我们展示了如何使用双光子显微镜观察感染肺组织中中性粒细胞的动态行为，包括其中性粒细胞吞噬病原体或形成中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）的过程。
方法文章
利用双光子显微镜直接观察感染肺组织中中性粒细胞的吞噬作用及中性粒细胞胞外诱捕网（NET）的形成 关键词：中性粒细胞，吞噬作用，中性粒细胞胞外诱捕网（NET），双光子显微镜，肺部感染，活体成像
本文内容
摘要
摘要
在消化道之后，肺是脊椎动物机体与外界环境相互作用的第二大表面。在此处，必须在维持高效气体交换的同时，避免因正常呼吸过程中吸入多种病原体而引发感染。为实现这一目标，机体具备一套卓越的防御策略，结合了体液免疫和细胞免疫机制。其中，肺部急性防御最有效的措施之一是中性粒细胞的募集，这些细胞可通过吞噬作用清除吸入的病原体，或通过释放细胞毒性物质将其杀灭。近年来发现，中性粒细胞还可爆发性释放胞外DNA构成的中性粒细胞胞外诱捕网（NETs），从而捕获甚至灭活病原菌或真菌，即使产生NETs的细胞已经死亡仍可发挥作用。本文介绍一种方法，可直接观察感染后肺组织内迁移的中性粒细胞吞噬真菌病原体的过程，并可视化其在感染组织中广泛形成的NETs结构。该方法描述了在小鼠经气管接种烟曲霉（Aspergillus fumigatus）分生孢子7小时后，制备具有活性的厚肺组织切片，并利用多色时间延时双光子显微镜进行观察。该技术可直接在天然肺组织中研究抗真菌免疫防御过程，从而为肺部免疫的深入研究开辟了新的途径。
方案
1. 感染
- 霉菌肿胀的分生孢子 Aspergillus fumigatus （菌株 ATCC 46645）通过在添加 5% FCS（v/v）的 RPMI 1640 培养基（Biochrom AG，柏林，德国）中预孵育制备。2×107 静止期分生孢子重悬于5 ml培养基中，置于6孔组织培养板（TPP AG；Trasadingen，瑞士，目录号 # 92006）中，在37°C、5% CO₂条件下孵育7小时 37°C.
- 肿胀期结束后，通过添加荧光染料对孢子进行荧光标记 10 μl Calcofluor White 储存液（Sigma Aldrich，Deisenhofen，德国，目录号 # F3543；DMSO 中浓度为 [25 mg/ml]）各加入 曲霉属 6孔板中的每个孔，使荧光增白剂终浓度达到 50 μg/ml RPMI。 轻轻混匀后，孢子在37℃下额外孵育15分钟 37 °C.
- 下一步，通过过滤收集孢子 70 μm 细胞筛（BD Biosciences，德国海德堡）。用10 ml PBS洗涤一次后（在室温下以900×g离心5分钟），将沉淀重悬于2 ml PBS中，并使用血细胞计数板（Neubauer计数室）计数以确定肿胀分生孢子的总数。最后，将孢子悬液在室温下以900×g离心5分钟，小心移去上清液，将沉淀重悬至最终浓度为每毫升1×10⁷个孢子 100 μl PBS
- 用于感染， 100 μl 将孢子溶液经气管内接种至雌性小鼠（C57/BL6，8–10周龄，Harlan，德国）。若需同时观察中性粒细胞，可使用携带溶菌酶启动子驱动EGFP表达的Lys-EGFP小鼠1 建议通过一次腹腔注射对动物进行麻醉。 150 μl 氯胺酮/隆朋溶液（Ketamin/Rompun solution，Inresa Arzneimittel GmbH，德国弗赖堡（Ketamin）和Bayer Vital GmbH，德国勒沃库森（Rompun），1 ml 氯胺酮 [50 mg/ml] + 0.5 ml 隆朋 [2 %] + 3.5 ml 无菌氯化钠溶液 [0.9 %]）。给药5分钟后，可使用弹性绑带将麻醉小鼠通过门齿固定于斜坡装置（即倾斜表面）上，以方便进行气管插管（补充图1）。