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方法文章

利用小鼠早期胚胎对组织特异性基因进行染色质免疫沉淀实验

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DOI：

10.3791/2677

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2011年4月29日

 ,  , 
1Department of Cell Biology, University of Massachusetts Medical School

本文内容

摘要

我们展示了一种染色质免疫沉淀（ChIP）方法，用于鉴定小鼠胚胎组织中组织特异性基因表达启动期间或之后，组织特异性基因上的因子相互作用。该方案在正常胚胎发育过程中研究组织特异性基因激活时具有广泛的适用性。

摘要

染色质免疫沉淀（ChIP）是一种强大的工具，可用于鉴定在活细胞环境中发生的蛋白质与染色质之间的相互作用1-3。该技术已在组织培养细胞中得到广泛应用，而在原代组织中的应用则相对较少。将ChIP应用于啮齿类动物的胚胎组织，尤其是在发育早期阶段，由于组织量有限以及胚胎中细胞和组织类型的异质性，操作较为复杂。本文介绍了一种利用胚胎第8.5天（E8.5）解离胚胎进行ChIP的方法。单个E8.5胚胎的剪切染色质可分成最多五份等分试样，从而为研究者提供足够的材料用于对照实验以及特定蛋白质与染色质相互作用的研究。

我们已利用该技术开始记录组织特异性基因表达程序建立过程中蛋白质与染色质之间的相互作用。由于胚胎中细胞类型的异质性，该技术的应用必然受到限制，因为检测结果无法区分这些蛋白质与染色质的相互作用是发生在所有细胞、某一细胞亚群，还是特定单一细胞类型中。然而，在组织特异性基因表达启动期间或之后研究组织特异性基因仍是可行的，原因有两点：第一，对组织特异性因子进行免疫沉淀必然能够富集该因子所表达的细胞类型中的染色质；第二，对与基因激活相关的转录共激活因子以及带有翻译后修饰的组蛋白进行免疫沉淀，应仅能在基因及其调控序列所在的、该基因正在或已经激活的细胞类型中检测到。该技术应适用于大多数组织特异性基因激活事件的研究。

在下述示例中，我们利用 E8.5 和 E9.5 小鼠胚胎检测了骨骼肌特异性基因启动子上的因子结合情况。体节是形成躯干和四肢骨骼肌的前体组织，在 E8.5–9.5 时期已存在4,5。Myogenin 是骨骼肌分化所必需的一种调控因子6–9。实验结果表明，在 E8.5 和 E9.5 胚胎中，myogenin 与其自身启动子存在结合。由于在此发育阶段，myogenin 仅在体节中表达6,10，因此该结果说明，在 E8.5 胚胎的骨骼肌前体细胞中，myogenin 与其自身启动子的相互作用已经发生。

方案

1. 胚胎的分离

注意：所有涉及小鼠的操作均应遵循适当的动物护理与使用政策及规程

  1. 在交配后的第二天早晨检查雌性小鼠是否存在交配栓，并通过将已交配的雌鼠转移到不同的笼子中，使其与种鼠分离。观察到交配栓当天的中午被视为胚胎发育的0.5天（E0.5）。
  2. 在E8.5（或根据需要选择其他发育阶段），按照批准的实验方案处死小鼠。
  3. 用70%乙醇润湿已处死动物的腹部，并打开腹腔。沿着每侧子宫角可见呈“串珠状”排列的着床部位，提示存在发育中的胚胎（图1A）。使用剪刀取出两侧子宫角，分别切割每个着床部位以实现分离（图1B），并将它们置于含有室温（RT）解剖培养基（DMEM，10%胎牛血清，20 mM HEPES pH 7.4，60 μg/ml 青霉素，2 mM 链霉素）的100 mm培养皿中。
  4. 使用镊子将每个胚胎及其周围膜组织从子宫组织中取出（图1C），并放入新鲜的解剖培养基中。
  5. 在解剖显微镜下使用镊子分离单个胚胎。在此发育阶段，胚胎被壁层卵黄囊包围，后者与蜕膜组织接触，此外还包括脏层卵黄囊和羊膜。羊膜是一层透明的膜，直接与胚胎接触。脏层卵黄囊位于羊膜与壁层卵黄囊之间，在E8.5至E9.5的胚胎中可通过其上明显的血管结构轻易识别，这些血管为胚胎提供营养。将每个胚胎从其周围的膜结构中剥离，并单独转移至含有解剖培养基的新培养皿中，以去除多余血液。胚胎的发育阶段可能在个体之间以及不同胎仔间存在差异；图1D展示了典型的E8.5胚胎和一个典型的E9.5胚胎。
  6. 将每个胚胎转移至含有200 μl解剖培养基（见上述第4步描述）的1.5 ml离心管中。

