利用小鼠早期胚胎对组织特异性基因进行染色质免疫沉淀实验

摘要

我们展示了一种染色质免疫沉淀（ChIP）方法，用于鉴定小鼠胚胎组织中组织特异性基因表达启动期间或之后，组织特异性基因上的因子相互作用。该方案在正常胚胎发育过程中研究组织特异性基因激活时具有广泛的适用性。

摘要

染色质免疫沉淀（ChIP）是一种强大的工具，可用于鉴定在活细胞环境中发生的蛋白质与染色质之间的相互作用^1-3。该技术已在组织培养细胞中得到广泛应用，而在原代组织中的应用则相对较少。将ChIP应用于啮齿类动物的胚胎组织，尤其是在发育早期阶段，由于组织量有限以及胚胎中细胞和组织类型的异质性，操作较为复杂。本文介绍了一种利用胚胎第8.5天（E8.5）解离胚胎进行ChIP的方法。单个E8.5胚胎的剪切染色质可分成最多五份等分试样，从而为研究者提供足够的材料用于对照实验以及特定蛋白质与染色质相互作用的研究。

我们已利用该技术开始记录组织特异性基因表达程序建立过程中蛋白质与染色质之间的相互作用。由于胚胎中细胞类型的异质性，该技术的应用必然受到限制，因为检测结果无法区分这些蛋白质与染色质的相互作用是发生在所有细胞、某一细胞亚群，还是特定单一细胞类型中。然而，在组织特异性基因表达启动期间或之后研究组织特异性基因仍是可行的，原因有两点：第一，对组织特异性因子进行免疫沉淀必然能够富集该因子所表达的细胞类型中的染色质；第二，对与基因激活相关的转录共激活因子以及带有翻译后修饰的组蛋白进行免疫沉淀，应仅能在基因及其调控序列所在的、该基因正在或已经激活的细胞类型中检测到。该技术应适用于大多数组织特异性基因激活事件的研究。

在下述示例中，我们利用 E8.5 和 E9.5 小鼠胚胎检测了骨骼肌特异性基因启动子上的因子结合情况。体节是形成躯干和四肢骨骼肌的前体组织，在 E8.5–9.5 时期已存在^4,5。Myogenin 是骨骼肌分化所必需的一种调控因子^6–9。实验结果表明，在 E8.5 和 E9.5 胚胎中，myogenin 与其自身启动子存在结合。由于在此发育阶段，myogenin 仅在体节中表达^6,10，因此该结果说明，在 E8.5 胚胎的骨骼肌前体细胞中，myogenin 与其自身启动子的相互作用已经发生。

方案

1. 胚胎的分离

注意：所有涉及小鼠的操作均应遵循适当的动物护理与使用政策及规程

1. 在交配后的第二天早晨检查雌性小鼠是否存在交配栓，并通过将已交配的雌鼠转移到不同的笼子中，使其与种公鼠分离。观察到交配栓当天的中午被视为胚胎发育的0.5天（E0.5）。
2. 在E8.5（或根据需要选择其他发育阶段），采用经批准的实验方案处死小鼠。
3. 用70%乙醇润湿已处死动物的腹部，打开腹腔。沿着每侧子宫角可见呈“串珠状”排列的着床部位，提示有正在发育的胚胎（图1A）。使用剪刀取出两侧子宫角，分别切割各个着床部位以实现分离（图1B），并将它们放入含有室温（RT）解剖培养基（DMEM，10%胎牛血清，20 mM HEPES pH 7.4，60 μg/ml 青霉素，2 mM 链霉素）的100 mm培养皿中。
4. 使用镊子将每个胚胎及其周围的膜组织从子宫组织中取出（图1C），并置于新鲜的解剖培养基中。
5. 在体视显微镜下使用镊子分离单个胚胎。在此发育阶段，胚胎被壁层卵黄囊包围，后者与蜕膜组织接触，此外还包括脏层卵黄囊和羊膜。羊膜是一层透明的膜，直接与胚胎接触。脏层卵黄囊位于羊膜与壁层卵黄囊之间，在E8.5至E9.5的胚胎中可通过其上明显的血管结构轻易识别，这些血管为胚胎提供营养。将每个胚胎从其周围的膜结构中分离出来，并单独转移至含有解剖培养基的新培养板中，以去除多余的血液。不同胚胎之间以及不同窝别之间的发育阶段可能存在差异；图1D展示了典型的E8.5胚胎和一个典型的E9.5胚胎。
6. 将每个胚胎转移至含有200 μl解剖培养基（如上第4步所述）的1.5 ml离心管中。