用镊子将舌头轻轻拨向一侧，在鹅颈灯持续照明下，将22G留置静脉导管（B. Braun AG，德国梅尔松根，Vasofix Braunüle）轻柔插入气管。通过观察动物胸廓随机械呼吸机频率规律起伏，确认导管插入成功。确认成功插管后， 100 μl 孢子悬液使用以下方法施加： 100 μl 微量移液器。该体积应在1-2秒内由动物自主吸入，无需额外辅助。通过使用小型动物呼吸机（MiniVent, Hugo Sachs, March-Hugstetten, Germany）对感染动物进行2分钟的机械通气，可实现真菌颗粒在肺内的更均匀分布，通气频率为每分钟250次呼吸，吸气量为 300 μl 每次呼吸（补充图2）。感染后，将动物放回笼中，并每5分钟观察一次，直至其恢复自主活动。在随后的孵育期间，小鼠未表现出任何疼痛或痛苦的迹象。
2. 肺组织准备
- 接种孢子后7小时，使用异氟烷（Baxter GmbH, Unterschleiβheim, 德国）过量麻醉处死动物，直至动物运动和呼吸停止超过30秒。随后进行开胸术作为辅助手段，以确认临床死亡，并便于气管和肺的观察与操作。接着小心打开胸腔，暴露肺和上呼吸道。然后从暴露的会厌开始，将另一根22G留置静脉导管插入气管。通过该导管，使用1 ml Omnifix注射器（B.Braun）向肺内灌注1 ml预热的低熔点琼脂糖（2% w/v，Promega，曼海姆，德国）。肺完全充盈后，立即用一小段缝合线结扎气管，并将整个动物置于4 °C冰箱中。
- 15分钟后，待琼脂糖完全凝固，从气管起完整切除整个肺组织。使用一对尖头剪刀切除右肺叶，将其底面在滤纸上短暂吸干，随后用一滴组织粘合剂（Carl Roth GmbH，卡尔斯鲁厄，德国，Roti-Coll 1）将整个肺叶固定于振动切片机（Campden Instruments，英国，752M Vibroslice）的样品块上。1分钟后，将样品块安装至振动切片机的切割室中，切割室内盛有预冷的PBS（4°C）。将振动切片机的振动强度设为中等（最大值10中的5），切割速度也设为中等（最大值10中的5），以获得肺组织的水平横截面。将器官的上半部分转移至一个小型塑料培养皿（直径5 cm）中，翻转后用自制的平垫圈（内径1 cm）固定，垫圈上覆盖一组平行尼龙丝，丝间距为1 mm（补充图3）。最后向培养皿中加入10 ml PBS，并添加10 μl DNA染料Sytox Orange [5 mM]（Invitrogen，德国），使染料终浓度达到5 μM。
3. 双光子激光显微镜
- 将含有肺组织样本的培养皿安装在显微镜物镜下，通过温度传感器控制的加热装置将缓冲液加热至 37°C（补充图 4）。使用配备 20 倍 NA 1.0 水浸物镜（Zeiss，Jena，德国）的 Zeiss LSM 710 NLO 显微镜，在直立 Axio Examiner 载物台上对整个切面进行双光子显微成像。成像时，采用 800 nm 激发光波长，对切片不同区域进行扫描，最大深度达 400 μm，同时利用外部非共聚焦检测器（NDD）检测绿色（530 nm）和红色（580 nm）荧光、二次谐波生成（SHG）信号以及蓝色 calcofluor 荧光（发射波长 400–470 nm）。除二维图像和延时录像（每 5–10 秒采集一帧）外，还可利用多种软件对单次或重复采集的三维图像序列进行体素重建、单幅扩展焦面图像合成，或生成四维数据（随时间变化的三维图像）。该显微成像系统可在近乎完整的环境中观察细胞行为，该环境作为多种空气传播病原体的入侵门户，在免疫学上具有重要意义。在此原位条件下，可方便地研究内源性中性粒细胞在曲霉菌 Aspergillus fumigatus 感染后发生的细胞迁移、吞噬作用及中性粒细胞胞外诱捕网（NET）的形成。
4. 代表性结果
