我们描述了一种简单的免疫测定方法，用于检测表现为自身炎症表型的患者体内促炎性细胞因子（如IL-1β）的产生。通过使用病原体相关分子模式（特别是脂多糖）激活全血培养中的细胞，可在全血上清液中方便地评估细胞因子的分泌情况。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
方法文章
准确且简便地利用全血刺激实验检测促炎性细胞因子 IL-1β
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
免疫细胞分泌可溶性介质引发的炎症过程，会导致皮肤、关节及其他组织出现多种表现，并引起细胞因子稳态的改变。先天免疫系统在识别病原体及其他内源性危险刺激信号中发挥关键作用。先天免疫细胞释放的主要细胞因子之一是白细胞介素（Interleukin, IL）-1。因此，我们采用全血刺激实验，以检测炎症细胞因子的分泌情况，特别是促炎细胞因子IL-1β的分泌1, 2, 3。
先天免疫系统存在遗传性功能障碍并导致自身炎症性综合征的患者，在单独受到脂多糖（LPS）刺激时，会表现出成熟IL-1β的过度释放。为了评估伴有炎症相关病理表现患者的先天免疫功能状态，我们采用一种特异性免疫检测方法，以检测细胞对病原体相关分子模式（PAMPs）的免疫应答，例如革兰氏阴性菌内毒素脂多糖（LPS）。这些PAMPs可被病原体识别受体（PRRs）识别，而PRRs存在于先天免疫系统细胞表面4, 5, 6, 7。激活炎性小体（一种将前体IL-1β加工为成熟、具有生物活性形式的多蛋白复合物）需要两个信号：第一信号为LPS，第二信号为ATP4, 5, 6, 8, 9, 10。
与需要耗费大量人力分离和培养特定细胞群的其他方法相比，全血检测法仅需对样本进行 minimal 的操作即可评估细胞因子的产生。该方法与其他全血刺激检测法有所不同：我们并非以 RPMI 培养基按比例稀释样本，而是直接从稀释后的全血中进行白细胞计数，从而在培养中刺激已知数量的白细胞2。本项特定全血检测的结果展示了一种新颖的技术，可用于阐明表现为自身炎症性病理生理特征的患者群体。
方案
1. 全血采集
- 从受累个体以及年龄和性别匹配的健康对照中采集至少 10 mL 外周血。静脉血应收集至含肝素钠的真空采血管中，避免使用 EDTA 等其他抗凝剂，并轻轻倒置数次以确保血液与肝素钠充分混匀。需注意，本检测中每个样本需设复孔，因此至少需要 10 mL 全血作为最低起始体积。
- 为获得最佳结果，样本应在采集后尽快处理。然而，经肝素抗凝的血液可在室温、避光条件下保存最多 24 小时，待后续处理（2）。
2. 全血的制备
- 将所有血液样本在室温下以3000 rpm（关闭刹车）离心10分钟。在不干扰白膜层的情况下，可从上层收集血浆，并储存以用于其他实验目的。血浆样本可暂时储存在-20°C或长期储存在-80°C
- 收集血浆后，通过将红细胞（RBC）沉淀和白膜层用无血清（不完全）RPMI 1640培养基（在环境温度下）重悬来洗涤样本。轻轻吹打收集管中的混合物，并转移至50 mL锥形管中。
- 用不完全RPMI 1640培养基定容至50 mL，并轻轻颠倒混匀以形成均匀的混合液。在3000 rpm（关闭刹车）下离心10分钟。确保有明显的分层后，小心吸除上清液，注意不要扰动白膜层。重复此步骤2-4次，以确保在刺激前去除所有污染物和结合的细胞因子。
- 最后一次洗涤后，用不完全RPMI 1640培养基重悬红细胞沉淀和白膜层，使总体积为20 mL（初始采集10 mL全血时）。可根据初始采集的血量按比例调整总体积。
- 使用Cellometer Vision仪器时，可通过选择吖啶橙（AO）白细胞计数模式，在不裂解红细胞的情况下对稀释后的血液进行计数。将一份稀释血液与一份AO混合，取20 μL的1:1混合液加入一次性计数板中。稀释后AO的最终浓度应为1μg/mL。
- 用不完全RPMI 1640培养基调整至最终细胞浓度为2.0 × 106 cells/mL。
3. 全血刺激
- 该实验至少需要设置四个条件（每个条件设复孔）：未刺激组、仅添加LPS组、仅添加ATP组，以及LPS与ATP联合添加组。将1 mL已稀释至2.0 × 106 cells/mL的全血加入24孔细胞培养板的相应孔中。
- 在开始刺激实验前，应将刺激剂复溶并恢复至室温。冻干的LPS和ATP应按照生产商说明书进行复溶。复溶后，可使用不完全RPMI 1640培养基将LPS和ATP进一步稀释至适当储存浓度。
- 向仅含LPS组以及LPS与ATP联合组的孔中加入LPS，使LPS的终工作浓度为1 μg/mL。总刺激时间为3小时，其中全血样本先在37°C、5% CO2培养箱中仅用LPS刺激2小时40分钟。
- 在3小时刺激期的最后20分钟加入ATP。向仅ATP组和LPS+ATP组孔中加入ATP，随后将样本放回培养箱。ATP的终工作浓度为2 mM。
- 3小时孵育结束后，将各孔中的上清液转移至1.5 mL微量离心管中，于室温下以10000 rpm离心2分钟，收集上清液并转移至另一组1.5 mL微量离心管中。
- 样本可立即进行检测，或暂时储存在-20°C，长期储存建议置于-80°C。
4. 细胞因子检测
- 冷冻样品在分析前需平衡至室温。IL-1β 的细胞因子浓度可通过多种方法进行检测。我们采用 Bio-Rad 公司的 Bio-Plex Pro 人细胞因子 x-plex 检测试剂盒，结合 Bio-Plex 200 系统，按照制造商提供的说明进行操作。在本方案中，我们重点检测 IL-1β；然而，我们使用该多重细胞因子检测试剂盒的优势在于，可在一次检测中同时测定多种细胞因子，并且仅需少量样品体积。
5. 典型结果
在成功使用LPS和ATP刺激后，IL-1β的产生分析显示，其剂量反应依赖于被刺激细胞的数量。我们发现，2.0 x 106 个细胞/mL的浓度足以产生最佳且可测量的IL-1β浓度以及其他细胞因子（图2）。
全血检测在研究表现为自身炎症性疾病的患者时具有重要价值。这些患者可能表现出先天免疫系统的缺陷，在仅用LPS刺激后，其IL-1β的产生量较对照组明显升高（图3），由此可对缺陷进行表征。
图1. 用于测定稀释全血样本中细胞浓度的有核白细胞AO染色代表性图像。
图2. 在不同细胞浓度下，健康供体全血上清液经LPS刺激后IL-1β产生的检测结果。样品均设三个复孔进行检测。
