幼虫和成体中增强子捕获型Flippase表达的定位与应用 果蝇 中枢神经系统

摘要

我们描述了一种由翻转酶诱导的交叉Gal80/Gal4抑制（FINGR）方法，该方法利用组织特异性的FLP来决定Gal80的表达模式。在Gal4与FLP表达重叠的区域，Gal4的表达将被开启（Gal80被翻出）或关闭（Gal80被翻入）。FINGR方法在克隆分析和神经环路图谱绘制中具有广泛的适用性。

摘要

Gal4/UAS 双元系统在 Drosophila 的基因与神经环路操控中具有强大功能。然而，在大多数神经生物学研究中，Gal4 的表达通常难以达到足够的组织特异性，从而限制了神经环路与行为读数之间的精确关联。为克服这一主要障碍，我们近期开发了 FINGR 方法，以实现目标组织中更为严格的 Gal4 表达。FINGR 方法包含三个组成部分：1）传统的 Gal4/UAS 系统；2）一组由 FLP/FRT 介导的 Gal80 转换工具；3）增强子捕获型 FLP（ET-FLP）。Gal4 用于定义目标初级神经环路。将 Gal4 与 UAS 效应子（如 UAS-MJD78Q 或 UAS-Shi^ts）配对，可调控神经元活性，进而表现为果蝇行为的改变。通过额外引入 UAS 报告基因（如 UAS-GFP），可同时对参与特定行为的神经环路进行形态学分析的定位。对于表达范围较广的 Gal4 品系，可利用两种互补的 Gal80 转换工具来限制 Gal4 的表达：tub^P>Gal80>（“翻出”）和 tub^P>stop>Gal80（“翻入”）。最后，研究人员可借助组织特异性的 ET-FLP 分别开启或关闭 Gal80。在“翻入”模式中，Gal80 将在 Gal4 与 ET-FLP 表达重叠的区域抑制 Gal4 的表达；在“翻出”模式中，Gal80 将在 Gal4 与 FLP 表达重叠的细胞中解除对 Gal4 的抑制。这两种策略均可限制 Gal4 定义的神经环路中的细胞数量，但作用模式相反。FINGR 方法可兼容果蝇研究领域中已有的大量 Gal4 品系，适用于传统克隆分析及神经环路定位，具有高度通用性。在本方案中，我们展示了在选定的 ET-FLPx2 品系中 FLP 表达模式的定位，以及 FINGR 方法在光感受器细胞中的有效性。FINGR 方法的原理也应适用于其他使用 Gal4/UAS、Gal80 和 FLP/FRT 系统的遗传模式生物。

方案

1. Drosophila 品系

1. Gal4 驱动系：
   GMR-Gal4，可在感光细胞中表达 Gal4。
2. UAS 品系
   UAS-MJD78Q（或 UAS-polyQ），可在表达 Gal4 的细胞中引起神经退行性变。
   UAS-GFP，可在表达 Gal4 的细胞中表达 GFP。
3. FLP 品系
   ey-FLP，可在感光细胞及部分脑区中表达 FLP。
   ET-FLPx2 品系，为含有两个 FLP 拷贝的增强子捕获品系（FLP-IRES-FLP）。我们已构建了约 1,000 个 ET-FLP 品系（Bohm 等，2010），其表达模式尚未完全鉴定。本文描述了部分 ET-FLPx2 在果蝇幼虫及成虫中枢神经系统（CNS）中表达模式的鉴定方法。
4. FLP 报告系统
   yw, actin^P>CD2>Gal4; UAS-GFP（Pignoni & Zipursky, 1997），通过 FLP 介导的重组切除 >CD2，使 actin^P>Gal4; UAS-GFP 激活，从而报告 ET-FLPx2 的表达模式。
5. 两种互补的 Gal80 转换工具
   Tub^P>Gal80>（Gordon & Scott, 2009），即翻出型构建体，可在强微管蛋白启动子驱动下于所有组织中组成型表达 Gal80。当发生 FLP 介导的重组时，>Gal80 被切除，仅在表达 ET-FLPx2 的组织中终止 Gal80 的表达。
   Tub^P>stop>Gal80（Bohm 等，2010），即翻入型构建体，在正常情况下不表达 Gal80。仅在表达 ET-FLPx2 的组织中，FLP 切除 >stop 并插入 Gal80，从而启动微管蛋白启动子驱动的 Gal80 表达。
6. 用于检测复眼内 FLP 活性的果蝇品系
   GMR-Gal4, UAS-polyQ; tub^P>stop>Gal80（Bohm 等，2010），表现为眼睛退化且色素缺失。在表达 FLP 的感光细胞中，随着 Gal80 的翻入，polyQ 表达被关闭。
   GMR-Gal4, UAS-polyQ; tub^P>Gal80>（Bohm 等，2010），眼睛形态正常。在表达 FLP 的感光细胞中，随着 Gal80 的翻出，polyQ 表达被激活。

