双分子荧光互补

摘要

蛋白质的亚细胞定位对于确定细胞信号传导的时间和空间调控至关重要。本文中，我们介绍双分子荧光互补（BiFC）技术，作为一种在细胞内监测蛋白质空间相互作用的简便方法。

摘要

明确信号复合物的亚细胞分布对于理解该复合物的功能输出至关重要。 传统的研究方法（如免疫共沉淀）无法提供复合物空间定位的信息。相比之下，双分子荧光互补技术（BiFC）能够监测蛋白质复合物的相互作用及其在亚细胞结构中的定位。该方法将一种荧光蛋白拆分为氨基端和羧基端两个无荧光的片段，并分别与两个目标蛋白融合表达。当目标蛋白发生相互作用时，荧光蛋白片段得以重新组装，恢复荧光信号（图1）^1,2。BiFC的一个局限性在于，一旦荧光蛋白片段被重新构建，形成的复合物即不可逆³。这一特性有助于检测短暂或微弱的相互作用，但无法用于分析复合物动态变化的动力学过程。另一个需要注意的问题是，重新组装的荧光蛋白需要约30分钟才能成熟并发出荧光，因此同样无法实现实时相互作用的观测⁴。BiFC是蛋白质片段互补实验（PCA）的一个具体实例，PCA利用多种报告蛋白来检测蛋白质-蛋白质相互作用，包括绿色荧光蛋白变体（BiFC）、二氢叶酸还原酶、β-内酰胺酶和荧光素酶等^5,6。研究细胞内蛋白质-蛋白质相互作用的其他方法还包括荧光共定位和弗斯特共振能量转移（FRET）⁷。在共定位实验中，两种蛋白质可分别直接标记荧光基团，或通过间接免疫荧光进行标记。然而，这种方法容易产生非相互作用蛋白的高背景信号，导致共定位数据难以解释。此外，由于共聚焦显微镜分辨率的限制，两种蛋白质可能在图像上呈现共定位，但实际上并未发生相互作用。而在BiFC中，只有当两个目标蛋白发生相互作用时才会产生荧光信号。FRET是研究蛋白质-蛋白质相互作用的另一种优秀方法，但技术上具有较高挑战性。FRET实验要求供体和受体在细胞内的亮度和化学计量比相近，同时还必须校正供体信号渗漏至受体通道以及受体信号反向渗漏的问题。与FRET不同，BiFC具有背景荧光低、图像数据后处理少、无需高水平过表达、且能够检测微弱或瞬时相互作用等优势。生物发光共振能量转移（BRET）是一种类似于FRET的方法，区别在于其供体为一种酶（例如荧光素酶），可通过催化底物产生生物发光，从而激发受体。BRET避免了信号渗漏和高背景荧光的技术难题，但由于底物无法特异性地定位于特定亚细胞区域，因而难以提供空间定位信息⁸。总体而言，BiFC是一种优异的方法，可用于可视化蛋白质复合物的亚细胞定位，进而深入理解区室化信号转导机制。

方案

A. BiFC 校准

1. 选择一种荧光蛋白。 有多种荧光蛋白可用作双分子荧光互补（BiFC）的融合伴侣，例如YFP和Venus（见表1）。Venus的氨基端和羧基端能够在37°C下形成复合物，而YFP的BiFC片段则需要在30°C下预先孵育以促进荧光蛋白的形成²。这种低温孵育可能会影响某些细胞过程，在选择片段时应予以考虑。用于将Venus融合至目标蛋白羧基末端的载体可从Addgene获取（http://www.addgene.org/pgvec1；如pBiFC-VN173和pBiFC-VC155），同时还提供可用于对照的其他构建体，例如pBiFC-bJunVN173和pBiFC-bFosVC155²。其他载体，包括氨基端Venus载体（pFLAG-VN173和pHA-VC155），可在以下网站获得：http://people.pnhs.purdue.edu/~hu1/。
2. 标记目标蛋白。 BiFC片段可融合至候选蛋白的氨基端或....

讨论

双分子荧光互补（BiFC）是一种用于在完整细胞中可视化蛋白质-蛋白质相互作用并确定这些复合物亚细胞定位的优良方法。BiFC 的优势在于只有相互作用的蛋白质才会产生荧光，瞬时相互作用可被稳定，且成像数据的后期处理极少。该方法的两个缺点是荧光团成熟所需时间较长，以及荧光团复合物的不可逆性。在某些应用中，这种不可逆性反而可被利用为优势。例如，可将一种酶与其激活剂用于 BiFC 复合物中，从而实现持续性激活，进而确定哪些蛋白质被招募至该复合物。此外，BiFC 复合物的不可逆性有助于识别弱相互作用或瞬时相互作用。适当的对照对于 BiFC 实验结果的解读至关重要。不应使用空的 BiFC 载体作为对照，因为这些试剂会导致较高的背景荧光。合适的对照包括：使用已知可阻断两种蛋白质相互作用的目标蛋白中的突变体，或使用一种不应与目标蛋白形成复合物的无关蛋白。此外，必须进行蛋白质印迹（Western blot）分析，以确保不同构建体的表达水平相等，并排除荧光信号差异源于蛋白表达量不同的可能性。过高的表达水平可能导致非特异性相互作用和荧光信号，因此应将表达水平保持在相对较低的范围。

BiFC 是一种实用的.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
DMEM	Cellgro	10-013
胎牛血清	Cellgro	35-011-CV
玻璃底小培养皿	Matek	P35G-1.5-14C
6孔培养板	Falcon BD	35-3846
Lipofectamine	Invitrogen	18324020
PBS	Cellgro	21-031-CV
多聚甲醛	Sigma-Aldrich	P6148
共聚焦显微镜	Carl Zeiss, Inc.	LSM510 META