 T7），选择相应的 mMessage mMachine Kit（Ambion）。加入 5 μL 1 NTP-加帽混合物、3 μL 上一步获得的线性化 DNA、1 μL 转录缓冲液和 1 μL 对应的 RNA 聚合酶。在 37°C 下孵育 1.5–2 小时。
  9. 加入试剂盒中的 12.5 μL LiCl 溶液和 15 μL DEPC 水，短暂混匀（勿涡旋），在 11,000g 下离心 10 秒，随后在 -20°C 下静置至少 30 分钟以进行沉淀。
  10. 将离心机预冷至 4°C，沉淀完成后在 4°C 下以最大转速离心至少 15 分钟。
  11. 离心后，离心管底部应可见棕色沉淀。小心且彻底地移除上清液，加入 150 μL 预冷至 -20°C 的 70% RNA 级乙醇。在 4°C 下以最大转速离心 5 分钟。
  12. 彻底移除上清液，在 Eppendorf Vacufuge Plus 中短暂干燥（1–2 分钟），将此时呈白色的沉淀溶解于 12 μL DEPC 水中。使用 Nanodrop 2000c 分光光度计（Thermo Scientific）测定 mRNA 产量。

4. 卵母细胞的移除

  1. 本方案已获得WPI机构动物护理与使用委员会的批准。
  2. 手术前，应使青蛙禁食12小时，以防止手术过程中发生呕吐。
  3. 配制0.5–3.0 g MS-222溶于水的溶液，加入碳酸氢钠调节溶液pH至7.0–8.0。MS-222用于手术过程中对青蛙进行麻醉。操作MS-222时必须始终佩戴腈手套，并在化学通风橱中配制溶液。
  4. 将青蛙浸入 MS-222 溶液中，直至其失去翻正反射和脚趾夹捏反射。为检测无反应性，可夹捏青蛙的脚趾进行检查。
  5. 将青蛙背侧朝上放置在湿润的尿垫吸水面上，以避免损伤青蛙的皮肤。手术全程应始终保持青蛙湿润，需将湿润的纸巾置于青蛙附近。若青蛙眼睛张开，须用生理盐水润湿其眼部。若青蛙出现苏醒迹象，应将麻醉液滴加于青蛙体表，并等待其失去反应。继续操作前需再次进行足趾夹捏测试。
  6. 在青蛙中线左侧或右侧做一个小的体腔切口。后续手术应交替选择切口侧。
  7. 将卵巢移至蛙体外并摘除卵巢。避免卵巢接触蛙的皮肤。若出现出血，用无菌棉签按压止血，直至出血停止。
  8. 使用3.0-4.0 Ethicon Vicryl缝线材料（Johnson & Johnson）。缝合时，使用外科器械逐个打结，避免触碰蛙的皮肤。同时，须分别缝合体腔膜和皮肤层。此操作符合美国国立卫生研究院（NIH）关于卵和卵母细胞采集的 Xenopus laevis （参见： http://oacu.od.nih.gov/arac/XenopusOocyte_101007_Fnl.pdf).
  9. 手术后，青蛙至少需休养两个月才能再次接受手术。同时还应评估青蛙的健康状况，以确定其是否适合接受后续手术。每只青蛙最多可进行6次手术，共6次th 手术为终末性操作。

5. 卵母细胞去卵丘及 mRNA 显微注射

  1. 用剪刀将分离的卵巢叶切成较小的部分。将组织块转移至含胶原酶的任氏液 + Ca2+ 中（8.6 g/L NaCl、0.3 g/L KCl 和 0.33 g/L CaCl2）。
  2. 在 18°C 下轻轻振荡消化液 2 小时。若大部分卵母细胞已分离，则用任氏液 – Ca2+（8.6 g/L NaCl 和 0.3 g/L KCl）洗涤卵母细胞，并在任氏液 – Ca2+ 中孵育 10 分钟。
  3. 将卵母细胞转移至任氏液 + Ca2+ 中。
  4. 使用 Nanoject II Auto-Nanoliter Injector（Drummond）和 3.5" Drummond 毛细管，向卵母细胞注射 25 ng mRNA，终体积为 50 nL。注意：mRNA 的注射量根据目标蛋白的不同而有所变化。
  5. 注射后，在 18°C 避光条件下，将卵母细胞孵育 3–7 天，孵育液为任氏液（90 mM NaCl、2 mM KCl、5 mM MOPS、2 mM CaCl2，pH 7.4）并添加 1 mg/mL 庆大霉素8。

6. 位点特异性荧光标记

  1. 测量前，将卵母细胞在加载缓冲液（110 mM NaCl、2.5 mM 柠檬酸钠和 10 mM MOPS/Tris，pH 7.4）中孵育 45 分钟，随后在后加载缓冲液（100 mM NaCl、1 mM CaCl2、5 mM BaCl2、5 mM NiCl2 和 10 mM MOPS/Tris，pH 7.4）中孵育 45 分钟，以提高细胞内 Na+ 浓度14。
  2. 进行荧光检测时，将卵母细胞在含有 5 μM 所需荧光探针的后加载缓冲液中孵育 5–10 分钟（例如四甲基罗丹明-6-马来酰亚胺（TMRM）或荧光素-5-马来酰亚胺（FM））。荧光标记后，用不含染料的后加载缓冲液彻底清洗卵母细胞3。