图3. 在两名健康正常对照者以及两名表现为IL-1β相关自身炎症症状的患者全血上清液中测得的IL-1β分泌的代表性结果。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
所述全血检测方法是一种简便的技术，与其他需要细胞分离及大量样本处理和操作的技术相比，该方法能更接近地模拟生理条件。本方法利用配备AO（乙酰丙酮）的Cellometer Vision对全血中的白细胞进行计数，从而提供了一种基于细胞数量准确标准化样本的方法。
需要注意的是，本实验应将全血采集至含钠肝素的采血管中，因为其他抗凝剂是已知的钙螯合剂，可能影响实验结果。应使用无血清培养基，因其可能影响细胞因子浓度。样本采集后立即处理也至关重要。尽管本方法采用LPS和ATP刺激全血并检测IL-1β浓度，但也可使用其他病原体和刺激物来测定不同细胞因子和趋化因子的应答；然而，刺激时间和条件可能需要相应调整。最后，反复冻融循环可能影响细胞因子浓度。
利用所述全血刺激实验检测IL-1β为其他方法提供了一种替代方案，是一种有效的免疫检测方法，可用于研究伴有炎症相关病理特征的疾病。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
致谢
本研究由美国国立卫生研究院下属的关节炎与肌肉骨骼及皮肤病研究所的院内研究计划资助。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 钠肝素血液收集管 | BD Biosciences | 366480 | |
| RPMI 1640 培养基 | GIBCO, by Life Technologies | 21870-100 | |
| 吖啶橙 | Invitrogen | A3568 | |
| Cellometer Vision | Nexcelom Bioscience | 请联系公司获取仪器信息 | |
| Cellometer 细胞计数板 | Nexcelom Bioscience | CHT4-SD100 | |
| 24 孔组织培养板 | Corning | 3524 | |
| 超纯 E. coli K12 LPS | Invitrogen | tlrl-eklps | |
| 腺苷-5´-三磷酸二钠盐水合物 | Sigma-Aldrich | A26209 | |
| Bio-plex 200 系统 | Bio-Rad | 请联系公司获取仪器信息 | |
| Bio-Plex Pro 人细胞因子 x-plex 检测试剂盒 | Bio-Rad | x-plex 检测试剂盒根据指定的感兴趣细胞因子定制 |
参考文献
- Martinon, F., Mayor, A., Tschopp, J. The inflammasomes: guardians of the body. Annu Rev Immunol. 27, 229-265 (2009).
- Thurm, C. W., Halsey, J. F. Measurement of cytokine production using whole blood. Curr Protoc Immunol. 66, 7-18 Forthcoming.
- Mariathasan, S. Cryopyrin activates the inflammasome in response to toxins and ATP. Nature. 440, 228-232 (2006).
- Gabay, C., Lamacchia, C., Palmer, G. IL-1 pathways in inflammation and human diseases. Nat Rev Rheumatol. 4, 232-241 (2010).
- Franchi, L., Elgenbrod, T., Muñoz-Planillo, R., Nuñez, G. The inflammasome: a caspase-1-activation platform that regulates immune responses and disease pathogenesis. Nat Immunol. 3, 241-247 (2009).
- Sims, J. E., Smith, D. E. The IL-1 family: regulators of immunity. Nat Rev Immunol. 2, 89-102 (2010).
- Haug, R., Joø, G. B., Westvik, A. B., Kierulf, P. Chemokine production and pattern recognition receptor (PRR) expression in whole blood stimulated with pathogen-associated molecular patterns (PAMPs. Cytokine. 32, 304-315 (2005).
- Netea, M. G. Differential requirement for the activation of the inflammasome for processing and release of IL-1bin monocytes and macrophages. Blood. 113, 2324-2335 (2009).
- Latz, E. The inflammasomes: mechanisms of activation and function. Curr Opin Immnol. 22, 28-33 (2010).
- Masters, S. L., Simon, A., Aksentijevich, I., Kastner, D. L. Horror autoinflammaticus: the molecular pathophysiology of autoinflammtory disease. Annu Rev Immunol. 27, 621-668 (2009).
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
