利用二次电喷雾电离质谱法（SESI-MS）表征细菌挥发性物质

摘要

二次电喷雾电离质谱法（SESI-MS）能够无需任何样品预处理即可检测挥发性有机化合物（VOCs）。本方案提供了利用SESI-MS快速（数分钟内）表征细菌挥发性有机化合物的操作指南。

摘要

二次电喷雾电离质谱法（SESI-MS）是一种用于快速检测挥发性化合物的方法，无需样品预处理。该方法最初由Fenn及其同事¹首次描述，已应用于非法药物²和爆炸物^3-4的检测、皮肤挥发物的表征⁵以及呼出气体的分析^6-7。

SESI 电离通过电喷雾溶液与挥发性分析物之间的质子转移反应发生，因此适用于杂合有机分子的分析，这与传统的电喷雾电离（ESI）相同。然而，与标准 ESI 不同的是，SESI 的质子转移过程发生在气相中而非溶液中（图 1），因此 SESI 最适合用于检测有机挥发物和气溶胶。

我们正在将实时电晕放电离子化质谱（SESI-MS）的应用扩展至细菌挥发性物质的检测，作为一种细菌鉴定与表征的方法⁸。我们已证明，结合统计分析方法的SESI-MS挥发性物质指纹图谱可用于在多种培养基中区分细菌属、种以及混合培养物⁸。本文提供了利用SESI-MS获取细菌挥发性指纹图谱的步骤，包括应优化的仪器参数，以确保实现可靠的细菌鉴定与表征。

方案

图1. 细菌挥发性物质的SESI-MS分析示意图。细菌培养物的顶空气体被CO₂（1）带入SESI反应室（2）。当挥发性物质穿过SESI反应室时，会经过电喷雾云并被离子化（3）。离子化后，挥发性物质被引入质谱仪进行分析（4）。多余的载气和未反应的细菌挥发性物质则通过一个0.22 μm滤膜（5），作为额外的保护措施，随后排入化学通风橱。插图：SESI电喷雾针为一根石英毛细管（内径40 μm），针尖已 sharpened。

为展示 SESI-MS 在细菌挥发性代谢物表征中的应用，将 E. coli K12 和 P. aeruginosa PAO1 在 37 °C 条件下，于 50 mL LB-Lennox 培养基中好氧培养 24 小时，并在 2 分钟内采集顶空气体中挥发性物质的 SESI-MS 谱图。使用二氧化碳（99.99 %）作为载气，流速为 2 L/min，将挥发物输送至反应室。SESI 反应室为自行设计构建，并安装于 API-3000（SCIEX）质谱仪上，取代原有的电喷雾离子源。谱图采集采用正离子模式，电喷雾溶液组成为 0.1 % 甲酸、5.0 % 甲醇和 94.9 % 水（v/v），通过一根带有 sharpened 针尖（40 μm 内径）的非导电石英毛细管以 5 nL/s 的流速输送。施加电压为 2.5 kV。使用 Analyst 1.4.2 软件（Applied Biosystems）进行数据采集，参数设置如下：质荷比范围 20–500 Da，MCA 模式，扫描次数 40 次，每扫描 3 秒，总分析时间为 2 分钟。

1. 培养系统

1. 根据实验中所用物种的生长需求（如通气、光照、温度等）以及挥发性物质向质谱仪的有效输送，选择适合培养样品的容器。我们选用的标准容器为100 mL的Pyrex培养瓶，配有带至少两个鲁尔接口的螺口盖。一根进气管通过其中一个鲁尔接口插入，用于向样品瓶输送载气；另一根出气管通过另一个接口插入，用于将挥发性有机物（VOC）输送至仪器（图1）。其他多余的接口应予以封闭。
2. 在接种样品前，需对容器加压并浸入水中检查是否存在泄漏。气体泄漏是导致挥发性离子信号微弱或缺失等异常结果的主要原因。

2. 生物学实验：设置与安全注意事项

1. 根据您的假设，在适当的条件下培养您的菌种。建议每个变量至少使用两个生物学重复，每个生物学重复包含两个技术重复。
2. 为每种培养条件（培养基、抗生素等）准备一个空白对照，并将空白对照与样品在相同条件下孵育。
3. 针对所使用的生物制剂采取适当的安全防护措施，并考虑相应物种的生物安全等级。
4. 为防止活性生物制剂污染仪器和气体传输管路，请在载气管路中安装适当孔径的过滤器。这些过滤器不会干扰挥发性物质向SESI反应室的传输，但可能会略微影响气溶胶传输的效率。⁶
5. 在将气体传输帽连接到培养瓶时，应使用二级 containment 或生物安全柜，以确保生物制剂发生泄漏时能够得到妥善 containment。
6. 启动和终止向样品瓶通入载气时，应避免瓶内产生压力积聚。