2. 分离胚胎的匀浆处理

  1. 向每个离心管中加入20单位的II型胶原酶（溶于200 μl 1×杜尔贝科磷酸盐缓冲液；DPBS）。
  2. 将样品置于37°C摇床中，以100 rpm轻轻振荡20分钟。
  3. 用移液器反复吹打，充分重悬细胞，以打散细胞团块。
  4. 将细胞悬液加至置于1.5 ml离心管上方的无菌细胞滤网（孔径40 μm）顶部。
  5. 立即在细胞滤网上方加入600 μl室温1× DPBS，以完成过滤。弃去滤网。
  6. 在4°C、4000 × g条件下离心样品5分钟。
  7. 弃去上清液。
  8. 用1 ml室温1× DPBS重悬沉淀。
  9. 在室温下以4000 × g离心1分钟。
  10. 弃去上清液。
  11. 用200 μl室温解剖培养基重悬沉淀。
  12. 计数胚胎细胞。每个E8.5胚胎平均可获得3-5 × 106 个细胞。

3. 交联染色质

  1. 向200 μl样品中加入5.6 μl的37%甲醛，使甲醛终浓度为1%。
  2. 在室温下孵育样品10分钟。
  3. 在4°C、4000 × g条件下离心样品3分钟。
  4. 弃去上清液。
  5. 用含有80 μl/ml蛋白酶抑制剂混合物（PIC）的冷1X DPBS重悬细胞。
  6. 在4°C、4000 × g条件下离心样品3分钟。
  7. 弃去上清液。此步骤后，样品可在-80°C冷冻保存。冷冻的交联样品可稳定保存数月。

4. 超声处理

  1. 将细胞沉淀重悬于100 μl室温SDS裂解缓冲液中（50 mM Tris-HCl (pH 8.1)、10 mM EDTA和1% SDS，加入新鲜配制的蛋白酶抑制剂混合物（PIC），添加量为每800 μl总体积加入1 μl PIC）。重悬后，再加入100 μl室温SDS裂解缓冲液以促进充分重悬。通过移液和颠倒充分混匀。
  2. 将细胞悬液置于冰上孵育10分钟。
  3. 使用Diagenode Bioruptor™ UCD200对裂解的细胞进行超声处理，以将DNA剪切至200–500个碱基对之间（5分钟，重复8次：高功率（320瓦）下设定振幅，开启30秒，关闭30秒）。样品周围应始终保持冰浆环境。确保样品温度不高于4°C，也不冻结。市面上有多种类型的超声仪可供使用。应根据所用超声仪的具体型号优化超声条件，以使交联DNA剪切至约500 bp的长度。
  4. 将超声处理后的样品在4°C、14000 × g条件下离心10分钟。
  5. 将上清液转移至预先在冰上冷却的新Eppendorf管中。
  6. 将超声处理后的样品最多分为5份等分试样。经实验确定，一个E8.5胚胎的样品可均分为5份。对于更小或更大的样品量，可相应按比例调整。在此步骤中，样品可于-80°C保存，直至后续使用。
  7. 保留其中一份等分试样作为input对照，于-20°C保存，直至第6步进行交联逆转。将其余等分试样用ChIP稀释缓冲液（16.7 mM Tris-HCl (pH 8.1)、1.2 mM EDTA、1.1% Triton X-100、167 mM NaCl和0.01% SDS）稀释10倍，缓冲液中需加入新鲜配制的PIC，添加量为每800 μl缓冲液加入1 μl PIC。

