EpiMark 5-hmC 和 5-mC 分析试剂盒可用于分析和定量特定基因座中的 5-甲基胞嘧啶（5-mC）和 5-羟甲基胞嘧啶（5-hmC）。该试剂盒通过利用β-葡萄糖基转移酶（T4-BGT）的酶促反应，将葡萄糖添加到 5-hmC 的羟基上，从而区分 5-mC 与 5-hmC。当 5-hmC 出现在 CCGG 序列背景下时，此修饰会将原本可被切割的 MspI 位点转化为不可被切割的位点。
本文内容
摘要
摘要
DNA羟甲基化是一种早已被认知的DNA修饰形式，但近年来已成为表观遗传学研究的焦点。哺乳动物DNA在5位th 胞嘧啶（C）残基的碳位点被甲基化为5-mC，主要发生在CpG二核苷酸背景下。5-mC可被Tet家族酶催化氧化为5-hmC，该类酶被认为参与发育及疾病过程。目前，5-hmC的生物学功能尚未完全阐明，但由于其作为生物标志物的潜力而受到广泛关注。这一关注源于多项突破性研究，这些研究在小鼠胚胎干细胞（ES）和神经元细胞中鉴定了5-羟甲基胞嘧啶（5-hydroxymethylcytosine）。
研究技术（包括亚硫酸氢盐测序方法）难以轻易区分 5-mC 与 5-hmC。目前存在少数可用于检测基因组中 5-羟甲基胞嘧啶整体含量的实验方案，例如将液相色谱与质谱分析联用，或对基因组 DNA 消化所得的单核苷进行薄层色谱分析。此外，已有靶向 5-羟甲基胞嘧啶的抗体，可用于点杂交分析、免疫荧光或羟甲基化 DNA 的沉淀实验；但这些抗体不具备单碱基分辨率。同时，分辨率还取决于免疫沉淀所得 DNA 片段的大小，而在微阵列实验中，还受探针设计的限制。由于目前尚不清楚 5-羟甲基胞嘧啶在基因组中的确切位置及其在表观遗传调控中的作用，因此亟需开发能够识别特定位点羟甲基化的新技术。EpiMark 5-hmC 和 5-mC 分析试剂盒为此提供了可在特定位点区分这两种修饰的解决方案。
EpiMark 5-hmC 和 5-mC 分析试剂盒是一种简单且稳健的方法，可用于特异性 DNA 位点内 5-甲基胞嘧啶和 5-羟甲基胞嘧啶的鉴定与定量。该酶法利用同切酶 MspI 和 HpaII 对甲基化的差异敏感性，通过一个简单的三步流程实现。
目的基因组DNA经T4-BGT处理，使5-羟甲基胞嘧啶（5-hmC）添加一个葡萄糖基团。该反应不依赖于序列，因此所有5-hmC均会被葡萄糖基化；而未修饰的DNA或含有5-甲基胞嘧啶（5-mC）的DNA则不受影响。
随后进行限制性内切酶消化。MspI 和 HpaII 识别相同的序列（CCGG），但对不同的甲基化状态具有敏感性。HpaII 仅切割完全未修饰的位点：任一胞嘧啶上的任何修饰（5-mC、5-hmC 或 5-ghmC）都会阻断其切割。MspI 可识别并切割 5-mC 和 5-hmC，但不能切割 5-ghmC。
实验方案的第三部分是通过PCR对目标位点进行检测。仅需20 ng的输入DNA即可进行实验。使用跨越目标CCGG位点（100-200 bp）的引物，对实验组（经葡萄糖基化并消化）和对照组（模拟葡萄糖基化并消化）的目标DNA进行扩增。如果CpG位点含有5-羟甲基胞嘧啶，则在葡萄糖基化和消化后可检测到扩增条带，而在未进行葡萄糖基化的对照反应中则检测不到。实时PCR可估算该特定位点中羟甲基胞嘧啶的含量。
在本实验中，我们将通过终点 PCR 分析小鼠 Babl/C 脑组织样本中的 5-羟甲基胞嘧啶含量。
方案
1. DNA 葡萄糖基化及对照反应
- 在冰上取一个1.5毫升的反应管，加入5–10微克基因组DNA（终浓度为30微克/毫升）、12.4微升UDP-葡萄糖（终浓度为80微摩尔）、31微升NEBuffer 4，以及无核酸酶水至终体积为310微升。
- 将上述反应体系均分为两份，每份155微升，分别加入两个反应管中。
- 向其中一管加入30单位（即3微升）T4-β-葡萄糖基转移酶，通过轻柔吹打充分混匀；另一管作为对照反应，加入3微升无核酸酶水代替T4-BGT。
- 将两管反应体系在37摄氏度孵育12至18小时，在此期间T4-BGT会将葡萄糖添加至样品中5-羟甲基胞嘧啶基团的羟基上。
2. 限制性酶切
- 标记三个0.2毫升PCR条形管，编号为1至3。将50 µl反应混合物分装至每个管中。
- 标记三个0.2毫升PCR条形管，编号为4至6。将50 µl对照混合物分装至每个管中。
- 向1号和4号管中各加入100单位（即1 µl）MspI。通过轻柔地反复吹打充分混匀。
- 向2号和5号管中各加入50单位（即1 µl）HpaII。通过轻柔地反复吹打充分混匀。
- 3号和6号管中不添加任何试剂，作为对照。
- 将全部6个管在37 °C条件下孵育至少4小时。
- 向每个管中加入1 µl蛋白酶K，并在40 °C条件下孵育30分钟。
- 在95 °C条件下孵育10分钟，以灭活蛋白酶K。