2. 分离胚胎的匀浆处理

1. 在每个离心管中加入20单位的II型胶原酶，体积为200 μl（溶于1×杜尔贝科磷酸盐缓冲液；DPBS）。
2. 将样品置于37°C摇床中，以100 rpm轻轻振荡20分钟。
3. 用移液器反复吹打，充分重悬细胞，以分散细胞团块。
4. 将细胞悬液加至置于1.5 ml离心管上方的无菌细胞筛网（40 μm孔径）顶部。
5. 立即在细胞筛网上方加入600 μl室温1× DPBS，以完成过滤分离。弃去筛网。
6. 在4°C下以4000 × g离心5分钟。
7. 弃去上清液。
8. 用1 ml室温1× DPBS重悬沉淀。
9. 在室温下以4000 × g离心1分钟。
10. 弃去上清液。
11. 用200 μl室温解剖培养基重悬沉淀。
12. 计数胚胎细胞。平均每E8.5胚胎可获得3–5 × 10⁶个细胞。

3. 交联染色质

1. 向200 μl样品中加入5.6 μl的37%甲醛，使甲醛终浓度为1%。
2. 在室温下孵育样品10分钟。
3. 在4°C、4000 × g条件下离心样品3分钟。
4. 弃去上清液。
5. 用含有80 μl/ml蛋白酶抑制剂混合物（PIC）的冷1X DPBS重悬细胞。
6. 在4°C、4000 × g条件下离心样品3分钟。
7. 弃去上清液。此步骤后，样品可在-80°C冷冻保存。交联后的冷冻样品可稳定保存数月。

4. 超声处理

1. 将细胞沉淀重悬于100 μl的室温SDS裂解缓冲液中（50 mM Tris-HCl (pH 8.1)、10 mM EDTA 和 1% SDS，加入新鲜配制的蛋白酶抑制剂混合物（PIC），添加量为每800 μl总体积加入1 μl PIC）。重悬后，再加入100 μl室温SDS裂解缓冲液以促进充分重悬。通过移液和颠倒充分混匀。
2. 将细胞悬液置于冰上孵育10分钟。
3. 使用Diagenode Bioruptor™ UCD200对裂解的细胞进行超声处理，以将DNA剪切至200至500个碱基对之间（设置为5分钟，重复8次，高功率模式下每次30秒开启/30秒关闭，功率为320瓦）。样品周围应始终保持冰浆环境。确保样品温度不超过4°C，也不得结冰。市面上有多种类型的超声仪可供使用。应根据所用超声仪的具体型号优化超声条件，以确保交联DNA被剪切至约500 bp的长度。
4. 将超声处理后的样品在4°C下以14000 × g离心10分钟。
5. 将上清液转移至预先在冰上冷却的新鲜离心管中。
6. 将超声处理后的样品最多分为5份等分试样。经实验确定，一个E8.5胚胎的样品可均分为5份。对于更小或更大的样品量，可相应按比例调整。在此步骤中，样品可于-80°C保存，直至后续使用。
7. 保留其中一份等分试样作为input样品，并在-20°C保存，直至第6步进行交联逆转。将其余等分试样用ChIP稀释缓冲液（16.7 mM Tris-HCl (pH 8.1)、1.2 mM EDTA、1.1% Triton X-100、167 mM NaCl 和 0.01% SDS）稀释10倍，缓冲液中需加入新鲜配制的PIC，添加量为每800 μl缓冲液加入1 μl PIC。

5. 预清除与免疫沉淀

1. 在4°C下，将稀释后的上清液与75 μl鲑鱼精DNA/蛋白A或蛋白G琼脂糖-50%悬液混合，旋转孵育1小时进行预清除。蛋白A或蛋白G磁珠的选择应根据ChIP实验所用抗体的类型而定。例如，兔源抗体推荐使用蛋白A磁珠，而山羊抗体或小鼠IgG₁抗体则推荐使用蛋白G磁珠。更详细的信息请参考磁珠生产商的建议。
2. 在4°C下以2500 × g离心1分钟。
3. 将上清液转移至新的预冷的微量离心管中。
4. 向预清除后的等分样品中加入抗体（4 μg/样本），在4°C下旋转孵育过夜。

