活性区的分离与成像 果蝇 神经肌肉接头

摘要

Drosophila melanogaster 的神经肌肉接头（NMJ）是研究正常突触功能以及某些神经系统疾病中突触功能异常的重要模型系统。本文介绍了一种用于解剖 Drosophila 幼虫运动系统的实验方案，以及对 NMJ 中活性区蛋白进行免疫染色的方法。

摘要

Drosophila 幼虫的神经肌肉接头（NMJ）是研究突触结构与功能的优良模型。Drosophila 因其易于进行强大的遗传操作而广为人知，其幼虫神经系统在研究正常功能以及伴随某些神经系统疾病发生的异常方面均已被证明特别有用（Lloyd 和 Taylor，2010）。在 Drosophila 中发现的许多关键突触分子在哺乳动物中也存在，并且与大多数哺乳动物中枢神经系统中的兴奋性突触类似，Drosophila 的 NMJ 是谷氨酸能的，并表现出依赖于神经活动的结构重塑（Koh 等，2000）。此外，由于 Drosophila 神经元的支配模式具有高度刻板性和重复性，因此可对单个神经元进行识别，从而能够研究特定的突触终末，例如运动神经元与其所支配的体壁肌纤维之间的突触（Keshishian 和 Kim，2004）。进化上保守的突触组分的存在，加上遗传和物理操作的便利性，使 Drosophila 模型成为探究突触功能潜在机制的理想体系（Budnik，1996）。

突触末梢的活性区尤为引人关注，因为这些区域是神经递质释放的位点。NC82 是一种单克隆抗体，可识别 黑腹果蝇 蛋白Bruchpilot（Brp），一种CAST/ERC家族成员，是突触活性区的重要组成成分（Wagh等 ，2006）。Brp被证明可直接塑造活性区的T形棒结构，并负责有效聚集Ca²⁺ T-bar 密度下方的通道（Fouquet）等 ，2009）。Brp突变体的Ca²⁺ 通道密度、抑制诱发囊泡释放以及短时程可塑性改变（Kittel等 ，2006年）。已在活性区观察到 alterations 黑腹果蝇 疾病模型。例如，使用 NC82 抗体进行的免疫荧光显示，在肌萎缩侧索硬化症和皮特-霍普金斯综合征模型中，活性区密度降低（Ratnaparkhi等 ，2008；Zweier等 ，2009）。因此，可对活性区或其他突触蛋白进行评估 果蝇 疾病幼虫模型可能为突触缺陷的存在提供有价值的初步线索。

制备用于神经肌肉接头免疫荧光分析的完整解剖 Drosophila 幼虫需要一定的技巧，但大多数科研人员经过少量练习后均可掌握。本文介绍了一种方法，可在同一解剖皿中同时解剖和免疫染色多只幼虫，从而限制不同基因型之间的环境差异，并提供足够数量的样本，以确保实验可重复性和统计分析的可靠性。

方案

1. 免疫荧光实验准备：

1. 为制备解剖表面，将Sylgard 184硅弹性体基质倒入小型组织培养皿中。注意不要将培养皿完全填满，以便解剖区域低于皿口边缘。
2. 将解剖针修剪至约3.5 mm长度，以方便操作，并确保每只幼虫至少准备6根解剖针。
3. 需要使用钝头镊子，以便在解剖过程中夹持解剖针。

2. 幼虫解剖：

1. 选取正在试管壁上爬行且尚未开始化蛹的三龄游走期幼虫。
2. 将一只幼虫置于体视显微镜下的解剖板上，用Kimwipe纸巾吸去多余水分。
3. 调整每只幼虫的位置，使其背面向上。此时可见两条气管，表现为沿幼虫背侧的白色线条。应尽量将这两条线居中，因为它们标记了背中线。
4. 在口钩上方稍处插入第1号大头针（图1）。
5. 在尾部气门上方、两气管之间的位置插入第2号大头针。
6. 向幼虫上加入少量PBS，以防止体壁干燥。
7. 对所有幼虫重复上述步骤，并通过在不同基因型之间插入大头针，确保各基因型在空间上相互分离。
8. 在第2号大头针稍上方、横跨两条气管处做一个小的横向切口（图1）。
9. 将剪刀插入第一个切口，沿两气管之间的背中线一直剪至第1号大头针上方。
10. 需要在体壁切口的最上端和最下端两侧各做几个小切口，以便左右两侧能够展开，从而在固定时不会牵拉体壁。
11. 在展开后的四个角分别插入第3、4、5和6号大头针。
12. 用4% PFA在室温下固定样本20–25分钟。
13. 倾去PFA溶液，用PBS清洗3–4次，每次均需彻底倾去液体。