3. 通过 PCR/qPCR 分析 DNA
本方案采用NEB的LongAmp Taq 进行终点PCR，该酶已被证明性能良好。也可使用其他PCR方案。
- 在冰上向一个0.2毫升的PCR反应管中加入以下组分：10微升5X LongAmp Taq 反应缓冲液、1.5微升10毫摩尔dNTPs、1微升10微摩尔正向引物、1微升10微摩尔反向引物、3微升前一步骤获得的模板DNA、1微升LongAmp Taq DNA聚合酶，以及无核酸酶水补足至50微升。具体体积可根据所使用的PCR方案进行调整。
- 轻轻混匀反应体系。如有必要，可通过短暂离心将液体全部收集至管底。
- 若使用的PCR仪无加热盖，需在样本上覆盖矿物油。
- 将PCR管从冰上转移至预热至94摄氏度的PCR仪中，并启动循环程序。对于常规的三步PCR程序，应包括一个初始变性步骤：94摄氏度30秒；随后进行30个循环，每个循环包括94摄氏度变性15秒、55至65摄氏度退火30秒、65摄氏度延伸20秒，或按每千碱基50秒计算延伸时间；最后在65摄氏度进行一次终末延伸，持续5分钟。也可采用实时PCR定量5-甲基胞嘧啶和5-羟甲基胞嘧啶的含量。具体操作请参阅neb.com提供的产品说明书。
4. 典型结果：
图1. 不同 Balb/C 小鼠组织样本中位点12处5-羟甲基胞嘧啶含量的比较。（A）终点PCR。（B）实时PCR。
分析了四种小鼠组织的DNA。为了进行比较，将实时PCR数据归一化至未切割的DNA。采用标准曲线确定拷贝数。可通过将样品1-6的拷贝数除以未消化的对照样品（编号5）的拷贝数，对样品进行归一化处理。加框的凝胶泳道显示了5-羟甲基胞嘧啶（5-hmC）含量的差异。
讨论
在设置本实验时，有几个关键因素需要考虑。首先，基因组DNA的葡萄糖基化反应必须完全进行。T4-BGT的序列特异性尚不明确，且其对底物序列似乎没有选择性，因此在某些情况下可能需要更长的孵育时间。其次，MspI和HpaII的消化必须彻底，以避免背景信号的产生。对于这两种限制性内切酶，我们推荐孵育时间为4小时，但如果观察到切割不完全，可适当延长孵育时间。第三，输入DNA的用量可根据实际可获得量进行调整，因为终点PCR仅需20 ng DNA即可。最后，我们建议使用随试剂盒提供的对照DNA，可与基因组DNA平行运行，用于5-mC和5-hmC的定量分析。
披露
本文的两位作者 Ted 和 Romas 均为新英格兰生物实验室（NEB）的员工；Romas 是该试剂盒的主要开发者，Ted 则是负责监督该试剂盒开发工作的应用与研发部门主管。
致谢
Sriharsa Pradhan、Shannon Morey Kinney、Hang Gyeong Chin、Jurate Bitinaite、Yu Zheng、Pierre Olivier Esteve、Romualdas Vaisvila、Steven E. Jacobsen 实验室，加州大学洛杉矶分校。本工作部分由美国国立卫生研究院（NIH）资助，项目编号为 1R44GM095209-01。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| EpiMark™ 5-羟甲基胞嘧啶（5-hmC）和5-甲基胞嘧啶（5-mC）分析试剂盒 | 新英格兰生物实验室 | E3317 | |
| 针对目标CCGG位点侧翼区域的位点特异性引物 | 根据实验定制；由用户提供 | ||
| LongAmp® Taq DNA聚合酶 | 新英格兰生物实验室 | M0323 | |
| 脱氧核苷三磷酸混合物（dNTPs） | 新英格兰生物实验室 | N0447 | |
| 分子生物学级水 |
参考文献
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- Mathur, E. J. Gene. 108, 1-6 (1991).
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- Tahiliani, M., Koh, K. P., Shen, Y., Pastor, W. A., Bandukwala, H., Brudno, Y., Agarwal, S., Lyer, L. M., Liu, D. R. Science. 324, 930-935 (2009).
- Huang, Y., Pastor, W. A., Shen, Y., Tahiliani, M., Liu, D. R., Rao, A. PLoS One. 5 (1), e8888-e8888 (2010).
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