二次电喷雾电离质谱法（SESI-MS）能够无需任何样品预处理即可检测挥发性有机化合物（VOCs）。本方案提供了利用SESI-MS快速（数分钟内）表征细菌挥发性有机化合物的操作指南。
本文内容
摘要
摘要
二次电喷雾电离质谱法（SESI-MS）是一种用于快速检测挥发性化合物的方法，无需样品预处理。该方法最初由Fenn及其同事1首次描述，已应用于非法药物2和爆炸物3-4的检测、皮肤挥发物的表征5以及呼出气体的分析6-7。
SESI 电离通过电喷雾溶液与挥发性分析物之间的质子转移反应发生，因此适用于杂合有机分子的分析，这与传统的电喷雾电离（ESI）相同。然而，与标准 ESI 不同的是，SESI 的质子转移过程发生在气相中而非溶液中（图 1），因此 SESI 最适合用于检测有机挥发物和气溶胶。
我们正在将实时电晕放电离子化质谱（SESI-MS）的应用扩展至细菌挥发性物质的检测，作为一种细菌鉴定与表征的方法8。我们已证明，结合统计分析方法的SESI-MS挥发性物质指纹图谱可用于在多种培养基中区分细菌属、种以及混合培养物8。本文提供了利用SESI-MS获取细菌挥发性指纹图谱的步骤，包括应优化的仪器参数，以确保实现可靠的细菌鉴定与表征。
方案
图1. 细菌挥发性物质的SESI-MS分析示意图。细菌培养物顶空气体被CO2（1）带入SESI反应室（2）。当挥发性物质穿过SESI反应室时，会经过电喷雾云并发生离子化（3）。离子化后，挥发性物质被引入质谱仪进行分析（4）。多余的载气和未反应的细菌挥发性物质则通过一个0.22 μm滤膜（5），作为额外的防护措施，随后排入化学通风橱。插图：SESI电喷雾针为一根石英毛细管（内径40 μm），针尖经过 sharpened 处理。
作为使用SESI-MS对细菌挥发性物质进行表征的示例， E. coli K12 和 P. aeruginosa PAO1在50 mL LB-Lennox培养基中需氧培养24 h 37 °C 顶空挥发物的 SESI-MS 谱图在 2 分钟内采集完成。使用纯度为 99.99% 的二氧化碳作为载气，流速为 2 L/min，将挥发物输送至反应室。SESI 反应室为自行设计构建，并适配于 API-3000（SCIEX）质谱仪，取代原有的电喷雾离子源。谱图在正离子模式下采集，电喷雾溶液组成为 0.1% 甲酸、5.0% 甲醇和 94.9% 水（v/v），通过带有锐化针尖的非导电石英毛细管以 5 nL/s 的速率输送40 μm ID）。施加电压为2.5 kV。采用Applied Biosystems公司的Analyst 1.4.2软件进行数据采集，参数设置如下：质荷比范围20–500 Da，MCA模式，扫描次数40次，每扫描耗时3秒，总分析时间2分钟。
1. 培养系统
- 根据实验中所用物种的生长需求（如通气、光照、温度等）以及挥发性物质向质谱仪的有效输送，选择适合培养样品的容器。我们选用的标准容器为100 mL Pyrex培养瓶，配有带至少两个鲁尔接口的螺口盖。一根进气管通过其中一个鲁尔接口插入，用于向样品瓶输送载气；另一根出气管通过另一个接口插入，用于将挥发性有机物（VOC）输送至仪器（图1）。其他多余的接口应予以封堵。
- 在接种样品前，需对容器加压并浸入水中检查是否存在泄漏。气体泄漏是导致挥发性离子信号微弱或缺失等异常结果的主要原因。
2. 生物学实验：设置与安全注意事项
- 根据您的假设，在适当的条件下培养您的菌种。建议每个变量至少使用两个生物学重复，每个生物学重复包含两个技术重复。
- 为每种培养条件（培养基、抗生素等）准备一个空白对照，并将空白对照与样品在相同条件下孵育。
- 针对所使用的生物制剂采取适当的安全防护措施，并考虑该物种的生物安全等级。
- 为防止活性生物制剂污染仪器和气体传输管路，请在载气管路中安装适当孔径的过滤器。这些过滤器不会干扰挥发性物质向SESI反应室的传输，但可能会略微影响气溶胶传输的效率。6
- 在将气体传输盖连接到培养瓶时，应使用二级 containment 或生物安全柜，以确保生物制剂发生泄漏时能够得到妥善 containment。
- 启动和终止向样品瓶通入载气时，应避免瓶内产生压力积聚。
3. 仪器优化
注意：SESI-MS 专门用于采样挥发性物质，因此在使用仪器前应避免使用有香味的个人护理用品（如古龙水、漱口水、乳液、柔顺剂）、口香糖、香烟等。实验室内所有挥发性化学品应严格密封，测试过程中尽可能控制空气流动。
以下所有会影响信号强度和稳定性的仪器参数，均需根据您的仪器和实验进行优化。