3. 组织去除：

1. 首先移除后端的组织，因为通常需要保护脑部所在区域。
2. 在体视显微镜下操作，将幼虫置于一滴PBS液滴中，首先夹住一侧气管的后端并将其拉出，此过程可能同时带出部分脂肪体。对另一侧气管重复此操作。
3. 夹取部分后端脂肪体或肠道并将其从样本中拉出。当大部分后端组织被移除后，继续清除脑部周围的小块组织。如果仅关注肌肉或神经肌肉接头（NMJ）的形态，也可将脑组织一并移除。
4. 移除脑组织有助于更清晰地观察第31号肌肉，该肌肉是识别腹部体节方向的有用标志。

4. 活性区免疫荧光染色：

1. 在解剖皿中向已解剖的样本加入封闭剂（含5%正常山羊血清的PBS）。室温下封闭1小时。若希望仅配制一种溶液用于封闭和抗体稀释，则在封闭剂中加入0.1% TritonX-100以实现组织通透。
2. 将一抗用含0.1% TritonX-100的封闭剂稀释后加入样本。活性区抗体可通过发育研究杂交瘤库（DSHB, http://dshb.biology.uiowa.edu/）获得。使用参考抗体（例如辣根过氧化物酶-Cy3偶联物）标记神经肌肉接头膜和轴突。
3. 将样本在4°C下与一抗孵育过夜。为防止冰箱干燥导致抗体溶液蒸发，可在废弃的移液枪头盒底部加入少量水，制成湿盒。用铝箔覆盖半透明的盒盖，以减少荧光淬灭。将解剖载片放入湿盒中，并将整个盒子置于4°C孵育箱中过夜。
4. 次日早晨，用PBST（含0.2% Triton-X-100的PBS）洗涤5–10次，每次5–10分钟。
5. 在含0.1% TritonX-100的封闭剂中稀释二抗（例如Invitrogen Alexa山羊抗小鼠-488），于室温下在加盖的湿盒中孵育2–4小时。如需确定肌肉或脑组织中细胞核的位置，可在二抗溶液中加入核染料（例如DAPI）。
6. 用PBST（含0.02% Triton-X-100的PBS）洗涤5–10次，每次5–10分钟。

5. 将幼虫样品固定在载玻片上：

1. 倾去并用吸水纸吸干最后一次 PBST 清洗液。
2. 用移液器加入约 1 mL 80% 甘油，覆盖固定在板上的幼虫皮膜。
3. 将所有幼虫样本中的 6 枚针拔除 5 枚。
4. 当准备将第一种基因型的样本转移至载玻片时，移除该基因型所有幼虫剩余的最后一枚固定针。
5. 取一张洁净载玻片，滴加两滴封片介质，制成“清洗”用载片。此步骤对于清除幼虫表面的水溶液、便于封片及获得更清晰的成像至关重要。
6. 用钝头镊子夹住一条幼虫尾部，在甘油中轻轻拖动，再沿解剖皿干燥边缘擦拭，以去除大部分甘油。随后将幼虫放入第一滴封片介质中。
7. 对同一基因型的所有幼虫重复步骤 6。
8. 待所有幼虫均置于第一滴封片介质后，用镊子夹住第一条幼虫尾部，将其拉过液滴并沿解剖皿干燥边缘拖动，以去除大部分介质，然后转移至第二滴封片介质中。
9. 对同一基因型的所有幼虫重复步骤 8。
10. 在最终载玻片上做好标记，并在玻片上放置少量呈“T”形的封片介质，以备使用。
11. 同步骤 5.8，用镊子夹住幼虫尾部，将其皮膜穿过第二滴封片介质，再沿“清洗”载片的干燥边缘拖动，待大部分介质被去除后，将幼虫皮膜置于最终载玻片的封片介质中。
12. 对所有幼虫皮膜重复此操作。
13. 确保所有幼虫皮膜按所需方向排列，表皮面朝下，暴露的肌肉面朝上。
14. 将盖玻片覆盖在载玻片的解剖样本上，起始边缘对准“T”形上端的横线。
15. 在盖玻片上放置一个小重物（例如 9 伏电池），确保封片介质完全扩散至盖玻片下方。
16. 为减少可能的荧光淬灭，将载玻片置于抽屉或暗处，直至封片介质完全固化。
17. 清理溢出盖玻片边缘的封片介质，并用 70% 乙醇擦去盖玻片或载玻片表面多余的干燥介质。
18. 为实现最终密封，使用指甲油封边。

6. 代表性结果：

图2展示了经解剖和免疫染色处理的幼虫样本切片示例。若幼虫解剖、染色及封片操作得当，使用者可在第A2至A6节段中识别出目标幼虫肌肉（图3）。Hoanget al. 对肌肉位置以及特定突触小体的特征提供了详细描述（Hoang 和 Chiba，2001）。使用高倍物镜时，使用者可聚焦于单个突触，并采集z轴层扫图像。图4显示了突触6/7部分区域的最大强度投影图像。随后，利用成像软件可对活性区进行定量分析，评估其与特定突变表型相关的特征。在特定突变表型中可能发生改变的特征示例包括活性区的总数、荧光强度以及活性区之间的间距。