3. 仪器优化

注意：SESI-MS 专门用于采样挥发性物质，因此在使用仪器前应避免使用有香味的个人护理用品（如古龙水、漱口水、乳液、柔顺剂）、口香糖、香烟等。实验室内所有挥发性化学品必须严格密封，并在测试过程中尽可能控制空气流动。

以下所有影响信号强度和稳定性的仪器参数，均需根据您的仪器和实验进行优化。

1. 电喷雾溶液及流速：根据目标化合物的类别、仪器的工作极性（正离子或负离子模式）以及目标化合物的分子特性，选择合适的电喷雾溶液。本实验中使用的电喷雾溶液为 0.1% 甲酸、5.0% 甲醇、94.9% 水（v/v），该溶液可增强低极性分子的信号强度，同时提供良好的信号稳定性。溶液以 5 nL/s 的流速输送。
2. 载气流速：载气流速会影响电喷雾的稳定性和信号强度。本实验使用流速为 2 L/min 的 CO₂（≥ 99.99%）。
3. 针尖形状与位置：针尖的形状和位置对信号强度和稳定性有显著影响。安装新针时，必须优化针的位置，以在低背景、高分析物信号强度和信号稳定性之间取得平衡。为了在更换针后能够重现 SESI 谱图，需在调整针位置的过程中定期采集谱图，直至观测到的谱图与记录数据相匹配。电喷雾针尖至质谱仪进样口的距离应为 1 – 5 mm。
4. 施加电压：施加于系统的电压会影响信号离子强度以及电喷雾泰勒锥的稳定性。此外，最佳电压取决于所用的电喷雾溶液和针尖形状。在开始一系列实验之前，应确定能使系统获得最佳谱图和信号稳定性的电压，并在后续所有实验中使用该电压。对于本系统，施加 2.0 – 5.0 kV 的电压可获得最佳的信号强度和电喷雾稳定性。本实验采用 2.5 kV 的电压。

4. 启动并调节 SESI-MS 以进行分析

1. 首先确保电源已关闭，并且系统已放电。具体操作为：1）确认电源上的指示灯已熄灭，2）确认万用表上的电压为零，3）将电极导线接地。
2. 根据实验要求安装合适的电喷雾溶液。
3. 打开载气并调节流量至适合实验的流速。
4. 对电喷雾储液器施加压力，以启动电喷雾溶液向反应室的输送。
5. 打开电源，并将电压调节至适合实验的数值。

注意：此时电离源的金属表面可能带有危险电压，存在触电风险。一旦电源开启，在仪器周围操作时务必格外小心。

6. 在监测 SESI-MS 谱图的同时，建立调谐方法并对施加电压进行精细调节。使用您为系统和实验优化后的采集参数。取消勾选多重通道采集（MCA）复选框（如适用），以确保每次扫描生成独立的谱图，将采集时间设为 10 – 15 分钟，然后开始采集。此时应观察到载气背景的谱图。
7. 对施加电压进行精细调节，以获得稳定的总离子色谱图（TIC）以及与之前实验的 CO₂ 扫描结果一致且可重复的扫描谱图。完成电压调节后，继续采集谱图和 TIC 五分钟，以确保仪器已达到稳定状态。
8. 在确认仪器稳定性后，根据您的样品设置合适的采集方法，按需调整采集时间、数据范围和 MCA 选择。采集一份载气背景谱图以供记录。

5. 获取细菌培养物的挥发性指纹图谱

1. 采集空白谱图时，先将载气流通过旁路线，然后将空白样品（阀门关闭）连接至仪器的气体传输管线。
2. 打开样品瓶的阀门，同时关闭旁路线的阀门。
3. 让系统平衡30秒，在此期间反应室内的湿度趋于稳定。该平衡过程对于获得可重复的谱图至关重要。为确保系统已达到平衡，可监测总离子流（TIC），其在平衡过程中会发生变化，随后趋于稳定。
4. 系统平衡后，开始采集谱图。
5. 谱图采集完成后，先打开载气旁路线，再关闭样品阀门，最后取下样品瓶。用载气冲洗系统2–4分钟，以清除传输管线中的水分和吸附的挥发性物质，防止样品间的交叉污染。
6. 对每个细菌样品重复步骤5.2–5.5，期间间歇性地采集额外的空白谱图，以确保充分完成空白扣除。若空白扣除不完全，处理后的谱图中将出现化学背景峰，这类峰在常压电离技术中较为常见（例如邻苯二甲酸酯、硅酮类等）。⁹
7. 采集谱图时，需确保离子信号未超过仪器的线性检测范围，该范围由总离子流（TIC）及单个峰的最大强度确定。超出仪器检测器上限的离子可能产生不代表样品真实成分的伪影峰。

