本文展示了如何利用邻近连接技术（PLA），结合特异性抗体来可视化固定细胞中骨形态发生蛋白（BMP）信号通路。该技术使我们能够追踪内源性BMP激活的效应复合物在细胞核中的累积，并在BMP4刺激条件下随时间定量其表达水平。
本文内容
摘要
摘要
骨形态发生蛋白（BMP）负责多种发育和生物学效应。BMP受体可激活（磷酸化）Smad1/5/8效应分子，后者随后与Smad4形成复合物并转位至细胞核，在核内作为转录因子启动BMP特异性的下游效应1。传统的免疫荧光技术使用针对磷酸化Smad肽段的抗体，但其灵敏度低、背景信号高，且仅能进行粗略的定量，因其依赖于抗体信号的强度，尤其是当该信号为光敏性荧光时。此外，并非所有磷酸化的Smad分子都与Smad4形成复合物并参与活性转录。
原位 PLA 是一种能够以高特异性和高灵敏度检测蛋白质相互作用的技术2-4。该新技术将抗体识别与蛋白质的DNA替代物扩增相结合，能够在空间上精确定位并以点状信号的形式显示识别事件的确切位置。这些信号的数量可被计数和比较，从而提供定量测量结果。我们采用 Duolink 试剂盒进行原位 PLA 实验，联合使用一组抗体，仅在 BMP 信号效应分子磷酸化 Smad1/5/8 与 Smad4 相互靠近（即形成复合物）时才能检测到信号，而这种情况仅在信号通路激活时发生。这使得我们首次能够在 BMP4 刺激下的时间序列实验中，以高特异性和高灵敏度对内源性 BMP 信号进行可视化和定量检测。
方案
1. 细胞铺板及BMP处理
- 在GMEM培养基中培养Neuro2a细胞，培养基中添加10% FBS、1×非必需氨基酸（NEAM）、1×丙酮酸钠和1×L-谷氨酰胺。用胰蛋白酶（0.05%-EDTA）消化细胞，以每孔15,000–20,000个细胞的密度接种于16孔板中。
在DMEM培养基中培养HEK293T或Cos7细胞，培养基中添加10% FBS、1×L-谷氨酰胺和1×青霉素/链霉素。将多聚赖氨酸载玻片浸入70%乙醇中进行灭菌，并用ImmEdge笔划出1 cm2的孔区。用胰蛋白酶（0.05%-EDTA）消化细胞，以每孔20,000–25,000个细胞的密度在50 μl培养基中接种。 - 将细胞置于37°C、含5% CO2的湿润培养箱中孵育。
- 24小时后，将Neuro2a细胞的培养基更换为无血清GMEM（添加0.1%白蛋白、1×NEAM、1×丙酮酸钠和1×L-谷氨酰胺），HEK293T/Cos7细胞则更换为无血清DMEM（添加L-谷氨酰胺和1×青霉素/链霉素），继续孵育2–3小时。保留三孔细胞在正常培养条件（即含10% FBS）下作为对照。
- 用dorsomorphin（BMP通路抑制剂，2 μM）或BMP4（25 ng/ml）处理细胞，处理时间为所需时长（例如10分钟至1小时）5。
2. 固定与通透处理
- 配制固定液，4% PFA。称取4 g PFA，溶于100 ml PBS中，配制成4%溶液。在50°C下加热至溶液澄清。用0.22 μm滤膜过滤后，于4°C保存备用。使用新鲜配制的固定液（存放不超过2天）。
- 吸去孔板中的培养基，用1×PBS洗涤。切勿将溶液直接吹打到细胞上，以免导致细胞脱落。在进行下一步操作前，若使用的是腔室载玻片，需移除腔室，但保留孔周围的硅胶圈。
- 加入50 μl 4% PFA，在室温下静置孵育10分钟。
- 在Coplin染色缸中，用PBS在室温下振荡洗涤细胞，每次5分钟，共洗3次。
- 用含0.5% Triton X-100的PBS溶液在室温下静置处理细胞10分钟。
- 在Coplin染色缸中，用含0.05% Tween 20的TBS缓冲液（TBS-T）在室温下振荡洗涤细胞，每次5分钟，共洗3次。
3. 封闭
- 轻敲去除 TBS-T。每个孔加入一滴 Duolink II 封闭液（1x）。
- 将玻片置于预热的湿盒中，在 37°C 下孵育 1 小时。
4. 一抗
- 在Duolink II抗体稀释液（1x）中，将a-P-Smad1/5/8（兔多克隆抗体）按1:100稀释，a-Smad4（鼠单克隆抗体）按1:100稀释。同时分别配制相同浓度的a-P-Smad1/5/8和a-Smad4单独抗体溶液，用于对照实验。
- 从载玻片上轻轻吸去封闭液。尽可能去除封闭液，但在加入抗体前需特别注意避免细胞干燥。向各孔中加入40 μl抗体溶液。其中一个孔仅加入抗体稀释液，作为额外的阴性对照。
5. PLA探针