2. 试剂

磷酸盐缓冲液（PBS，1X），pH 7.4。
4% 多聚甲醛（PFA），用 PBS 将 16% PFA（电子显微镜科学公司，货号 #15710，Hatfield，PA）稀释而成
PBT，含 0.1% Triton-X 100 的 1X PBS（Sigma）
抗 Elav 抗体（单克隆抗体，9F8A9；美国爱荷华大学发育研究杂交瘤库），可标记果蝇中的所有神经元。
抗 Repo 抗体（单克隆抗体 8D12；美国爱荷华大学发育研究杂交瘤库），可标记果蝇中的胶质细胞。
Alexa 594 标记的山羊抗小鼠二抗（Invitrogen）

3. 绘制增强子捕获 FLPx2 品系表达模式（*关键步骤）

1. 从 yw、actin 中收集处女雌蝇^P>CD2>Gal4；UAS-GFP 品系与各个 ET-FLPx2 品系的雄性个体杂交。前者作为 ET-FLP 组织表达的 GFP 报告系统。
2. 解剖游走的3期幼虫_rd 一龄F1幼虫保留中枢神经系统（即脑和腹神经索，VNC）及体壁，置于冰上用4%多聚甲醛固定1小时，用预冷的PBS洗涤3次，再用PBT洗涤3次。
   解剖
   1. 去除游离的3^rd 一龄F1幼虫放入洁净的Sylgard培养皿中（35 mm × 10 mm培养皿，内含2克按说明书配制的Sylgard）。
      1. 用画笔清除食物残渣
   2. 用预冷的1×PBS填充培养皿，并将培养皿置于冰上以麻醉幼虫
   3. 用一对镊子夹住幼虫的口钩，用另一对镊子夹住前端气门延伸处附近的表皮，向后端方向剥离表皮。中枢神经系统将与口钩相连，并附着唾液腺、肠道及成虫盘一同被剥离。
   4. 去除中枢神经系统周围多余的组织和成虫盘。
   5. 将中枢神经系统（CNS）转移至盛有PBS的3孔Pyrex培养皿中。
      1. 可使用硅化处理的 P200 移液器吸头以避免组织干燥。
   6. 在冰上用 200 μl 的 4% PFA 固定 1 小时。
      1. 确保中枢神经系统完全浸没在PFA中。
         1. 如果中枢神经系统（CNS）漂浮，通常表明其周围组织未被彻底清除。
   7. 用预冷的PBS洗涤3次，随后用PBT洗涤3次。
3. 解剖成年F1代果蝇的中枢神经系统。
   1. 用 CO 麻醉果蝇₂ 或将装在空瓶中的果蝇置于冰上10分钟。
   2. 将成年果蝇放入盛有95% EtOH的玻璃培养皿中，置于冰上处理30秒。
   3. 将成年果蝇转移至盛有1×PBS的玻璃培养皿中，并置于冰上。
      1. 用预冷的1×PBS洗涤3次，以去除残留的EtOH
   4. 将一只果蝇放入盛有冰冻1×PBS的35 mm Sylgard培养皿中
   5. 将腹部腹面朝上，用一枚小型昆虫针（0.1 mm的minutiens针）从腹部中段插入。
      1. 用一对镊子夹住腿部基部，用另一对镊子将腿去除。
   6. 去除头部角质层
      1. 用一对镊子夹住喙的同时，将另一对镊子置于眼部下方，向头部背侧中线方向剥离角质层。
      2. 抓住另一只眼睛，去除另一侧剩余的角质层。
      3. 使用尖头镊子和/或 sharpened tungsten 针去除脑周围气管组织
         1. 气管清洁不当将导致强烈的自发荧光，干扰GFP表达，并使脑组织在固定过程中漂浮
   7. 腹神经索解剖
      1. 去除胸部角质层
         1. 从胸部后端开始，在两侧各放置一把镊子于第3节^rd 前胸腹板（即抓住后腿基部）。
         2. 轻轻将表皮从腹侧中线分离，重复此操作直至到达颈部基部。
         3. 轻轻分开胸部角质层的两半，暴露腹神经索（VNC）
      2. 接下来，将腹部从胸部移除。用一对镊子夹住胸部的第二对足基部以固定胸部，同时用另一对镊子夹住腹部第一节腹胸节附近，将腹部拉下。
      3. 去除围绕VNC的胸部组织。用一对镊子夹住肱部区域，再用另一对镊子轻轻撕除大部分胸部残余组织。
      4. 此时，颈椎周围应有一圈结缔组织。使用两把镊子将该组织环撕开。
      5. 去除围绕腹神经索的多余胸段组织
   8. 将脑和腹神经索转移至含有冰上预冷的1X PBS的9孔Pyrex培养皿中
      1. 可使用硅化处理的P200移液器吸头以避免组织干燥
4. 在冰上用4% PFA固定成年中枢神经系统1小时，用预冷的PBS洗涤3次，再用PBT洗涤3次。
5. 将成年中枢神经系统标本或幼虫中枢神经系统与体壁在4°C下用针对神经元（抗-Elav，1:10）或胶质细胞（抗-Repo，1:10）的一抗孵育过夜。用PBT洗涤标本5次。
6. 在室温下用 Alexa 594 标记的鸡抗小鼠二抗（1:100）孵育成体或幼体样本 2 小时，随后用 PBS 洗涤样本。
7. 将幼虫或成虫的中枢神经系统（CNS）置于载玻片上。为保持CNS的自然形态，可在载玻片上使用O形塑料环（Clear Reinforcement Label，Avery Dennison，Office Products，Brea，CA）作为微型支架，以悬空盖玻片。
8. 在荧光显微镜下观察GFP和Elav（或Repo）表达模式的制备情况。