- 电喷雾溶液及流速：根据目标分子的类别、仪器的工作极性（正离子或负离子模式）以及目标化合物的分子特性，选择合适的电喷雾溶液。本实验中使用的电喷雾溶液为 0.1% 甲酸、5.0% 甲醇、94.9% 水（v/v），该溶液可增强低极性分子的信号强度，同时保持良好的信号稳定性。溶液以 5 nL/s 的流速输送。
- 载气流速：载气流速会影响电喷雾的稳定性和信号强度。本实验使用流速为 2 L/min 的 CO2（≥ 99.99%）。
- 针尖形状与位置：针尖的形状和位置对信号强度和稳定性有显著影响。安装新针时，必须优化针的位置，以在低背景、高分析物信号强度和信号稳定性之间取得平衡。为了在更换针后能够重现SESI谱图，需在调整针位置的过程中定期采集谱图，直至观测到的谱图与记录相符。电喷雾针尖至质谱仪进样口的距离应为 1 – 5 mm。
- 施加电压：施加于系统的电压会影响信号离子强度以及电喷雾泰勒锥的稳定性。此外，最佳电压取决于所用的电喷雾溶液和针尖形状。在开始一系列实验之前，应确定能使系统获得最佳谱图和信号稳定性的电压，并在后续所有实验中使用该电压。对于本系统，施加 2.0 – 5.0 kV 的电压可获得最佳的信号强度和电喷雾稳定性。本实验采用 2.5 kV 的电压。
4. 启动并调节 SESI-MS 以进行分析
- 首先确保电源已关闭，并且系统已放电。具体操作如下：1）确认电源上的指示灯已熄灭；2）使用万用表确认电压为零；3）将电气导线接地。
- 根据实验要求安装合适的电喷雾溶液。
- 打开载气并调节流量至适合实验的流速。
- 对电喷雾储液器施加压力，以启动电喷雾溶液向反应室的输送。
- 打开电源，并将电压调节至适合实验的数值。
注意：此时电离源的金属表面可能带有危险电压，存在触电风险。一旦电源开启，在仪器周围操作时务必格外小心。
- 在监测 SESI-MS 谱图的同时，设置调谐方法并对施加电压进行精细调节。使用您已为系统和实验优化的采集参数。取消选中“多通道采集”（Multiple Channel Acquisition, MCA）复选框（如适用），以确保每次扫描生成独立的谱图，将采集时间设为 10 – 15 分钟，然后开始采集。此时应观察到载气背景的谱图。
- 精细调节施加电压，以获得稳定的总离子流色谱图（TIC）和可重复的扫描结果，并使其与之前实验中的 CO2 扫描结果相匹配。完成电压调节后，继续采集谱图和 TIC 五分钟，以确保仪器已达到稳定状态。
- 确认仪器稳定后，根据您的样品设置合适的采集方法，按需调整采集时间、数据范围和 MCA 选择。采集一份载气背景谱图以供记录。
5. 获取细菌培养物的挥发性指纹图谱
- 采集空白谱图时，先将载气流通过旁路管线，然后将空白样品（阀门关闭）连接至仪器的气体传输管线。
- 打开样品瓶的阀门，同时关闭旁路管线的阀门。
- 让系统平衡30秒，在此期间反应室内的湿度趋于稳定。该平衡过程对于获得可重复的谱图至关重要。为确保系统已达到平衡，可监测总离子流（TIC），其在平衡过程中会发生变化，并在平衡后趋于稳定。
- 系统平衡后，开始采集谱图。
- 谱图采集完成后，先打开载气旁路管线，再关闭样品阀门，最后取下样品瓶。随后用载气冲洗系统2–4分钟，以清除传输管线中的水分和吸附的挥发性物质，防止样品间的交叉污染。
- 对每个细菌样品重复步骤5.2–5.5，并间歇性地采集额外的空白谱图，以确保空白扣除充分。若空白扣除不完全，处理后的谱图中将出现化学背景峰，这类峰在常压电离技术中较为常见（例如邻苯二甲酸酯、硅酮等）。9
- 采集谱图时，需确保离子信号未超过仪器的线性检测范围，该范围由总离子流（TIC）及单个峰的最大强度确定。超出仪器检测器上限的离子可能产生不代表样品真实成分的伪影峰。
6. 代表性结果
作为可获得的细菌挥发物SESI-MS谱图示例，图2展示了在37 °C下于LB-Lennox培养基中好氧培养24小时后，E. coli和P. aeruginosa的正离子模式挥发物指纹图谱。E. coli的挥发物谱图在m/z = 118处以吲哚峰为主，该物质赋予E. coli培养物特有的气味；而P. aeruginosa的谱图则包含更多种类的可质子化峰。
请注意，挥发性物质谱图中各峰的相对强度取决于第3节所述的仪器参数。为了获得可重复的谱图，必须在每次实验之间严格控制这些参数。
图2. 扣除空白的正离子模式 SESI-MS 谱图（20 – 150 m/z） E. coli K12 和 P. aeruginosa PAO1 在 LB-Lennox 培养基中需氧培养 24 小时后的挥发性物质 37 °C. 有关 SESI 谱图中观测到的峰的更多细节，请参见 Zhu， 等 8.
