我们描述了一种基于小鼠胚胎干细胞的检测方法，用于确定在心源性诱导过程中Wnt/β-catenin和BMP信号激活的关键时间窗口。该方法提供了一个标准化平台，可可靠地量化心源性效率，并适用于其他细胞谱系的研究。
本文内容
摘要
摘要
多能干细胞的分化受到多种关键信号通路在时间和空间上的精确调控。理解这一过程的一个难点在于，目前尚缺乏统一的方法来关联关键信号事件的变化与分化效率之间的关系。本文描述了一种基于小鼠胚胎干细胞（ES细胞）的检测方法，用于鉴定在心源性诱导过程中Wnt/β-catenin和BMP信号激活的关键时间窗口。通过在96孔板中对跳动的胚胎体（EBs）进行计数，我们能够快速定量心源性分化效率，并在特定信号调节剂处理后的时间进程中，确定Wnt/β-catenin和BMP信号激活的关键时段。此处阐述的原理不仅限于心源性诱导，还可应用于其他多种细胞谱系的研究。此外，96孔板格式具有进一步发展为高通量、自动化检测体系的潜力，从而支持更复杂实验假设的验证。
方案
1. 使用96孔圆底微孔板形成拟胚体（EB）
- 在含有LIF的鼠胚胎干细胞培养基中，将鼠胚胎干细胞培养于10 cm细胞培养皿中。
- 当胚胎干细胞准备就绪（通常达到50–70%融合度）时，移除培养基，并用5 ml无菌PBS洗涤细胞一次。
- 每皿加入2 ml 0.05%胰蛋白酶/EDTA，于37°C孵育3˜5分钟，然后加入3 ml胚胎干细胞培养基终止胰蛋白酶反应。
- 将细胞转移至50 ml Falcon管中，以1000 rpm离心3分钟。
- 弃去上清液，并用适量的拟胚体（EB）培养基重悬细胞沉淀。
- 计数细胞数量，并用EB培养基将细胞稀释至5 × 103 个细胞/ml。
- 使用多通道移液器将含细胞的EB培养基100 μl加入96孔圆底微孔板的每一孔中。
- 将96孔圆底微孔板放入培养箱中培养。
2. 确定心脏发生关键信号通路的关键时间窗口
- 在不同时间点（如第0天、第1天、第2天、第3天和第4天等），向含有胚胎干细胞（ES细胞）的96孔微孔板的各个孔中加入特定信号通路的调节剂以及溶剂对照。
- 在不同的终止时间点，通过更换胚体（EB）培养基来清除调节剂，每48个孔对应一个终止时间点。例如，若要对从第0天开始的ES细胞进行两天处理，则在第2天清除调节剂。对于任何超过48小时的处理，在达到预期的终止时间点之前，每隔两天更换一次添加新鲜调节剂的EB培养基。
- 在第7天后在显微镜下观察胚体（EB）的收缩情况。将出现收缩胚体的孔记为阳性孔，计算每种不同处理时间条件下收缩胚体的百分比。
- 胚胎干细胞向心肌细胞分化的关键时间点，是指在使用信号通路调节剂处理后，相较于溶剂对照组，收缩胚体百分比达到最高的那些时间段。
3. 利用悬滴法形成的胚状体验证心脏发生信号通路的时间窗口
- 通过加入 3–4 ml PBS 准备培养皿，以防止蒸发。
- 按照步骤 1.1 ˜ 1.5 操作，将 ES 细胞调整至终浓度为 2.5×104 个细胞 / ml。
- 将细胞混合液倒入细菌培养皿中以便操作。使用多通道移液器，在倒置的皿盖上加入 20 μl 液滴（每滴约含 500 个细胞）。确保各液滴之间不相互接触。通常一个皿盖最多可容纳 80 个液滴。将皿盖翻转盖回含有 PBS 的培养皿上，于培养箱中孵育 24 小时或 48 小时，以形成拟胚体（EB）。
- 用 3 ml EB 培养基将每个皿盖上形成的悬滴拟胚体冲洗下来，并将两个皿盖的拟胚体合并至一个新的培养皿中。加入 EB 培养基使总体积达到 10 ml。
- 在第 4 天时，将悬浮培养的拟胚体转移至经 0.2% 明胶包被的 6 孔板中。一般每孔转移 30 个拟胚体。每孔加入 EB 培养基至终体积为 2 ml。
- 根据 96 孔板实验所确定的时间段，孵育信号通路调节剂。
- 在第 7 天后通过显微镜观察拟胚体的收缩情况，必要时可通过 RT-PCR、免疫染色等方法进一步表征心脏分化情况。
讨论
悬滴法一直是用于拟胚体形成和体外分化的常规方法。然而，该方法费时费力，且由于操作上的限制，实验灵活性较差。同样，由于悬滴状态下拟胚体的形成与操作高度依赖实验人员的技术水平，实验结果也更难验证。一种更简便的方法是在圆底96孔板中通过单步法形成拟胚体。该体系有利于体外分化的标准化，并因拟胚体形成及后续操作（如调节剂的添加或去除）简便，可容纳更多的实验条件。此外，96孔板体系还可优化为小鼠胚胎干细胞中高效的筛选工具。
披露
未声明任何利益冲突。
致谢
本工作由退伍军人事务部以及美国国立卫生研究院（NIH）资助，资助编号为 5U01HL100398 和 1R01HL104040。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 主要使用小鼠CGR8细胞。 | |||
| ES培养基：GMEM培养基添加10%热灭活FBS、2 mM L-谷氨酰胺、0.05 mM 2-巯基乙醇–乙醇和200 U/ml小鼠LIF。 | |||
| EB 培养基：配制含 20% 热灭活 FBS、1.6 mM L-谷氨酰胺、0.08 mM 2-巯基乙醇的 IMDM 培养基–乙醇和1倍MEM非必需氨基酸溶液 |
参考文献
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- Foley, A. C., Mercola, M. Heart induction by Wnt antagonists depends on the homeodomain transcription factor Hex. Genes Dev. 19, 387-396 (2005).
- Naito, A. T., Shiojima, I., Akazawa, H., Hidaka, K., Morisaki, T., Kikuchi, A., Komuro, I. Developmental stage-specific biphasic roles of Wnt/beta-catenin signaling in cardiomyogenesis and hematopoiesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 19812-19817 (2006).
- Hao, J., Daleo, M. A., Murphy, C. K., Yu, P. B., Ho, J. N., Hu, J., Peterson, R. T., Hatzopoulos, A. K., Hong, C. C. Dorsomorphin, a selective small molecule inhibitor of BMP signaling, promotes cardiomyogenesis in embryonic stem cells. PloS one. 3, e2904-e2904 (2008).
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