4. 两种互补的 Gal80 转换工具在光感受器中抑制 Gal4 的应用

1. 通过 tub^P>Gal80> 去除 Gal80（图 5A）。
   1. 收集 GMR-Gal4, UAS-polyQ; tub^P>Gal80> 品系的雄性果蝇。注意这些果蝇的复眼表型正常。
   2. 与 ey-FLP 处女蝇杂交。
   3. 收集 F1 代果蝇并观察其眼表型。
2. 通过 tub^P>stop>Gal80 引入 Gal80（图 5B）。
   1. 收集 GMR-Gal4, UAS-polyQ; tub^P>stop>Gal80 雄性果蝇，并观察其眼表型。与野生型品系（Canton-S）相比，这些果蝇的眼睛出现退化和脱色素现象。
   2. 与 ey-FLP 处女蝇杂交；
   3. 收集 F1 代果蝇并观察其眼表型。
3. 筛选在感光细胞中具有表达的 ET-FLPx2 品系。

可以使用在部分感光细胞中表达FLP的ET-FLPx2品系重复步骤4.1和4.2。或者，可将GMR-Gal4、UAS-polyQ; tub^P>stop>Gal80果蝇或GMR-Gal4、UAS-polyQ; tub^P>Gal80>果蝇分别与各个ET-FLPx2品系杂交，以筛选在感光细胞中表达FLP的品系。有价值的ET-FLPx2品系是在部分或单个感光细胞中特异性表达FLP的品系（图6）。

5. 代表性结果

通过将 yw, actin^P>CD2>Gal4; UAS-GFP 处女蝇与 ET-FLPx2 雄蝇杂交，可方便地在所得的 F1 代幼虫或成虫中观察并记录特定 ET-FLPx2 品系的表达模式（图1）。通常需解剖并观察 3 至 5 个重复的 F1 代个体，以确定 FLP 表达模式的可重复性（Bohm 等，2010）。图2 展示了 ET-FLPx2 品系 173A 在幼虫和成虫中枢神经系统（CNS）中 FLP 的表达模式。可进一步利用神经元或胶质细胞标记物对 FLP 表达模式进行分析（图3 和图4）。