7. 电生理学

  1. 使用微电极拉制仪（Model PC-10, Narishige）拉制硼硅酸盐毛细管（1B150F-4, World Precision Instruments）制备微电极。用 3 M KCl 溶液填充电极，并检测其电阻，电阻值应在 0.5–1.5 MΩ15 之间。
  2. 为进行半胱氨酸扫描实验，将荧光显微镜（Carl Zeiss, Axio Examiner 荧光显微镜）配备 535DF50 激发滤光片、565 EFLP 发射滤光片以及 570DRLP 二向色镜（Omega Optical）。
  3. 将卵母细胞置于 RC-10 腔室（Warner Instruments）中，并将其放置于荧光显微镜载物台上，轻轻将制备好的电极插入卵母细胞内。使用 Turbo Tec-05X 放大器（NPI Electronics）将膜电位钳制在恒定值，并在溶液交换或改变膜电位后测量跨膜离子流。进行同步荧光检测时，采用 100 W 钨灯光源激发供体荧光团，并使用 PIN-022A 光电二极管（United Detector Technologies）检测荧光强度的变化。放大器和光电二极管均通过 Digidata 1440A 数据采集系统（Axon Instruments）与装有 pCLAMP10 软件（Axon Instruments）的计算机连接，用于数据采集与记录。
  4. 在半胱氨酸扫描实验中，使用由 pCLAMP 10 软件（Molecular Devices）控制的电压阶跃，在稳态电流条件下测量荧光强度的变化。根据目标膜蛋白的不同，设计相应的细胞外溶液以维持稳态电流。
  5. 将荧光强度的变化与靶向蛋白的功能测量结果进行关联分析。

8. 各向异性测量与距离约束的确定。

  1. 各向异性测量应与距离测量同时进行8 计算κ的范围2 各向异性值。各向异性测量由于荧光团旋转而引起的相对移动性16使用偏振滤光片（Linos Photonics Inc.），在溶液交换条件下，以偏振光激发目标氨基酸残基处的 FM 或 TMRM，测量其发射的平行光和垂直光。8 并保持恒定的膜电位以测定荧光探针的迁移率。
  2. 各向异性由 r = (I||- I⊥)/(I|| + 2I⊥）我在那里|| 是平行光 发射的，且我⊥ 是垂直方向发射的光16. 为了计算距离测量中的误差，κ2最大值 = 2/3(1 + Frd + Fra + 3Frd * Fra) 和 κ2分钟 = 2/3(1-(Frd + Fra)/2 其中 Frd = (rd/ro)0.5 和 Fra = (ra/ro)0.5；ra TMRM的各向异性，rd FM的各向异性，以及ro 每种荧光基团的基本各向异性8.
  3. 为测量距离限制，使用具有两个可接近的细胞外半胱氨酸残基的全酶。由于在测量过程中卵母细胞将维持在恒定的膜电位，因而距离保持恒定，因此荧光变化无需依赖于蛋白质的构象状态。将卵母细胞孵育于含有加载后缓冲液中 1 μM FM（受体荧光团）和 4 μM TMRM（供体荧光染料）在冰上避光孵育30分钟，或仅 1 μM FM。这使得能够对带有或不带受体荧光团标记的全酶进行测量8配备475DF40激发滤光片、530DF30发射滤光片和505DRLP二向色镜的显微镜。
  4. 测量在有或无受体荧光团存在时供体荧光漂白的时间依赖性。在进行这些时间过程测量期间，溶液应持续流动；否则，可能会观察到由热量引起的随时间推移荧光增强现象。有和无受体荧光团条件下的光破坏差异可用于计算两个残基之间的距离。仅含有供体荧光团的全酶其光破坏速率快于含有受体荧光团的全酶。当供体与受体荧光团彼此靠近时，同时含有供体和受体荧光团的全酶将表现出较慢的光破坏速率。8.
  5. 使用 pClamp10 中的 Clampex 功能，对至少四个卵母细胞记录的供体荧光团光破坏结果进行平均。
  6. 结果取平均值后，使用指数函数（单指数、双指数）拟合最佳曲线。该最佳拟合曲线可用于确定在有或无受体存在条件下，供体荧光团光解的时间常数。
  7. 根据公式 E = 1-Γ 确定能量传递的效率DA/ΓD17，其中 GDA 表示供体/受体荧光团对的时间常数，ΓD 仅指供体荧光团的时间常数。
  8. 使用 Förster 方程17，E = 1/(1+R6/o6），可确定标记的半胱氨酸残基之间的距离； E 是 FRET 效率，R 是供体与受体荧光团之间的距离，而 Ro 是供体与受体配对的50%效率距离17. Ro 由公式 R 决定o = (9.7×103 JΦDn-4 κ2)，其中 J 为供体发射光谱与受体吸收光谱的归一化重叠，ΦD 是无受体荧光团时供体发射的量子产率，n 为折射率，κ2 是偶极-偶极相互作用的取向因子8.

