磁性激活细胞分选介导的脂质囊泡亲和层析（LIMACS）：一种分析蛋白质-脂质相互作用的新方法

摘要

为了检测蛋白质与其靶向脂质的相互作用，我们使用了MACS技术以及与磁珠偶联的Annexin V，并采用靶向脂质和Annexin V结合的磷脂酰丝氨酸合成脂质体。结合在靶向脂质上的蛋白质可通过磁珠共纯化，并在洗脱后进行分析。

摘要

由于脂质嵌入在细胞膜中，难以接触大多数纯化步骤，因此脂质与蛋白质相互作用的分析具有挑战性。作为替代方法，可将脂质涂覆在平面上，如用于脂质ELISA和表面等离子共振光谱法。然而，表面涂覆的脂质无法形成微区结构，而这些结构可能对脂质的结合特性至关重要。此外，这些方法也无法实现与靶标脂质结合的大量蛋白质的纯化。

为了克服检测脂质-蛋白质相互作用的局限性，并实现脂质结合蛋白的纯化，我们开发了一种新方法，称为基于磁性激活细胞分选技术的脂质囊泡介导亲和层析法（LIMACS）。该方法中，将目标脂质与磷脂酰丝氨酸作为锚定脂质共同制备成脂质囊泡，用于Annexin V MACS。磷脂酰丝氨酸是一种广泛存在于细胞膜上的磷脂，可高亲和力地结合Annexin V蛋白。通过使用与Annexin V偶联的磁珠，含有磷脂酰丝氨酸的脂质囊泡即可结合到磁珠上。当将这些脂质囊泡与细胞裂解液孵育时，能够结合目标脂质的蛋白质也将随之被固定在磁珠上，从而可通过MACS实现共纯化。该方法也可用于检测重组蛋白是否能重建一个可结合目标脂质的蛋白质复合物。

我们已利用该方法揭示了非典型蛋白激酶C（aPKC）与鞘脂类神经酰胺之间的相互作用，并共同纯化出前列腺凋亡反应4蛋白（PAR-4），后者是一种可结合神经酰胺相关aPKC的蛋白质。我们还应用该方法重建了重组aPKC与细胞极性相关蛋白Par6和Cdc42形成的神经酰胺相关复合物。由于脂质体可由多种鞘脂或磷脂制备，LIMACS提供了一种灵活的检测手段，用于在接近细胞膜环境的条件下研究脂质-蛋白质相互作用。通过蛋白质组学分析与脂质体共纯化的脂质结合蛋白，还可鉴定出其他脂质-蛋白质复合物。

方案

1. 引言

我们实验室开发了基于脂质囊泡的磁性激活细胞分选亲和层析技术（LIMACS），用于分离与神经酰胺结合的蛋白质复合物 ^1-3最初，脂质体由神经酰胺和磷脂酰丝氨酸构成，可通过与磁性颗粒偶联的Annexin V（对磷脂酰丝氨酸具有高亲和力）进行磁珠分选（MACS），从而分离脂质体及其相关蛋白。我们已将LIMACS技术用于 体外 重建神经酰胺相关极性复合物及从细胞裂解液中分离神经酰胺结合蛋白 ³LIMACS 可通过使用其他相互作用伙伴来修饰，以分离囊泡（例如，特异性识别糖脂的凝集素或脂质抗体）。

2. 实验步骤

脂质体的制备与aPKC结合实验

1. 通过改良的大脂质体（liposome）制备方法，从等摩尔量的磷脂酰丝氨酸（105 μg）和C16-神经酰胺（85 μg）的干燥混合物中获得脂质囊泡^1,4-7。
2. 将脂质混合物重悬于100 μl囊泡缓冲液（含50 mM Tris/HCl（pH 7.5）和150 mM NaCl）中，并超声处理1小时。
3. 加入300 μl含0.1 mM MnCl₂的囊泡缓冲液后，样品在4 °C下以12,000 μg离心20分钟。
4. 将沉淀（大脂质囊泡）重悬于100 μl囊泡缓冲液中，并与1 nmol Vybrant CM-diI在37 °C孵育1小时，以便在MACS分离后可视化囊泡组分。Vybrant CM-diI是一种特异性嵌入脂质膜的红色荧光染料。
5. 通过在300 μl低渗缓冲液（含10 mM Tris/HCl（pH 7.0）以及蛋白酶和磷酸酶抑制剂）中对细胞进行超声或匀浆处理，制备无去垢剂的细胞裂解液，随后通过离心去除膜碎片。为避免内源性含磷脂酰丝氨酸的膜污染细胞裂解液，应增加一步在100,000×g下离心1小时的操作。
6. 将澄清的裂解液加入脂质囊泡悬液中，在4 °C孵育2小时。
7. 向反应混合物中加入20 μl 20× Annexin V结合缓冲液和50 μl含Annexin V偶联磁珠的溶液，随后在4 °C孵育1小时。
8. 按照生产商（Miltenyi Biotec, Inc.）的说明书进行磁珠分选（MACS）。通过微孔板荧光读数仪检测流穿组分和洗脱组分中Vybrant CM-diI的荧光强度，以确定脂质囊泡的存在及数量。
9. 通过定量高效薄层色谱法（HPTLC）分析应用于基于Annexin V的MACS的脂质混合物，验证囊泡脂质含量与囊泡结合的Vybrant CM-diI荧光强度之间的线性相关性。
10. 通过抗体竞争实验验证aPKC或其他蛋白与神经酰胺/磷脂酰丝氨酸囊泡结合反应的特异性：在与脂质囊泡孵育前，先用1 μg抗PKCζ兔多克隆抗体在4 °C孵育细胞裂解液1小时。
11. 通过SDS-PAGE和免疫印迹分析MACS洗脱液中与神经酰胺/磷脂酰丝氨酸囊泡结合的蛋白质。