所示结果在 图7 说明Gal80翻入和翻出系统在FLP介导的重组后对Gal4进行交集抑制的有效性。tub^P>停止>Gal80 构建体似乎未表现出任何Gal80的渗漏表达（基于感光细胞均匀的退化和脱色素现象），但在eyFLP的辅助下，其翻转Gal80的效率可达100%，从而有效抑制GMR-Gal4并使眼睛恢复至正常外观图 7A）。相反，微管^P>Gal80> 在引入 eyFLP 之前完全抑制 GMR-Gal4。Gal80 翻转切除后，GMR-Gal4 驱动 UAS-polyQ 表达，导致眼睛退化和脱色素图 7B在此示例中，我们使用了一种广谱感光细胞FLP来绘制感光细胞的“环路”，但未研究其行为学后果。通过采用类似方法并结合与行为相关的Gal4品系，我们绘制了部分调控成年果蝇翅膀展开的CCAP-Gal4神经环路（Bohm et al., 2010）。我们认为，FINGR方法将有助于深入理解行为的神经基础。

图1. 检测ET-FLPx2品系的表达模式。 通过将ET-FLPx2雄性个体（左上）与actin^P>CD2>Gal4; UAS-GFP virgin雌性个体（右上）杂交，可确定ET-FLPx2品系中FLP的表达模式（蓝色椭圆）。在母本雌性中，由于两侧由FRT（灰色三角形）包围的CD2序列插入，泛在性Actin^P>Gal4的表达受到阻断。在F1代子代中，FLP会切除CD2序列，从而允许Actin^P>Gal4驱动UAS-GFP的表达。

图 2. ET-FLPx2 品系在幼虫和成虫中枢神经系统中的表达模式。这些图像显示了将 yw, actin^P>CD2>Gal4; UAS-GFP 亲本与 ET-FLPx2 173A 品系杂交后，其子代中解剖得到的中枢神经系统（脑和腹神经索，VNC）。通过将 >CD2> 插入盒重组切除，FLP 激活了 actin^P>GAL4 的表达（从而驱动 UAS-GFP 的表达）。因此，GFP 的表达模式反映了 FLP 表达细胞的分布。图 A 显示了幼虫期 FLP 的表达模式，而图 B 显示了 173A 品系成虫期的表达模式。

图3. ET-FLPx2 #688A品系中表达翻转酶的细胞类型鉴定 A，固定F1 3的复合图像^rd ET-FLPx2 品系 #688A 与 GFP Flippase 报告品系杂交所得三龄幼虫经抗-REPO 染色。 B-D，从3龄幼虫腹神经索（VNC）后端获取的高倍视野图像（Zeiss Plan-Apochromat 63x油镜）^rd 龄幼虫

图4. ET-FLPx2 系系 #150 果蝇蘑菇体中细胞类型的表征。 A-C，来自固定后的F1代三龄幼虫蘑菇体的高倍图像（63倍油镜），经抗-REPO抗体染色。

图5. Gal80翻入与翻出策略示意图。A. 在翻出策略中，由微管蛋白启动子驱动的Gal80（Tub^P>Gal80>）持续表达，导致GMR-Gal4被抑制，从而表现为野生型眼表型（红眼）。通过引入FLP（紫色），可将Gal80翻出（中间，红色），解除对GMR-Gal4的抑制，使其激活UAS-polyQ的表达，进而引起感光细胞退化（以眼中的白点表示）。B. 在相反的策略中，由微管蛋白启动子驱动的Gal80表达被两侧带有FRT（灰色三角形）的“终止”密码子所阻断。在缺乏Gal80的情况下，GMR-Gal4结合UAS-polyQ，导致感光细胞发生神经退行性变（以眼中的白点表示）。通过将GMR-Gal4、UAS-polyQ；tub^P>stop>GAL80雄性果蝇与在感光细胞中表达FLP的处女雌蝇杂交，FLP（紫色）将催化FRT位点的重组，切除“终止”密码子（中间，红色），从而允许Gal80表达并抑制GMR-Gal4，进而阻止感光细胞的神经退行性变（以眼中无白点表示）。

