Medicago truncatula 复合植株的制备及其在结瘤实验中的应用

摘要

我们展示了如何利用毛状根复合植株在难以转化的物种Medicago truncatula中研究植物与根瘤菌的相互作用及结瘤过程。

摘要

与根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）类似，发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenes）也可基于其自主的根诱导（Ri）质粒将外源DNA转入植物细胞。A. rhizogenes 能在植物组织上诱导产生毛状根，并在转化后形成嵌合植株。在这些嵌合植株中，部分再生的根为转基因根，携带野生型T-DNA和人工构建的双元载体；而地上部的茎叶仍为非转基因组织，可为植株提供能量和生长支持。这些毛状根嵌合植株不会产生转基因种子，但其具有多项重要特性，使其在植物研究中极具应用价值。首先，发根农杆菌具有广泛的宿主范围，能够转化多种植物物种，尤其是双子叶植物，从而可在多种物种中实现遗传改造。其次，A. rhizogenes 可直接侵染植物组织和外植体，获得嵌合植株无需在转化前进行组织培养，因此特别适用于难以转化的植物物种。此外，转基因根组织可在数周内获得。对于蒺藜苜蓿（Medicago truncatula），我们可在短短三周内获得转基因根，比常规的拟南芥花序浸染法更快。总体而言，毛状根嵌合植株技术是一种灵活且实用的工具，可用于研究基因功能及与根相关的表型。本文将演示如何利用毛状根嵌合植株研究难转化物种 M. truncatula 中的植物-根瘤菌互作及结瘤过程。

方案

以下方案已用于在一种豆科模式植物中生成毛状根复合植株 M. truncatula类似的实验方案已适用于至少八种植物物种 ^1-4我们使用了 M. truncatula 毛状根复合植株用于研究根和根瘤发育中的基因功能。该实验方案分为四个部分：1）植物材料的准备；2）毛状根复合植株的构建；3）共生 根瘤菌 感染；以及4）转基因根系鉴定。我们使用了含有双元载体的 绿色荧光蛋白 (gfp)基因作为报告基因用于复合植株中转基因根系的筛选 ³与基于抗生素的筛选相比，基于GFP的筛选快速、简便且成本低廉。在我们的载体中，内质网表达优化的 gfp 该基因由超级泛素启动子驱动，在转基因根中产生强烈的组成型GFP信号，便于区分转基因根与非转基因根。

1. 准备植物材料

1. 从温室种植的植株（50% 相对湿度，16/8 小时光照/黑暗，22/18°C 昼/夜温度）中收获 M. truncautla 种子。成熟种子可在 4°C 下保存。
2. 约 100 粒种子在 10 ml 浓硫酸（95–98%，Sigma-Aldrich，MO）中进行刻蚀处理，持续 10 分钟，并定期轻轻摇动。
3. 用无菌水轻轻振荡冲洗种子 5–7 次。
4. 将种子在室温水中浸泡 6 小时，随后置于 4°C 环境中 36–48 小时，以同步萌发。
5. 将约 20–30 粒种子均匀铺在培养皿中湿润的滤纸上，在 22°C、16/8 小时光照/黑暗周期、光照强度为 40 μmol·m^-2·s^-1 的条件下培养 5–6 天。
6. 将已萌发的幼苗移栽至土壤中，并在温室中继续培养一个月。

2. 生成毛状根复合植株

1. 使用标准方法将携带目的基因的双元载体转化至A. rhizogenes中。我们构建了一系列含有gfp基因作为标记的双元载体，便于转基因组织的筛选。这些载体包含多种启动子，并均具有Gateway克隆位点（Invitrogen, Carlsbad, CA），可用于目的基因的过表达或沉默^3,5。
2. A. rhizogenes在50 ml LB培养基中于28°C条件下培养16–24小时，培养基中需添加适当的抗生素进行筛选。
3. 收集菌体并重悬于无氮植物营养液（表1及⁶）中，调整菌液浓度至OD₆₀₀=0.3。
4. 为支持毛状根再生，将灭菌的支撑基质（“岩棉”，Hummert International, Earth City, MO）切成约3 cm³的立方体。每个培养皿中放置4个这样的小块。
5. 用移液器吸头在每个小块顶部打孔，以便插入外植体。每个小块中加入5 mL A. rhizogenes菌液。
6. 通过斜切方式切取带有2–3个腋芽的茎段作为外植体。将外植体插入小块中，在22°C下培养约三周。前10天不给Medicago外植体浇水，之后根据需要每次添加5 ml无氮营养液。我们发现去除顶端分生组织可能会减少不定根的形成。