- 用抗体稀释液将两种PLA探针（Duolink II anti-Mouse MINUS和Duolink II anti-Rabbit PLUS）按1:5比例稀释。
- 从载玻片上轻轻吸去一抗溶液。在Coplin染色缸中用1× Duolink II洗涤缓冲液A于室温振荡洗涤2次，每次5分钟。
- 从载玻片上吸去洗涤缓冲液A，加入PLA探针溶液（40 μl/孔）。
将载玻片置于预热的湿盒中，于37°C孵育1小时。
6. 连接
- 将 Duolink II 连接反应原液（5 倍浓度）涡旋混匀，并用高纯度水按 1:5 比例稀释并混合。在计算加水量时，需考虑后续在加入孔板前以 1:40 的终浓度添加的连接酶所占体积。
- 从载玻片上弃去 PLA 探针溶液。在 Coplin 染色缸中，用 1× 洗涤缓冲液 A 室温振荡洗涤载玻片，每次 5 分钟，共洗两次。
- 使用冷冻金属块（-20°C）从冰箱中取出连接酶。按 1:40 的比例将连接酶加入连接反应液（步骤 6.1 中配制）中，涡旋混匀。
- 弃去载玻片上的洗涤缓冲液 A，每孔加入 40 μl 连接-连接酶混合液。将载玻片置于预热的湿盒中，37°C 孵育 30 分钟。
7. 扩增
注意：试剂对光敏感。请将载玻片避光保存。
- 将Duolink II Amplification原液（5倍浓度）用高纯度水按1:5比例稀释并混匀。在计算加水量时，需考虑即将在混合液加入孔板前以1:80终浓度加入的聚合酶（Polymerase）所占体积。
- 从载玻片上弃去连接反应-连接酶（Ligation-Ligase）溶液。在室温下，于Coplin瓶中用1× Wash Buffer A缓冲液振荡洗涤载玻片，每次2分钟，共洗两次。
- 使用冷冻块（-20°C）从冰箱中取出聚合酶（Polymerase）。将其按1:80比例加入至Amplification溶液（步骤7.1中配制）中，随后涡旋混匀。
- 弃去载玻片上的Wash Buffer A缓冲液，向每孔加入Amplification-Polymerase溶液（40 μl/孔）。将载玻片置于预热的湿盒中，在37°C下孵育100分钟。
8. 成像前准备
注意：试剂对光敏感。请将载玻片避光保存。
- 轻轻敲击载玻片，去除扩增-聚合酶溶液，然后在室温下于Coplin瓶中用1×Duolink II洗涤缓冲液B振荡洗涤2次，每次10分钟。
- 将载玻片浸入0.1×洗涤缓冲液B中。
- 完全去除16孔载玻片上的硅胶垫。在盖玻片上加入约40μl含DAPI的Duolink II封片剂，轻轻覆盖于样本上，稍加按压以避免盖玻片下产生气泡。用指甲油将盖玻片固定并密封在载玻片上。成像前至少等待15分钟。
- 使用共聚焦或荧光显微镜分析样本，获取数字图像。
9. 定量分析
注意：试剂对光敏感。请将载玻片避光保存。
- 使用 Duolink ImageTool 对图像上的信号进行计数，以获得信号水平的测量值。
- 比较测量结果并绘制图表。
10. 代表性结果
来自一个的結果 原位 PLA 实验显示为离散的荧光点。信号的位置取决于所研究的特定蛋白质。
图1. 原位 BMP4刺激后Neuro2a细胞中的PLA检测。细胞经BMP4处理后 2 μM 使用dorsomorphin（BMP通路抑制剂）(A) 或25 ng/ml BMP4 (B) 处理60分钟，或不作处理 (C-E)。在A和B中使用抗P-Smad1/5/8和Smad4抗体检测活性复合物。单独使用一抗a-P-Smad1/5/8 (C)、单独使用一抗a-Smad4 (D) 或省略一抗 (E) 作为对照。蓝色：DAPI；红色：PLA信号。图像由Leica SP5共聚焦显微镜获取。
（F）使用Duolink ImageTool软件对PLA信号进行计数，并在图中显示每个细胞核内平均信号点数量。（G）Neuro2a细胞未经处理或用Dorsomorphin（2 μM）或BMP4（25 ng/ml）处理60分钟。收集细胞裂解液，蛋白经SDS-PAGE分离后，用α-P-Smad1/5/8抗体进行免疫印迹分析，α-PCNA作为上样对照。(*) 非特异性条带。请注意，α-P-Smad1/5/8抗体无法区分与Smad4形成复合物的三种不同蛋白。
讨论