如果操作得当，成像将生成双色或三色的图像或动态视频。尽管着色是在后期处理过程中完成的，因此可自由调整，但我们通常选择一种能够反映各通道所检测到的染料/信号本身天然颜色的着色方案。因此，Sytox 染料显示为红色，真菌以及二次谐波（SHG）信号显示为蓝色，若存在 EGFP 标记的细胞，则染成绿色。在第一个示例中（图1），蓝色的 SHG 信号显示的是未感染肺组织中的组织纤维，而红色的 Sytox 信号则来自被振动切片机切断的肺驻留细胞的细胞核。在第二个示例中（图2）展示的是感染后的肺组织，其中肺泡结构和真菌团块均呈蓝色，而细胞核和中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）则被染成红色。第三个示例（图3）来自 Lys-EGFP 转基因动物，除蓝色和红色结构外，还可观察到绿色的中性粒细胞。中性粒细胞的迁移及其在时间序列中对单个真菌成分的吞噬过程详见补充视频。
图1. 未感染肺组织切片在双色双光子显微镜下的形态。 肺组织切片取自未感染的C57/BL6小鼠，按本实验方案所述方法进行成像。图中显示了肺泡组织结构的二次谐波（SHG）信号（A）、在制备肺组织切片过程中被切开的细胞核的Sytox信号（B），以及两个通道信号的叠加图像（C）。（C）图中框选区域在（D）中放大显示。请注意，与肺组织上部呼吸活跃区域清晰的肺泡结构相比，肺切片底部存在纤维状组织。
图 2. 在双色双光子显微镜下观察Aspergillus感染的野生型动物肺组织切片的形态。 取一只在7小时前经A. fumigatus感染的C57/BL6小鼠的肺组织切片，按本实验方案所述方法制备并成像。图中显示了真菌结构与肺泡组织二次谐波信号（A）、Sytox标记的DNA中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）以及在肺组织切片制备过程中被切开的细胞核（B），以及两个通道信号的叠加图像（C）。(C)图中框选区域在(D)图中放大显示。请注意，真菌团块、肺泡和NET结构三个明显不同的区域分别用字母F、A和N标注。
图 3. 在 Aspergillus 感染的 Lys-EGFP 动物肺组织切片中，通过三色双光子显微镜观察到的图像。 在感染 A. fumigatus 7 小时后，制备并按照本方案所述方法成像了 Lys-EGFP 小鼠的肺组织切片。图中显示了真菌结构与肺泡组织的二次谐波信号（蓝色）、细胞核和中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）的 Sytox 信号（红色），以及大量中性粒细胞（绿色）。
补充图1. 小鼠插管时的固定方法。 在氯胺酮/隆朋麻醉下，使用弹性带将动物的牙齿固定，以便通过22G留置静脉导管进行插管。
补充图2. 小鼠机械通气。 通过气管内注射将1×107个孢子重悬于100 μl PBS中感染已插管的小鼠。使用小型动物呼吸机对感染小鼠进行机械通气，可实现真菌颗粒在肺内的更均匀分布。
补充图3. 肺叶固定。 右肺叶制备完成后，使用实验室自制的平垫圈并通过一组平行的尼龙线将其固定在培养皿中。
补充图4. 双光子成像装置。 加入DNA染料Sytox Orange后，将含有右肺叶的培养皿置于加热垫上，并安装到双光子显微镜下。
补充视频：中性粒细胞迁移并吞噬真菌成分的过程 曲霉属 通过延时双光子显微镜观察感染后7小时的活体肺组织切片，可见受真菌感染的肺部。 中性粒细胞呈绿色，真菌成分和SHG呈蓝色，细胞核以及NET结构呈红色。实验的实时时间显示在右下角。比例尺表示 50 μm.点击此处观看视频
讨论
在过去10年中，活体或完整器官内的实时双光子显微镜技术在免疫细胞生理学研究中变得极为重要。正是借助该技术，淋巴结内T细胞活化的动态过程等关键事件首次得以被观察到2-4。最近，研究人员还开始利用这一方法分析淋巴组织中效应细胞生成的初始阶段等特定细胞功能5。