5. 预清除与免疫沉淀

  1. 在 4°C 下，将稀释后的上清液与 75 μl 鲑精 DNA/Protein A 或 G 琼脂糖-50% 悬液混合，旋转孵育 1 小时，进行预清除。应根据染色质免疫沉淀（ChIP）所用抗体的类型选择 Protein A 或 Protein G 磁珠。例如，推荐使用 Protein A 磁珠用于兔源抗体，而推荐使用 Protein G 磁珠用于山羊抗体或小鼠 IgG1 抗体。更详细的信息请参见磁珠生产商的建议。
  2. 在 4°C 下以 2500 × g 离心 1 分钟。
  3. 将上清液转移至新的预冷的微量离心管中。
  4. 向预清除的样品中加入抗体（4 μg/样本），在 4°C 下旋转孵育过夜。

6. 洗涤染色质-蛋白质-磁珠复合物

  1. 向每个小瓶中加入 60 μl 鲑鱼精子 DNA/Protein A 或 G 琼脂糖悬液，在 4°C 下旋转孵育 1 小时。使用的磁珠类型应与上述第 3 步中预清除所用的磁珠类型相同。
  2. 在 4°C 下以 1000 × g 离心 1 分钟。
  3. 小心移去上清液并弃除。将 DNA-蛋白-磁珠复合物置于冰上保存。
  4. 按照以下指示，用洗涤缓冲液 1、2、3 和 4 对沉淀进行重悬和洗涤。洗涤缓冲液 1–3 应预冷至 4°C，洗涤操作也应在 4°C 下进行。洗涤缓冲液 4 应置于室温，洗涤操作也应在室温下进行。每次洗涤均在相应温度下旋转孵育 5 分钟。每次洗涤后，在 4°C（洗涤缓冲液 4 的洗涤步骤在室温）下以 1000 × g 离心 1 分钟，然后小心吸除或移去上清液。

缓冲液 1：低盐洗涤缓冲液（20 mM Tris-HCl (pH 8.1), 2 mM EDTA, 1% Triton X-100,
150 mM NaCl 和 0.1% SDS），每次 1 ml，洗涤 2 次。
缓冲液 2：高盐洗涤缓冲液（20 mM Tris-HCl (pH 8.1), 2 mM EDTA, 1% Triton X-100,
500 mM NaCl 和 0.1% SDS），每次 1 ml，洗涤 2 次。
缓冲液 3：LiCl 洗涤缓冲液（10 mM Tris-HCl (pH 8.1), 1 mM EDTA, 1% IGEPAL-CA630,
0.25 M LiCl 和 1% 脱氧胆酸钠），每次 1 ml，洗涤 1 次。
缓冲液 4：TE 缓冲液（10 mM Tris-HCl (pH 8.1), 1 mM EDTA），每次 1 ml，洗涤 2 次。

7. 染色质-抗体复合物的洗脱

  1. 将洗涤后的染色质-蛋白-磁珠复合物重悬于 250 μl 新鲜配制的洗脱缓冲液（1% SDS，0.1 M NaHCO3）中。剧烈涡旋震荡样品 5 秒，然后在室温下旋转孵育 15 分钟。
  2. 在室温下以 2500 × g 离心 1 分钟，并将洗脱液转移至新的微量离心管中。
  3. 重复步骤 1 和 2，并将洗脱液合并至同一微量离心管中。洗脱液应保持在室温下。完成此步骤后，洗脱液可于 -20°C 保存，直至后续使用。