蛋白质复合物的可视化 原位 在信号传导研究中，蛋白质相互作用和蛋白质修饰是细胞将信号从表面传递到细胞核的手段，因此对这类研究的需求很大。然而，目前尚无法对两种内源性蛋白质之间的复合物进行可视化和定量分析。 原位 此前使用免疫荧光技术进行抗体共定位存在分辨率低的问题，无法用于观察真实的分子相互作用。PLA 是一种新兴技术，研究人员已在多种体系中成功应用该方法。 6, 7在此，我们展示了如何利用邻近连接实验（PLA）不仅可视化，而且定量分析在BMP刺激后随时间变化的Smad效应分子内源性复合物的形成。我们使用了包括Neuro2a在内的多种组织培养细胞，并采用来自不同物种的商业化抗体（小鼠抗Smad4抗体和兔抗P-Smad1/5/8抗体）来实现该目的（图1）。该方法使我们首次能够观察BMP效应复合物随时间的激活过程，而不仅仅是检测Smad1/5/8的磷酸化状态，因为并非所有磷酸化的Smad1/5/8都与Smad4形成有活性的复合物。我们对信号进行了计数（图1F），并将结果与相同细胞的免疫印迹定量分析结果进行比较。 8 （图1G）。我们得出结论：斑点数量能够准确地提供随时间变化的信号水平的比较测量结果。该技术也应用于其他细胞系（HEK293T和Cos7），结果相似（数据未显示）。
该技术的原理基于Duolink试剂盒提供的两种独特探针。每种PLA探针由一种偶联了独特合成寡核苷酸的二抗组成，该寡核苷酸作为报告分子。当两个探针彼此靠近时，可在其结合位点的精确位置发生DNA连接反应。只有当寡核苷酸之间的距离足够近（<40 nm）时，才能实现DNA杂交与连接，因此只有相互作用的蛋白质才可允许连接发生。连接后的DNA可通过扩增并利用标记的寡核苷酸对扩增序列进行杂交而被检测。该扩增过程具有特异性，因为它依赖于DNA-DNA杂交原理，同时具有高灵敏度，因为连接的DNA会被大幅扩增，从而增强初始的连接信号。扩增后的DNA通过与标记的寡核苷酸杂交进行检测，产生一个可见且相对较大的信号点。由于这些信号点可以被计数，PLA信号不仅提供了精确的空间信息（即相互作用事件的位置），还为定量分析这些事件提供了客观的方法2-4。
用于检测蛋白质相互作用的其他技术包括共免疫沉淀、免疫荧光和荧光共振能量转移（FRET）。共免疫沉淀实验被广泛使用，可用于分离蛋白质复合物。该方法通常伴随免疫印迹分析，这意味着蛋白质必须在相对较高的水平表达才能被检测到。在共免疫沉淀中，高背景信号或某些蛋白质与磁珠的非特异性结合问题有时难以克服。此外，共免疫沉淀实验能够检测可能属于蛋白质复合物的蛋白质，但无法区分那些在空间上非常接近并发生直接物理相互作用的蛋白质。此外，共免疫沉淀无法在单细胞分辨率下进行定量，也无法提供蛋白质复合物在细胞内定位的信息。通过免疫荧光检测细胞或细胞区室中蛋白质复合物的共存情况依赖于弥散信号的重叠，因此空间分辨率较低，无法准确提供蛋白质相互作用的信息。免疫荧光信号的定量只能在差异达到数倍时通过视觉估计完成，其准确性与可测量性无法与PLA信号点相比。FRET能够在活细胞中可视化蛋白质复合物，并避免对抗体和表位暴露的需求。然而，FRET通常依赖于人工融合蛋白的过表达，这可能无法真实反映内源性蛋白质复合物的情况，而PLA则无此局限。
PLA 实验方案中的封闭条件至关重要，因为抗体可能发生聚集并增加背景信号。替代的封闭条件可在抗体产品说明书中找到。通过省略一抗或二抗的适当对照实验，可以判断实验中可能出现的问题，因此这些对照必须始终包含在实验设计中。筛选不同抗体时，应选择单独使用时背景最低、联合使用时信号最强的抗体组合。细胞固定非常关键，过度固定可能导致蛋白复合物完全变性并降解，而固定不足则可能在实验步骤中导致蛋白复合物丢失。可通过降低固定剂浓度至 3% 或缩短固定时间来控制此问题。然而，固定条件还取决于一抗是否识别变性蛋白。由于 PLA 技术极为敏感，必须特别注意保持不同样本之间的孵育时间及微环境条件一致。
在最终步骤之前，任何情况下都不应让样品干燥。样品干燥可能导致背景信号增强。完全去除封闭液也至关重要，以避免产生背景。洗涤缓冲液在使用前应始终恢复至室温，因为低温会减缓酶促反应。如需进一步排除故障，请参阅试剂盒说明书。
使用染料有助于确定 PLA 信号的亚细胞定位（例如 DAPI、肌动蛋白等）。本实验中，我们使用了封片介质中的 DAPI 对细胞核进行染色。PLA 可与免疫荧光抗体联合使用，以鉴定细胞类型或细胞区室（本实验未展示）。通过计数信号并结合专用软件（Duolink Image Tool，Olink Bioscience），可实现准确的定量分析。