然而，尽管利用该方法已揭示出许多新的生物学概念，但仍有一些具有挑战性和重要性的问题尚未发表活体可视化研究，其中尤为突出的是哺乳动物肺脏。该器官作为多种空气传播病原体的入侵门户，成为哺乳动物体内免疫过程发生的关键界面之一。在整个生命过程中，每一次呼吸都会吸入各种不需要的颗粒物，其中部分颗粒具有引发危及生命感染的潜力6。显然，在如此敏感且易受损害的部位，必须存在一个严密的防御机制网络，以展现完整的免疫应答谱系。另一方面，在这种“污染”程度较高的部位，对潜在病原体所引发的免疫反应必须受到严格调控。免疫系统的过度反应可能因非特异性免疫细胞活化而严重损伤器官组织，从而对机体自身造成重大伤害7,8。
基于上述考虑，若能有机会在真正活体条件下研究哺乳动物肺部中的细胞行为，将极具科学意义和实用价值。然而，此类系统迄今尚未成功建立，这一事实明确表明，在制定可行实验方案时必须克服巨大的技术难题。其中最具挑战性的问题可能是焦平面的稳定性。肺作为呼吸器官，在实现吸气功能时，会在空间的三个方向上持续运动。仅此一种情况就已造成严重的成像困难，堪称活体成像领域的“噩梦”。空间任意维度上的轻微移动，都会对显微观察产生显著的负面影响；而要获得有意义的图像，显微系统必须在微米级精度上保持视野稳定9。鉴于双光子显微镜本身具有极窄的焦深10，其对焦平面不稳定尤为敏感：在Z方向上仅数微米的结构位移，即相当于完全失焦，从而导致实验失败。
本研究中用于观察小鼠肺部免疫细胞的方案尚不属于体内应用，而是对功能完整肺组织内实际情况的近似模拟11. 离体 用于成像淋巴细胞的方法，例如在移植的淋巴结中，已显示出与真实情况相当的结果 体内 观察12 因此具有高度相关性5。该 原位 肺组织切片中的观察仅可通过我们的方法实现，这些观察在肺组织切除后不久的感染肺中进行。切割过程中肺组织的三维完整性由琼脂糖基质保障，这是实现肺组织精确可控切割的关键步骤。尽管需要将离体肺短暂冷却以使琼脂糖基质固化，但在切割完成并重新升温后，组织中的细胞仍可恢复至接近生理状态。我们的数据明确表明，在此条件下，中性粒细胞高度活跃，展现出其作为敏捷吞噬细胞的全部潜能，这对于有效清除感染至关重要 Aspergillus fumigatus 感染。它们在肺组织中巡逻，穿过上皮屏障以到达肺泡内部，进一步主动摄取真菌孢子¹¹。本研究的一个关键发现是在 曲霉属 感染器官。中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）是中性粒细胞中一种新型防御机制的最新发现13然而，自2004年首次描述以来，在动物模型或人类中观察到该现象或其缺失的生理或病理状况数量已呈爆炸式增长14-16有趣的是，尽管已有众多不同研究团队对这些结构进行了大量研究，但大多数报道仍停留在非常描述性的层面，关于NET释放的机制及其调控知之甚少。通过我们的实验方案，我们首次能够在感染的肺组织中观察到NET纤维。此外，我们还证实了新募集的中性粒细胞以及真菌的分子结构在其发生或抑制中的重要性11这清楚地展示了我们的方法在更详细地研究NET形成的各个单一步骤方面的潜力。例如，可以考虑使用合适基因敲除小鼠的中性粒细胞，通过过继转移实验来观察其形成NET的能力。
因此，尽管由于器官离体后缺乏血液供应，该系统无法直接观察中性粒细胞从外周血中的迁移过程，但我们仍然认为，本方案是一种有价值且相对易于操作的方法，可用于成像肺部感染免疫防御中的早期或晚期步骤。因此，这是在活体动物呼吸肺脏中研究这一现象的重要一步。
披露
我们无任何披露事项。
致谢
作者感谢Lars Philipsen博士在优化活体成像视频方面提供的帮助，感谢Jonathan Lindquist博士对稿件的仔细审阅，以及Gunzer实验室所有成员在方法开发过程中给予的有益讨论和意见。本研究由德国研究基金会（DFG，SFB 854）资助，资助对象为M.G。
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