体外 脂质-蛋白质极性复合物

1. 的 体外 按照前文所述的LIMACS步骤，进行脂质-蛋白质极性复合物的重建。简言之，将磷脂酰丝氨酸（420 μg）和C16-神经酰胺（107 μg）从有机溶剂中干燥。
2. 将干燥的脂质在500 μl囊泡缓冲液（50 mM Tris/HCl，pH 7.5；150 mM NaCl）中通过超声处理重新悬浮。
3. 加入5 μl 10 mM MnCl2、1 μl Vybrant CM-diI 和500 ng PKCζ（人重组蛋白），将反应混合物在4 °C下轻柔振荡孵育60分钟。
4. 通过在 4 °C 条件下以 12,000×g 离心 60 分钟，回收 Vybrant CM-DiI 标记的磷脂酰丝氨酸/神经酰胺囊泡。
5. 将沉淀物（粉红色）重悬于100 μl Tris缓冲液中，并加入γS-GTP（100 μM）、GDP（1 mM）、GST-Par6（100 ng）或GST-Cdc42（500 ng），于4 °C进一步孵育3小时（此处可使用任何其他感兴趣的重组蛋白组合).
6. 加入5 μl 20倍浓缩的Annexin V缓冲液和50 μl Annexin V偶联磁珠，于4 °C在轻柔振荡条件下孵育反应混合物30分钟。
7. Annexin V-MACS 按照供应商先前所述的方案进行操作。
8. 洗脱组分（1 ml）中加入10 μg纯卵清蛋白作为沉淀辅助剂。蛋白质通过Wessel-Flugge沉淀法浓缩，并按先前所述方法进行SDS-PAGE/免疫印迹分析。 ⁸.
9. 通过检测Wessel Flugge沉淀反应中有机相（氯仿/甲醇相）内Vybrant CM-diI（粉红色）的含量，来定量洗脱的脂质体。所分析的蛋白质量以等量的脂质体为基准进行归一化。

3. 结果

PKCζ-EGFP 和神经酰胺结合域 C20ζ-EGFP 的 LIMACS 纯化

将表达全长PKCζ（其C末端连接绿色荧光蛋白，即FLζ-EGFP）或PKCζ C末端含有神经酰胺结合域（即C20ζ-EGFP）的MDCK细胞去污剂裂解液与磷脂酰丝氨酸/神经酰胺囊泡孵育，实验步骤如“实验方法”部分所述。MACS柱洗脱后，通过免疫印迹分析蛋白，并使用抗PKCζ和抗EGFP抗体检测洗脱蛋白²。

图1. 使用磷脂酰丝氨酸/神经酰胺囊泡对EGFP标记的PKCζ及其C端片段C20ζ进行LIMACS分析。

将表达EGFP（作为非结合对照）、全长PKCζ-EGFP或具有神经酰胺结合能力的C端片段C20ζ-EGFP的MDCK细胞裂解物（不含去垢剂）与磷脂酰丝氨酸/神经酰胺囊泡孵育，具体操作如实验方法部分所述。经LIMACS处理后，用SDS上样缓冲液洗脱蛋白，并通过SDS-PAGE和免疫印迹分析。左图显示EGFP未结合到由Annexin V偶联磁珠保留的囊泡上。中图和右图显示全长PKCζ-EGFP和C20ζ-EGFP因与神经酰胺结合而被保留。

讨论

检测脂质与其结合蛋白之间特异性相互作用的研究受到脂质嵌入细胞膜中的限制。细胞膜由多种脂质和蛋白质混合组成，并形成脂质微区或称脂筏结构。因此，通过共纯化微区及其相关蛋白的方法无法明确区分该蛋白是直接与某种脂质结合，还是仅仅富集于微区结构中。其他方法，例如将特定脂质包被在固相表面的脂质ELISA或表面等离子共振光谱法，能够检测特定脂质与其结合蛋白之间的相互作用。然而，若要在具有生理相关性的膜环境中确定这种相互作用，需将脂质囊泡或脂质体包被于检测表面（如用于表面等离子共振光谱法的芯片表面）。

我们开发了一种新型的脂质囊泡结合实验，作为对以往方法的替代。该方法的创新之处在于将一种锚定脂质（磷脂酰丝氨酸）整合入囊泡中，从而可利用与磁珠偶联的膜联蛋白V（Annexin V）来分离脂质囊泡。因此，我们将该实验命名为基于磁性激活细胞分选的脂质囊泡介导亲和层析法（LIMACS）。LIMACS可用于内源性蛋白、细胞中表达的蛋白，或重构于脂质-蛋白复合物中的重组蛋白的研究^1-3。

通过简单地将MACS柱从磁力架上取下，并用...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
偶联 Annexin V 的磁珠及 MACS 微柱和小柱	Miltenyi Biotec
脂质（最高纯度）	Avanti Polar Lipid, Inc