8. 反向交联并回收 DNA

  1. 向500 μl 洗脱液中加入20 μl 5 M NaCl（输入对照为40 μl/ml）。
  2. 将洗脱液置于65°C水浴中加热4小时至过夜。
  3. 可取每个样品（包括输入对照）10 μl，在2%琼脂糖凝胶上电泳，同时使用0.1至1 kbp的DNA分子量标记检测DNA片段大小。DNA将呈现为弥散条带而非清晰单一带型。其余样品可在凝胶电泳期间继续置于65°C保温。
  4. 使用QIAquick Gel Extraction Kit（Qiagen）从各样品中回收DNA。向500 μl样品中加入600 μl QG缓冲液（试剂盒提供）以优化DNA在QIAquick离心柱硅胶膜上的吸附，并加入200 μl异丙醇。注意：QG缓冲液含有pH指示剂，可方便判断样品pH。若混合后样品颜色由黄色变为紫色（pH > 7.5），则向样品中加入10 μl 3 M NaAcetate（pH 5.2）并混匀。此操作可降低混合液pH，以最大化DNA与柱内微珠的结合效率。
  5. 在上样前，检查混合液中是否存在SDS沉淀。若出现SDS沉淀，应将样品置于42°C水浴中加热至沉淀完全消失。
  6. 将700 μl混合液加入QIAquick离心柱（试剂盒中的紫色柱）中，在室温下以14000 × g离心1分钟。弃去穿流液后继续操作，并对剩余样品重复此步骤。
  7. 加入500 μl QG缓冲液洗涤离心柱。在室温下以14000 × g离心2分钟。弃去穿流液后继续操作。
  8. 用700 μl PE洗涤缓冲液（试剂盒提供，按制造商说明加入乙醇）洗涤离心柱。在室温下以14000 × g离心1分钟。弃去穿流液后继续操作。
  9. 重复离心步骤，以彻底去除离心柱中残留的PE缓冲液。弃去穿流液和收集管。
  10. 通过加入60 μl EB缓冲液（试剂盒提供的洗脱缓冲液）将DNA从离心柱洗脱至新的离心管中。
  11. 在室温下以14000 × g离心1分钟。洗脱所得DNA可保存于-20°C，待后续检测使用。回收产物的A260读数通常显示浓度为90–120 ng/μl，每份样品总回收量约为6–7 μg。然而，这些样品的A260/280比值通常 >1.8，提示样品中存在RNA。因此，实际回收的DNA含量可能较低。

9. 回收 DNA 的分析

  1. SDS 可能干扰 PCR Taq 聚合酶的活性。在进行 PCR 之前，必须完全去除 SDS。将 DNA 置于冰上孵育以沉淀残留的 SDS，并在 4°C 下以 14000 × g 离心 1 分钟。将上清液转移至新的离心管中。强烈建议执行此步骤。
  2. DNA 洗脱液可通过常规 PCR 或使用针对各待分析序列的特异性引物进行定量实时 PCR（Q-PCR）检测。每次 PCR 或 Q-PCR 反应可使用总 DNA 洗脱液 5–10 μl。输入对照的 PCR 可将 DNA 用量相比其他样本稀释 5–10 倍后进行。PCR 和 Q-PCR 的反应条件可能有所不同，但由于起始材料量有限，需要增加 PCR 循环次数。对于常规 PCR 检测，我们建议从 40 个循环开始，并根据需要进行调整。

10. 代表性结果

我们已采用该方案从E8.5和E9.5胚胎中进行了染色质免疫沉淀（ChIP）实验（图2）。结果表明，在E8.5和E9.5胚胎中，myogenin存在于其自身的myogenin启动子区域。ChIP纯化的DNA通过常规PCR（图2A）和定量实时PCR（图2B）进行了分析。相比之下，在卵黄囊中未检测到myogenin与其启动子结合，而该组织中myogenin并不表达。干扰素-γ（IFNγ）启动子含有与myogenin结合位点匹配的序列，被用作阴性序列对照。正如预期，myogenin在所有检测的组织样本中均未结合IFNγ启动子。在E8.5和E9.5胚胎中，myogenin特异性地在体节中表达（图3；6,10），而体节是骨骼肌的前体结构。因此，结果表明，在E8.5和E9.5时期的体节中，myogenin结合于其自身的启动子区域。

子宫角和蜕膜解剖，胚胎发育阶段 E8.5-E9.5，显微镜结果。
图1. E8.5 胚胎解剖。（A）分离的子宫角（上图；下图显示更高倍放大）。（B）用剪刀剪开子宫角，以分离包含各个胚胎的独立着床部位。（C）解剖过程中从子宫组织中突出的胚胎。箭头指示仍被胚外组织覆盖的胚胎。（D）来自同一窝的两个 E8.5 胚胎。左侧胚胎尚未开始转位过程，右侧胚胎正在进行转位。最右侧为典型的 E9.5 胚胎。