潜在问题：

幼虫神经肌肉接头的免疫荧光评估是一种有价值的系统，可为突触生物学提供重要见解，尽管该系统可能存在一些潜在缺陷，从而限制其应用效果。例如，通常需要在同一标本中观察两种或多种一抗的染色模式。选择合适的一抗、合适的荧光染料以及适当的阴性对照对于实验成功至关重要。

如果在实验中同时对两种抗原进行成像，务必确保所用的一抗来自不同物种，以便每种目标蛋白均可通过特异性的荧光标记二抗进行唯一识别。推荐使用含有二抗来源物种的正常血清作为封闭剂，以降低背景信号（例如，当使用山羊抗兔或抗小鼠的二抗时，选用正常山羊血清作为封闭剂）。

在规划实验中将要使用的初级抗体和次级抗体后，还必须考虑在染色实验中设置对照，以确保所观察到的荧光信号是真实的，而非背景信号。如果可能，应包括不含目标蛋白的阴性对照样本。在研究外源性转基因过表达时，可通过设置野生型动物作为对照，而在某些情况下，也可使用目标蛋白的纯合突变体。另一种重要的阴性对照是仅使用次级抗体而不加初级抗体，以评估荧光信号的背景水平。在对制备的样品进行成像时，需注意所观察到的所有荧光信号可能并非真实信号，而可能来源于次级抗体的非特异性结合或组织自身的内源性背景荧光。因此，在分析荧光强度变化时，可能需要对图像进行归一化处理，以校正背景荧光的影响。

荧光染料的选择也必须谨慎。必须考虑每种荧光染料的激发和发射光谱，以及能否独立检测每种信号，以避免通道间串色。如果存在任何不确定性，一种简单的判断串色程度的方法是：每次仅使用一种荧光标记抗体进行免疫染色，并用最终实验中将使用的各个通道分别观察图像。这将揭示在所用显微镜滤光片组下是否发生串色现象。

图1. 角质层切开及大头针1-6放置的流程图。点击此处查看大图

图 2. 幼虫在最终载玻片上的放置方式。确保幼虫样本的肌肉面朝上，角质层面向下。每个样本之间至少保留一个幼虫体宽的距离。

图3. 成像时，定位感兴趣的肌肉及体节。常见的可被表征的神经肌肉接头支配肌肉6/7、肌肉13、肌肉12或肌肉4。在腹侧中线的对侧，存在与所示半体节相对称的镜像肌肉结构。可利用肌肉31作为标记，确定正在成像的体节位置。对后续所有样本，应成像相同的突触和体节，为每种基因型收集大量可用于定量分析的突触图像。

图 4. 显示支配肌肉6/7的神经肌肉接头（NMJ）部分的代表性最大投影图像。NC82（Bruchpilot）染色显示为绿色，HRP突触前染色显示为红色。请注意，这些活性区斑点可通过成像软件进一步定量分析。

讨论

对于神经元而言，突触终末区域至关重要，它是突触前细胞与突触后细胞之间正常通讯的桥梁。在疾病模型中研究神经元健康状况的一种有力方法是通过免疫荧光技术分析突触终末的蛋白质。本文所介绍的免疫荧光方法使研究人员能够同时检测大量幼虫，并最大限度地减少不同组别之间的环境差异。Drosophila 三龄幼虫的中枢神经系统具有多种优势，包括存在谷氨酸能突触、结构已知且重复性高的突触终末、易于操作、实验可重复性强以及强大的遗传操控能力。特别是在 Drosophila 神经元疾病模型中，活性区蛋白 Bruchpilot 的表达水平会发生改变。由于该方法可同时分析大量幼虫，因此能够帮助研究人员检测出不同组别之间细微的差异，这些差异可能反映出神经元健康状态的根本性缺陷。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Sylgard 184 硅酮弹性体基础液	Dow Corning	68037-59-2	混合后，置于慢速旋转器上缓慢旋转，或静置30分钟以上，使气泡缓慢逸出。
不锈钢显微钉针	Fine Science Tools	26002-10	使用普通剪刀修剪至约3–4 mm长度
椎板切除钳（钝头，用于夹持钉针）	Fine Science Tools	11223-20	作为钝头镊使用，用于夹持钉针
解剖镊	World Precision Instruments, Inc.	501985
超细Vannas剪刀，8 cm长	World Precision Instruments, Inc.	501778
鼠抗Brp抗体	DSHB	NC82	使用1:50稀释度
Cy3标记的亲和纯化山羊抗辣根过氧化物酶抗体	Jackson ImmunoResearch	123-165-021	使用1:200稀释度
Alexa Fluor 488标记的山羊抗小鼠IgG抗体	Invitrogen	A11001	使用约1:200稀释度