活性区的分离与成像 果蝇 神经肌肉接头

摘要

Drosophila melanogaster 的神经肌肉接头（NMJ）是研究正常突触功能以及某些神经系统疾病中突触功能异常的重要模型系统。本文介绍了一种用于解剖 Drosophila 幼虫运动系统的实验方案，以及对 NMJ 中活性区蛋白进行免疫染色的方法。

摘要

Drosophila 幼虫的神经肌肉接头（NMJ）是研究突触结构与功能的优良模型。Drosophila 因其易于进行强大的遗传操作而广为人知，其幼虫神经系统在研究正常功能以及伴随某些神经系统疾病发生的异常方面均已被证明特别有用（Lloyd 和 Taylor，2010）。在 Drosophila 中发现的许多关键突触分子在哺乳动物中也存在，并且与大多数哺乳动物中枢神经系统中的兴奋性突触类似，Drosophila 的 NMJ 是谷氨酸能的，并表现出依赖于神经活动的结构重塑（Koh 等，2000）。此外，由于 Drosophila 神经元的支配模式具有高度刻板性和重复性，因此可对单个神经元进行识别，从而能够研究特定的突触终末，例如运动神经元与其所支配的体壁肌纤维之间的突触（Keshishian 和 Kim，2004）。进化上保守的突触组分的存在，加上遗传和物理操作的便利性，使 Drosophila 模型成为探究突触功能潜在机制的理想体系（Budnik，1996）。

突触末梢的活性区尤为引人关注，因为这些区域是神经递质释放的位点。NC82 是一种单克隆抗体，可识别 黑腹果蝇 蛋白Bruchpilot（Brp），一种CAST/ERC家族成员，是突触活性区的重要组成成分（Wagh等 ，2006）。Brp被证明可直接塑造活性区的T形棒结构，并负责有效聚集Ca²⁺ T-bar 密度下方的通道（Fouquet）等 ，2009）。Brp突变体的Ca²⁺ 通道密度、抑制诱发囊泡释放以及短时程可塑性改变（Kittel等 ，2006年）。已在活性区观察到 alterations 黑腹果蝇 疾病模型。例如，使用 NC82 抗体进行的免疫荧光显示，在肌萎缩侧索硬化症和皮特-霍普金斯综合征模型中，活性区密度降低（Ratnaparkhi等 ，2008；Zweier等 ，2009）。因此，可对活性区或其他突触蛋白进行评估 果蝇 疾病幼虫模型可能为突触缺陷的存在提供有价值的初步线索。

制备用于神经肌肉接头免疫荧光分析的完整解剖 Drosophila 幼虫需要一定的技巧，但大多数科研人员经过少量练习后均可掌握。本文介绍了一种方法，可在同一解剖皿中同时解剖和免疫染色多只幼虫，从而限制不同基因型之间的环境差异，并提供足够数量的样本，以确保实验可重复性和统计分析的可靠性。

方案

1. 免疫荧光实验准备：

1. 为制备解剖表面，将Sylgard 184硅弹性体基质倒入小型组织培养皿中。注意不要将培养皿完全填满，以便解剖区域低于皿口边缘。
2. 将解剖针修剪至约3.5 mm长度，以方便操作，并确保每只幼虫至少准备6根解剖针。
3. 需要使用钝头镊子，以便在解剖过程中夹持解剖针。

2. 幼虫解剖：

1. 选取正在试管壁上爬行且尚未开始化蛹的三龄游走期幼虫。
2. 将一只幼虫置于体视显微镜下的解剖板上，用Kimwipe纸巾吸去多余水分。
3. 调整每只幼虫的位置，使其背面向上。此时可见两条气管，表现为沿幼虫背侧的白色线条。应尽量将这两条线居中，因为它们标记了背中线。
4. 在口钩上方稍处插入第1号大头针（图1）。
5. 在尾部气门上方、两气管之间的位置插入第2号大头针。
6. 向幼虫上加入少量PBS，以防止体壁干燥。
7. 对所有幼虫重复上述步骤，并通过在不同基因型之间插入大头针，确保各基因型在空间上相互分离。
8. 在第2号大头针稍上方、横跨两条气管处做一个小的横向切口（图1）。
9. 将剪刀插入第一个切口，沿两气管之间的背中线一直剪至第1号大头针上方。
10. 需要在体壁切口的最上端和最下端两侧各做几个小切口，以便左右两侧能够展开，从而在固定时不会牵拉体壁....

讨论

对于神经元而言，突触终末区域至关重要，它是突触前细胞与突触后细胞之间正常通讯的桥梁。在疾病模型中研究神经元健康状况的一种有力方法是通过免疫荧光技术分析突触终末的蛋白质。本文所介绍的免疫荧光方法使研究人员能够同时检测大量幼虫，并最大限度地减少不同组别之间的环境差异。Drosophila 三龄幼虫的中枢神经系统具有多种优势，包括存在谷氨酸能突触、结构已知且重复性高的突触终末、易于操作、实验可重复性强以及强大的遗传操控能力。特别是在 Drosophila 神经元疾病模型中，活性区蛋白 Bruchpilot 的表达水平会发生改变。由于该方法可同时分析大量幼虫，因此能够帮助研究人员检测出不同组别之间细微的差异，这些差异可能反映出神经元健康状态的根本性缺陷。

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材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Sylgard 184 硅酮弹性体基础液	Dow Corning	68037-59-2	混合后，置于慢速旋转器上缓慢旋转，或静置30分钟以上，使气泡缓慢逸出。
不锈钢显微钉针	Fine Science Tools	26002-10	使用普通剪刀修剪至约3–4 mm长度
椎板切除钳（钝头，用于夹持钉针）	Fine Science Tools	11223-20	作为钝头镊使用，用于夹持钉针
解剖镊	World Precision Instruments, Inc.	501985
超细Vannas剪刀，8 cm长	World Precision Instruments, Inc.	501778
鼠抗Brp抗体	DSHB	NC82	使用1:50稀释度
Cy3标记的亲和纯化山羊抗辣根过氧化物酶抗体	Jackson ImmunoResearch	123-165-021	使用1:200稀释度
Alexa Fluor 488标记的山羊抗小鼠IgG抗体	Invitrogen	A11001	使用约1:200稀释度