常规PCR与实时PCR结果的静态平衡图；表达分析；柱状图
图 2. 染色质免疫沉淀（ChIP）实验显示，在 E8.5 和 E9.5 胚胎中，myogenin 结合于其自身启动子区域。（上图）采用针对 myogenin 的抗体或非特异性 IgG 进行 ChIP 实验后，纯化 DNA 5 µL，并通过常规 PCR 分析。所用引物扩增 myogenin 启动子中相对于转录起始位点 -79 至 +69 的一段区域，该区域包含位于 -12 的 myogenin 结合位点；或扩增 IFNγ 启动子中包含一段与 myogenin 结合位点匹配的序列的区域，该序列位于转录起始位点上游约 1075 bp 处。所用 IFNγ 引物序列为 5'-GCT GAC TCA AGA CCC CGA GGC-3' 和 5'-TGA GGA TGG GGC AGG AGG CC-3'。（下图）对与（上图）相同样品进行的定量实时荧光 PCR 分析。数据以占输入量的百分比表示，误差线为标准差。

胚胎发育阶段 E8.5 至 E9.5，显微镜图像，发育生物学研究
图3. Myogenin 特异性表达于 E8.5 和 E9.5 胚胎的体节中。整体染色 原位 myogenin 的杂交显示在体节中具有特异性的 mRNA 表达。E8.5 图像中的比例尺 — 200 μmE9.5 图像中的比例尺大小 - 500 μm.

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讨论

在所述的染色质免疫沉淀（ChIP）实验方案中，我们证明了成肌调节因子 myogenin 与存在于单个 E8.5 和 E9.5 胚胎的骨骼肌前体组织中的 myogenin 启动子区域相结合。先前的研究已广泛表征了 myogenin 与含有 E box 序列的 DNA 区域的结合，最早始于对初始 体外 利用凝胶迁移实验 体外 翻译或细菌表达的肌源性生成素与放射性标记的DNA，后者编码靶基因调控序列的相关区域 11-20传统的染色质免疫沉淀研究已证明，在成肌作用的组织培养模型中，生肌素可结合至其自身的启动子区域 21-24然而，目前尚无证据表明在胚胎骨骼肌发育过程中，myogenin会结合到其自身的启动子上，尽管根据在myogenin缺陷型小鼠E15.5期舌组织中观察到的myogenin表达下调现象，人们可能会预测在胚胎发育后期存在此类结合。 25因此，数据表明 myogenin 与 myogenin 启动子之间的相互作用确实发生 体内该技术的一个明显应用是验证先前利用培养模型进行的组织特异性基因激活研究的生理相关性。更有趣...

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披露

动物实验按照马萨诸塞大学医学院动物照护与使用委员会（IACUC）制定的指南和规定进行。

致谢

本工作由美国国立卫生研究院（NIH）R01 GM56244项目资助，该项目包含通过2009年美国复苏与再投资法案拨付的资金，以及由NIH R01 GM87130项目资助JARP

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
ChIP 测定试剂盒Upstate, Millipore17-295
II 型胶原酶Invitrogen17101015用 1 × PBS 稀释
Dulbecco’s 改良伊格尔培养基 (DMEM)GIBCO, by Life Technologies12100-061高葡萄糖含量
Dulbecco’s 磷酸盐缓冲液 1X (DPBS)GIBCO, by Life Technologies14190-144不含氯化钙、不含氯化镁
胎牛血清 (FBS)Mediatech, Inc.35-010-CV
凝胶回收试剂盒QIAquick2870450 次反应装
青霉素/链霉素储存液GIBCO, by Life Technologies5000 μg/ml 浓度
蛋白酶抑制剂混合物Sigma-AldrichP8340
鲑鱼精子 DNA /Protein A 琼脂糖EMD Millipore16-157
myogenin 抗体Santa Cruz Biotechnology, Inc.sc-576
正常兔 IgGEMD Millipore12-370
Platinum PCR SupermixInvitrogen11306-016
GoTaq Q-PCR 预混液Promega Corp.A6001

参考文献

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