3. 共生根瘤菌（Sinorhizobium meliloti）侵染

1. 三周后，一些不定根将从岩棉中长出。将毛状根复合植株转移至沙子或蛭石（已灭菌）中，可保留或不保留岩棉。植株在温室中于22℃条件下培养°摄氏度，16/8小时光照/黑暗循环，且300 μmol·m⁻¹^-2。^-1 再持续光照强度一周。
2. 在根瘤菌感染之前， S. meliloti 1201 在 30℃ 下于 50 ml 酵母提取物-甘露醇培养基中培养 7 天 °C（表2，以及 ^6,7).
3. 重新悬浮的根瘤菌细胞稀释至终浓度为OD₆₀₀使用无氮营养液，其值为0.08。取10 ml新鲜悬浮液S. meliloti 每个复合植株均施加处理以诱导根瘤形成。

4. 转基因根鉴定

1. 接种根瘤菌两周后，通过水洗将复合植株挖出。在水中可轻松将根系与沙子或珍珠岩分离。
2. 我们将毛状根置于紫外显微镜下观察（Nikon SMZ1500，激发光 460-500 nm，二向色镜 505 nm，阻断滤光片大于 510 nm）。转基因根呈 GFP 阳性，而不定根呈 GFP 阴性。随后根据 GFP 信号收集根系，统计根瘤数量，测量根长，并计算侧根密度。GFP 阴性根作为对照使用。

5. 代表性结果

在我们的实验中，外植体在接种A. rhizogenes后2-3周内长出新的毛状根。在紫外显微镜下，携带gfp基因的转基因根表现出强烈的绿色荧光（图1）。再生根的数量以及GFP阳性根的比例取决于外植体的状态和复合植株的生长环境。平均而言，所产生的根中有25%为转基因毛状根³。为提高转化效率，需注意以下两点：1）如视频所示，使用塑料罩足以在最初几天内维持培养托盘内的湿度，植株在最初几天需水量极少，过度浇水不利于毛状根的形成；2）农杆菌（Agrobacterium）接种液的浓度对转化效果至关重要，菌体数量过多不利于毛状根或根瘤的形成。对于根瘤的形成，浇灌溶液必须不含氮，否则将极少形成根瘤。

可以通过子叶或完整幼苗作为起始材料来获得毛状根复合植株。利用其他组织产生毛状根仅需对上述方案进行少量修改⁸。重要的是，每条毛状根均为一次独立的转化事件。因此，在单个复合植株中观察到的表型是多个转化事件共同作用的结果，需通过在多个复合植株中重复实验来加以验证。

图1. A. 可从毛状根中筛选出转基因根。B. 毛状根复合植株中形成了根瘤。 我们将4周龄的M. truncatula毛状根植株置于紫外显微镜下，可轻松识别出GFP阳性根。（红色箭头：GFP根；黄色箭头：非GFP根）

储备液	g/200ml	每升培养基添加储备液体积（ml）
MgSO4.7H2O	12.3	2
CaCl2.2H2O	14.7	4
K2HPO4.3H2O	6.8	1
K2SO4	11	4
FeCl3.6H2O	0.49	2.5
微量元素	见下文	1

微量元素	克/升
H3BO3	0.142
MnSO4.H2O	0.077
ZnSO4.7H2O	0.1725
CuSO4.5H2O	0.037
NaMoO4. H2O	0.024
CoCl2. H2O	0.0025
NiSO4	0.001

表1. 无氮营养液

K2HPO4	0.5g
NaCl	0.1g
MgSO4·7H2O	0.2g
酵母提取物	0.4g
甘露醇	10g
pH=6.8

表2. 酵母提取物甘露醇培养基（每升）

讨论

产生毛状根复合植株是一种快速简便的方法，可用于获得大量双子叶植物的转基因材料。尽管该方法不能产生转基因种子，但可在数周内获得转基因材料。该方法特别适用于难以建立组织培养体系或获得稳定转化植株的植物。多年来，我们已利用该技术研究基因功能、启动子功能、微小RNA、主根及侧根发育、防御反应与非生物胁迫响应、结瘤及其他共生过程、激素响应、代谢谱分析、基因表达谱分析、蛋白质组学分析以及其他生物学过程。该实验方案稳定且可重复。