总之，我们已展示了如何使用 原位 PLA，使用Duolink试剂盒检测固定细胞中的BMP信号通路，并展示了其优势：操作简便、高度灵敏、无背景信号，以及能够定量检测活化的BMP信号通路 原位.
该技术应用于研究不同蛋白质相互作用的局限性取决于识别目标蛋白质的一抗的可获得性及其质量。
披露
本视频文章的制作由Olink公司赞助，该公司生产临近连接测定实验中所用的一种试剂。
致谢
本研究由英国医学研究理事会（MRC）和生物技术和生物科学研究所（BBSRC）基金资助。我们感谢乌普萨拉大学Ulf Landegren实验室的Agata Zieba和Katerina Pardalis在技术建立过程中提供的帮助和宝贵建议。感谢Olink Bioscience提供的技术支持和展示。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| GMEM | Invitrogen | 21710025 | |
| DMEM | Invitrogen | 21063029 | |
| FBS | AutogenBioclear | 7.01 | |
| 非必需氨基酸 | Invitrogen | 11149068 | |
| 丙酮酸钠 | Invitrogen | 11360070 | |
| 青霉素/链霉素 | Invitrogen | 15140122 | |
| L-谷氨酰胺 | Invitrogen | 25030-054 | |
| 含EDTA 4Na的0.05%（1X）胰蛋白酶，液体 | Invitrogen | 25300-054 | |
| 16孔板载玻片 | Lab-Tek | 178599 | |
| 多聚赖氨酸 | VWR international | 631-0107 | |
| 盖玻片 | VWR international | 631-0138 | |
| a-pSmad1/5/8 | Cell Signaling Technology | 9511 | |
| a-Smad4 (B8) | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-7966 | |
| dorsomorphin | Merck & Co., Inc. | 171260-10MG | |
| 重组小鼠BMP-4 | R&D Systems | 5020-BP-010 | |
| PFA | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| 吐温X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| 吐温-20 | Promega Corp. | H5151 | |
| Duolink II 检测试剂（橙色） | Olink Bioscience | 92007-0100 | |
| Duolink II PLA 探针 抗小鼠 MINUS | Olink Bioscience | 92004-0100 | |
| Duolink II PLA 探针 抗兔 PLUS | Olink Bioscience | 92002-0100 | |
| 含DAPI的Duolink II 封片剂 | Olink Bioscience | 82040-0005 | |
| Duolink II 荧光洗涤缓冲液 | Olink Bioscience | 82049 |
参考文献
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- Soderberg, O. Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation. Nat Methods. 3, 995-1000 (2006).
- Soderberg, O. Characterizing proteins and their interactions in cells and tissues using the in situ proximity ligation assay. Methods. 45, 227-232 (2008).
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