讨论
细菌会产生不同组合的挥发性物质，这些物质可用于细菌鉴定10-12以及代谢状态的评估。本文所述的电喷雾电离质谱（SESI-MS）方法能够在无需任何样品预处理的情况下，快速表征细菌挥发性成分（两分钟以内），生成可用于细菌种类鉴定的“指纹”图谱8。在过去几十年中，其他常压电离质谱技术也被用于挥发性化合物的表征，包括选择性离子流动管（SIFT）和质子转移反应（PTR）质谱法。与这些电离方法相比，SESI的独特优势在于能够对特定质谱峰进行碎裂分析（前提是已将适当类型的质谱仪与SESI联用），这对于化合物的鉴定具有重要意义。上述实验方案中未涉及峰的碎裂分析，有关如何利用碎裂信息进行细菌挥发性物质表征的示例，请参见Zhu, et al.8
SESI-MS 可直接应用于 原位 通过呼吸分析检测细菌性肺部感染，也可应用于任何可进行挥发性物质采样的场景。例如，与代谢紊乱、胃肠道疾病、癌症及环境暴露诊断相关的尿液、血液和呼吸中挥发性物质的分析，均适用于SESI-MS。13,14 SESI-MS 还具有广泛的非临床挥发性有机物指纹分析应用，包括对食品中与成熟、老化或变质相关的特征性挥发物进行快速分析。15-18
披露
未声明任何利益冲突。
致谢
本工作由美国国立卫生研究院（NIH）资助项目 P20 RR021905-01、CF RPD 资助项目 STANTO07R0 以及美国国家航空航天局（NASA）资助项目 NNH09ZNE002C 支持。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 | |
|---|---|---|---|---|
| API-3000 三重四极杆 | 仪器 | SCIEX | 购于 Analyst 1.4.2（Applied Biosystems） | |
| SESI 离子源 | 仪器 | 定制；参见参考文献6 | ||
| 气体流量计 | 仪器设备 | Cole-Parmer | EW-03217-74 | |
| 二氧化碳 | 仪器设备 | Airgas | CD I300 | ≥ 99.99% 纯度 |
| 氮 | 仪器设备 | Airgas | NI UHP300 | 超高纯度 |
| 100 mL 玻璃培养瓶 | 仪器设备 | VWR 国际公司 | 89012-114 | GL45螺纹 |
| 带鲁尔接口的瓶盖 | 仪器设备 | 生物化学微流控 | 00945T-3 | 帽组件组装 |
| 鲁尔接头塞 | 仪器设备 | 生物化学微流控 | 009LP | 帽组件装配 |
| 管路 1/4" (OD) × 1/8" (ID) | 仪器设备 | Cole-Parmer | EW-95875-02 | 帽组件组装 &和气体传输管线 |
| 管路 1/8" (OD) × 1/16" (ID) | 仪器设备 | Cole-Parmer | EW-06605-27 | 帽状结构组装 |
| 双向阀 | 仪器设备 | Cole-Parmer | 07391-04 | 帽组件装配 |
| 滤膜，Grade AAQ | 仪器设备 | Balston 滤器 | 9922-05 | |
| 甲酸，LC/MS 级 | 试剂 | Fisher Scientific | A117-05AMP | 电喷雾溶液 |
| 甲醇，LC/MS级 | 试剂 | Fisher Scientific | A456-500 | 电喷雾溶液 |
| 水，LC/MS级 | 试剂 | Fisher Scientific | W6-500 | 电喷雾溶液 |
参考文献
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