6. 代表性结果

作为细菌挥发性物质 SESI-MS 谱图的一个示例，图 2 展示了大肠杆菌（E. coli）和铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）在 LB-Lennox 培养基中于 37 °C 有氧条件下培养 24 小时后获得的正离子模式挥发性特征谱图。E. coli 的挥发性谱图在 m/z = 118 处以吲哚信号为主，该物质赋予 E. coli 培养物特有的气味；而 P. aeruginosa 的谱图则包含更多种类的可质子化峰。

请注意，挥发性物质谱图中各峰的相对强度取决于第3节所述的仪器参数。为了获得可重复的谱图，必须在每次实验之间严格控制这些参数。

图2. 扣除空白的正离子模式SESI-MS谱图（20 – 150 m/z） E. coli K12 和 P. aeruginosa PAO1 在 LB-Lennox 培养基中于 37 °C 有氧培养 24 小时后的挥发性物质。有关 SESI 谱图中观察到的峰的更多细节，请参见 Zhu， 等 ⁸.

讨论

细菌会产生不同组合的挥发性物质，这些物质可用于细菌鉴定^10-12以及代谢状态的评估。本文所述的电喷雾电离质谱（SESI-MS）方法能够在无需任何样品预处理的情况下，快速表征细菌挥发性成分（两分钟以内），生成可用于细菌种类鉴定的“指纹”图谱⁸。在过去几十年中，其他常压电离质谱技术也被用于挥发性化合物的表征，包括选择性离子流动管（SIFT）和质子转移反应（PTR）质谱法。与这些电离方法相比，SESI的独特优势在于能够对特定质谱峰进行碎裂分析（前提是已将适当类型的质谱仪与SESI联用），这对于化合物的鉴定具有重要意义。上述实验方案中未涉及峰的碎裂分析，有关如何利用碎裂信息进行细菌挥发性物质表征的示例，请参见Zhu, et al.⁸

SESI-MS 可直接应用于 原位 通过呼吸分析检测细菌性肺部感染，也可应用于任何可进行挥发性物质采样的场景。例如，与代谢紊乱、胃肠道疾病、癌症及环境暴露诊断相关的尿液、血液和呼吸中挥发性物质的分析，均适用于SESI-MS。^13,14 SESI-MS 还具有广泛的非临床挥发性有机物指纹分析应用，包括对食品中与成熟、老化或变质相关的特征性挥发物进行快速分析。^15-18

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
API-3000 三重四极杆	仪器	SCIEX		购于 Analyst 1.4.2（Applied Biosystems）
SESI 离子源	仪器			定制；参见参考文献6
气体流量计	仪器设备	Cole-Parmer	EW-03217-74
二氧化碳	仪器设备	Airgas	CD I300	≥ 99.99% 纯度
氮	仪器设备	Airgas	NI UHP300	超高纯度
100 mL 玻璃培养瓶	仪器设备	VWR 国际公司	89012-114	GL45螺纹
带鲁尔接口的瓶盖	仪器设备	生物化学微流控	00945T-3	帽组件组装
鲁尔接头塞	仪器设备	生物化学微流控	009LP	帽组件装配
管路 1/4" (OD) × 1/8" (ID)	仪器设备	Cole-Parmer	EW-95875-02	帽组件组装 &和气体传输管线
管路 1/8" (OD) × 1/16" (ID)	仪器设备	Cole-Parmer	EW-06605-27	帽状结构组装
双向阀	仪器设备	Cole-Parmer	07391-04	帽组件装配
滤膜，Grade AAQ	仪器设备	Balston 滤器	9922-05
甲酸，LC/MS 级	试剂	Fisher Scientific	A117-05AMP	电喷雾溶液
甲醇，LC/MS级	试剂	Fisher Scientific	A456-500	电喷雾溶液
水，LC/MS级	试剂	Fisher Scientific	W6-500	电喷雾溶液