9. 蛋白质亚基的相对运动

  1. 使用带有双半胱氨酸结构的构建体，并用供体和受体荧光染料进行标记。在这些实验中，将测量两个半胱氨酸残基之间的距离变化。由于此原因，每个残基标记后的荧光强度应独立于蛋白质的构象状态8。因此，任何荧光共振能量转移的变化都将源于供体与受体荧光染料之间距离的改变。
  2. 在显微镜上配备475AF40激发滤光片、595AF60发射滤光片和505DRLP二向色镜。在这些实验中，激发供体荧光染料并检测受体荧光染料的荧光信号。采用适当的方法（电压、配体或溶液交换）激活膜蛋白，同时测量荧光强度的变化。荧光强度的增加表明两个荧光染料以及对应的两个残基正在相互靠近；荧光强度的降低表明两个荧光染料以及对应的两个残基正在远离；最后，若荧光强度无变化，则表明在蛋白质构象改变时，两个荧光染料以及对应的两个残基之间的距离保持不变。

10. 代表性结果

利用特异性荧光染料标记细胞外的半胱氨酸残基，可研究膜蛋白在构象变化过程中的运动。图1显示了一个典型的电压钳荧光记录曲线。在溶液交换（上部曲线）引起蛋白质构象变化后，荧光强度的变化（下部曲线）反映了荧光染料从更亲水环境向更疏水环境，或从更易受水淬灭环境向较不易受水淬灭环境的移动。

该技术可进一步用于确定两个残基之间的距离限制。此类实验结果如图2所示。 在存在受体荧光团（红色）的情况下，光漂白速率比无受体荧光团时（黑色）更慢。光漂白速率与两个荧光团之间的距离直接相关，符合福斯特方程17。此类结果可与蛋白质的不同构象状态相关联，该关联性已通过同步进行的双电极电压钳实验得到验证。

钾离子和哇巴因作用下的电生理实验图；测量电流及随时间变化的荧光强度。
图 1. 离子转运及荧光强度变化的代表性记录。上方，在含 Na+ 测试液和含 K+ 测试液中分别进行电流钳测量，并分别加入 10 μM 和 10 mM 哇巴因；下方，与电流钳测量同步记录的荧光强度变化3,8,19。

红细胞的荧光显微镜图像；膜蛋白分布；光学分析。
图 2. 光漂白的时间依赖性。在无（黑色）和有（红色）受体荧光团的情况下测量供体光破坏。每条曲线为 4 个卵母细胞记录的平均值。

讨论

我们所描述的实验方法结合了位点特异性荧光团标记和双电极电压钳技术，用于研究膜蛋白结构与功能之间的关系。该技术可用于获取离子转运过程中膜蛋白构象动力学的时间分辨信息。此外，该方法可针对多种蛋白进行优化，例如离子泵、离子通道和转运蛋白。

除了研究特定残基的构象动态外，还可以利用荧光共振能量转移来确定全酶内部的距离限制。测定残基之间的距离以及测量亚基之间的相对运动，有助于解答涉及门控机制的关键问题。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
100W 钨灯光源Carl Zeiss, Inc.
1B150F-4World Precision Instruments, Inc.
3.0-4.0 Ethicon VicrylJohnson & Johnson
475AF40 激发滤光片Omega Optical
505DRLP 二向色镜Omega Optical
Macherey-NagelOmega Optical
535DF50 激发滤光片Omega Optical
560DRLP 二向色镜Omega Optical
565ALP 发射滤光片Omega Optical
565EFLP 发射滤光片Omega Optical
570DRLP 二向色镜Omega Optical
Linos Phtonics Inc.Omega Optical
Axio Examiner 荧光显微镜Carl Zeiss, Inc.
Warner InstrumentsLife Technologies
Digidata 1440A 数据采集系统Axon Instruments
Dpn INew England Biolabs
荧光素-5-马来酰亚胺Invitrogen
High-Pure PCR 提取试剂盒Roche Group
mMessage mMachine 体外转录试剂盒Ambion
MS-222Sigma-Aldrich
Nucleospin 质粒提取试剂盒Macherey-Nagel
Nanodrop 2000c 分光光度计Thermo Fisher Scientific, Inc.
PC-10 微电极拉制仪Narishige International
pCLAMP 10 软件Axon Instruments
PfuTurbo DNA 聚合酶Stratagene, Agilent Technologies
PIN-022A 光电二极管United Detector Technologies
偏振滤光片Linos Phtonics Inc.
QuickChange 定点突变试剂盒Stratagene, Agilent Technologies
RC-10 荧光成像室Warner Instruments
四甲基罗丹明-6-马来酰亚胺Invitrogen
TOP10 电转感受态细胞Invitrogen
Turbo Tec-05X 放大器npi electronic

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