图6. 使用ET-FLPx2品系#688A通过FINGR方法实现Gal80的翻转剔除。 ET-FLPx2品系#688A virgin雌蝇与GMR-Gal4, UAS-polyQ; tubP>GAL80雄蝇杂交所得的F1代子代。眼小眼中间区域色素的缺失代表了#688A品系中FLP的表达。在此区域，Gal80对GMR-Gal4的抑制作用被解除，从而允许Gal4驱动UAS-polyQ的表达。

图7. FINGR方法在光感受器细胞中通过翻转Gal80来与Gal4实现交叉表达的应用。A. tub^P>stop>Gal80 翻入系统以FLP依赖的方式限制GAL4的表达。在GMR-Gal4、UAS-polyQ；tub^P>stop>GAL80 果蝇中，光感受器细胞发生退化并失去色素（左侧果蝇）。引入eyFLP后，Gal80在光感受器细胞中表达，从而完全抑制GMR-Gal4，进而关闭polyQ的表达，产生眼睛正常的果蝇（右侧果蝇）。B. tub^P>Gal80> 翻出系统的作用方式与tub^P>stop>Gal80 翻入系统相反。tub^P>Gal80> 持续抑制GAL4，从而抑制polyQ的表达（左侧果蝇，眼睛正常）。引入eyFLP后，Gal80从光感受器细胞中被翻出，解除对GMR-Gal4的抑制，启动polyQ的表达，导致果蝇眼睛退化且失去色素（右侧果蝇）。

讨论

Gal4/UAS 系统已被果蝇研究者广泛而成功地应用于各种生物学研究（Brand & Perrimon, 1993；Duffy, 2002）。迄今为止，果蝇研究领域已构建了数千个由启动子驱动或增强子捕获的 Gal4 品系。FINGR 方法的一个主要优势在于其与 Gal4/UAS 系统兼容，从而可显著拓展 Gal4 在果蝇研究中的应用能力。

FINGR 方法的一个重要应用是通过 Gal4/Gal80 交集策略精细调控与行为相关的神经环路。这些行为可能包括但不限于学习与记忆、求偶、睡眠以及昼夜节律。FINGR 方法还可用于绘制在模拟人类神经退行性疾病（如阿尔茨海默病、肌萎缩侧索硬化症（ALS）和帕金森病）中易发生神经退变的关键神经元。类似地，介导可卡因、酒精及其他物质成瘾的关键神经元群或神经环路也可利用 FINGR 方法进行定位。需要注意的是，条件性 Gal4 系统（Osterwalder 等，2001；Roman 等，2001）可与 FINGR 方法结合使用，以实现对神经环路和行为的时间特异性调控。通过使用温度敏感型 Gal80（Gal80^ts，McGuire 等，2003）对 Gal80 转换工具进行改造，可构建 tub^P>stop>Gal80^ts 或 tub^P>Gal80^ts> 系统，从而在环路操控中提供更高的时间灵活性。除了神经系统外，FINGR 方法同样适用于在特定细胞亚群中限制 Gal4 的表达，无论是在翅还是在腿中。

ET-FLPx2 品系将为所有对基于 FRT/FLP 的克隆分析（Xu & Rubin, 1993）感兴趣的果蝇生物学家提供宝贵的资源，包括 MARCM 技术（Lee & Luo, 1999）。预计某些 ET-FLPx2 品系还可替代热激诱导的 FLP 系统，用于生成可重复的克隆，并进行重复的形态学和行为学分析。与增强子捕获 Gal4 品系类似，大多数 ET-FLPx2 品系不太可能仅在研究者感兴趣的特定细胞中特异性表达。大多数品系不仅会在目标细胞中表达 FLP，同时也会在其他细胞或组织中表达。然而，只要 Gal4 与 ET-FLPx2 的共同表达区域符合特定实验的需求，二者缺乏“组织特异性”就不会对 FINGR 方法构成主要问题。FINGR 的设计目的正是将两种“广泛”表达的系统转化为一种精确的系统。

这些方案中描述的方法较为常规，应具有可重复性。需要特别注意的主要步骤是固定剂的选择和使用。应避免使用除PFA以外的其他固定剂，因为它们会淬灭GFP信号。我们还注意到，不应在解剖皿中使用PFA进行固定，以避免FLP表达无法被GFP可靠报告的可能性。