双分子荧光互补

Summary

在确定的时空调控细胞信号蛋白质的亚细胞定位是很重要的。在这里，我们描述了一个简单的方法监测在细胞内的蛋白质的空间相互作用的双分子荧光互补（附设）。

Abstract

定义必须了解复杂的输出信号复合物的亚细胞分布。 常规方法，如免疫复合物的空间定位的信息不提供。相比之下，附设显示器的相互作用和细胞内的蛋白质复合物的条块分割。在此方法中，fluororescent蛋白质氨基和羧基端的非荧光片段，这两种蛋白质的利益，然后融合到分成。重组的荧光（图^1）1,2的蛋白质结果的相互作用。附设的一个限制是，一旦重组分散的荧光基团是复杂的，是不可逆转^的 3 。这种限制是在检测的瞬态或弱相互作用是有利的，但排除了复杂的动态的动力学分析。另外一个需要注意的是，重组后的flourophore需要30分钟，以成熟和荧光，再次解除观察实时交互^4。附设的蛋白质片段互补法（PCA）的记者的蛋白质，如绿色荧光蛋白变异（附设），二氢叶酸还原酶，B -内酰胺酶和荧光素酶蛋白质员工具体的例子: ^蛋白质相互作用5,6。替代的方法来研究蛋白质在细胞中的蛋白质相互作用，包括荧光共定位和福斯特共振能量转移^（FRET）7 。合作的定位，两种蛋白质单独标签可以直接与间接免疫荧光基团或。然而，这种做法导致高背景的非相互作用的蛋白质，使其难以解释的合作本地化数据。此外，由于共聚焦显微镜分辨率的限制，两种蛋白质，可能会出现，而不必进行交互合作本地化。随着附设，荧光观察时，两种蛋白相互作用的利益。 FRET的是另一种优秀的方法研究蛋白质:蛋白质相互作用，但可以在技术上具有挑战性。 FRET实验要求供体和受体类似的亮度和在细胞内的化学计量。此外，必须考虑到受体通道，反之亦然通过捐助为出血。附设有不同的FRET，荧光图像数据的小背景，小的后处理，不需要很高的过度表达，并可以检测弱或短暂的相互作用。生物发光共振能量转移（BRET）是一个类似的担忧，除了捐助是一种酶（如荧光素酶）催化底物，从而令人兴奋的一个受体，成为发光的方法。 BRET没有流血通过技术问题和高背景荧光，但没有能力提供的空间信息，由于缺乏基板^{本地化的8个}具体的车厢。总体而言，附设是一个可视化的蛋白质复合体的亚细胞定位要进入隔离的信号洞察力的优秀方法。

Protocol

A.附设校准

1. 选择一个荧光基团 ，有多种荧光团，如YFP和金星，以及附设的融合伙伴（见表1）工作。金星的氨基和羧基端的两端都能够形成一个复杂的，在37 ° C，而YFP的附设片段需要在30 ° C预孵化，以便荧光基^团形成2。这在低温的潜伏期可能会改变一些细胞过程，并在选择的片段时，应考虑。融合金星蛋白质的羧基端向量Addgene （ http://www.addgene.org/pgvec1; seepBiFC VN173和pBiFC - VC155）伴随着额外的使用结构，作为对照， 例如， pBiFC bJunVN173 pBiFC - bFosVC155 ^2。额外的载体，包括氨基端的金星向量（PFLAG VN173和PHA - VC155），可在下列网站:http://people.pnhs.purdue.edu/〜 HU1 /。
2. 标签蛋白的利益。附设片段融合的候选蛋白的氨基或羧基端两端。一些蛋白质，可能不会允许破坏蛋白质....

Discussion

附设是优秀的可视化蛋白质的方法:在整个细胞中的蛋白质相互作用，并确定这些复合物的亚细胞定位。附设的优势，只有相互作用的蛋白质荧光，相互作用的瞬态稳定，成像数据的后处理是最小的。这种方法的缺点是复杂的荧光团的荧光和不可逆转的成熟时间。在一些应用程序可以使用这个不可逆转的优势。例如，一个可使用附设复杂的酶，酶的活化剂，导致构激活。然后确定哪些蛋白质招募这一复杂。此外，附设复杂不可逆转允许弱或瞬态相互作用的鉴定。附设实验的解释，适当的控制是重要的。空附设载体不应被用来作为对照组，这些在高背景荧光试剂。适当的控制，包括使用的利益，被称为块的两种蛋白质的相互作用的蛋白质发生突变。不应该复杂，与感兴趣的蛋白质也可能被用于一个不相关的蛋白质。同样重要的是，进行Western blot分析，以确保不同的结构表达的是平等和荧光信号的差异不是由于蛋白表达水平的不同。高表达，也可以导致非特异性的相互作用和荧光，因此表达水平应保持相对较低。

附设是一种切实可行的方法，很容易与其他荧光技术相结合。例如，附设可能与标准免疫荧光共定位研究三分子复合物结合，虽然这种方法仍然是受共聚焦显微镜分辨率的限制。最近的研究.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Cellgro	10-013
胎牛血清	Cellgro	35-011-CV
玻璃底微孔培养皿	Matek	P35G-1.5-14C
6 孔培养皿	Falcon BD	35-3846
Lipofectamine	Invitrogen	18324020
PBS	Cellgro	21-031-CV
多聚甲醛	Sigma-Aldrich	P6148
共聚焦显微镜	Carl Zeiss， Inc.	LSM510 元