6. 洗涤染色质-蛋白质-磁珠复合物

1. 向每个小管中加入 60 μl 鲑鱼精子 DNA/Protein A 或 G 琼脂糖凝胶悬液，在 4°C 下旋转孵育 1 小时。使用的磁珠类型应与上述第 3 步预清除中所用的磁珠类型相同。
2. 在 4°C 下以 1000 × g 离心 1 分钟。
3. 小心移除上清液并弃去。将 DNA-蛋白质-磁珠复合物置于冰上保存。
4. 按照以下指示，用洗涤缓冲液 1、2、3 和 4 重悬并洗涤沉淀。洗涤缓冲液 1–3 应预冷至 4°C，且使用这些缓冲液的洗涤步骤应在 4°C 下进行。洗涤缓冲液 4 应处于室温，且使用该缓冲液的洗涤步骤应在室温下进行。每次洗涤均在相应温度下旋转孵育 5 分钟。每次洗涤后，在 4°C 下（洗涤缓冲液 4 的洗涤步骤在室温下）以 1000 × g 离心 1 分钟，然后小心吸除或移走上清液。

缓冲液 1：低盐洗涤缓冲液（20 mM Tris-HCl (pH 8.1)，2 mM EDTA，1% Triton X-100，
150 mM NaCl 和 0.1% SDS），每次 1 ml，洗涤 2 次。
缓冲液 2：高盐洗涤缓冲液（20 mM Tris-HCl (pH 8.1)，2 mM EDTA，1% Triton X-100，
500 mM NaCl 和 0.1% SDS），每次 1 ml，洗涤 2 次。
缓冲液 3：LiCl 盐洗涤缓冲液（10 mM Tris-HCl (pH 8.1)，1 mM EDTA，1% IGEPAL-CA630，
0.25 M LiCl 和 1% 脱氧胆酸钠），每次 1 ml，洗涤 1 次。
缓冲液 4：TE 缓冲液（10 mM Tris-HCl (pH 8.1)，1 mM EDTA），每次 1 ml，洗涤 2 次。

7. 染色质-抗体复合物的洗脱

1. 将洗涤后的染色质-蛋白质-磁珠复合物重悬于250 μl新配制的洗脱缓冲液（1% SDS，0.1 M NaHCO₃）中。剧烈涡旋震荡样品5秒，然后在室温下旋转孵育15分钟。
2. 在室温下以2500 × g离心1分钟，并将洗脱液转移至新的离心管中。
3. 重复步骤1和2，并将洗脱液合并至同一离心管中。洗脱液应保持在室温。完成此步骤后，可将洗脱液储存于-20°C，以备后续使用。

8. 反向交联并回收 DNA

1. 向500 μl洗脱液中加入20 μl 5 M NaCl（输入对照为40 μl/ml）。
2. 将洗脱液置于65°C水浴中加热4小时至过夜。
3. 可取每个样品（包括输入对照）10 μl，与大小范围为0.1至1 kbp的DNA分子量标记物一同上样于2%琼脂糖凝胶进行电泳，以检测DNA片段大小。DNA条带将呈现为弥散状而非清晰条带。其余样品可在凝胶电泳期间继续保留在65°C环境中。
4. 使用QIAquick凝胶回收试剂盒（Qiagen）从各样品中回收DNA。向500 μl样品中加入600 μl QG缓冲液（试剂盒提供）以优化DNA在QIAquick离心柱硅胶膜上的吸附，并加入200 μl异丙醇。注意：QG缓冲液含有pH指示剂，可方便判断样品pH值。若混合后样品颜色由黄色变为紫色（pH > 7.5），则向样品中加入10 μl 3 M乙酸钠（pH 5.2）并混匀。此步骤可降低混合物pH值，以最大化DNA与柱内微珠的结合效率。
5. 在上样前检查混合物中是否存在SDS沉淀。若出现SDS沉淀，应将样品置于42°C水浴中加热至沉淀完全消失。
6. 将700 μl混合液加入QIAquick离心柱（试剂盒中的紫色柱）中，在室温下以14000 × g离心1分钟。弃去穿流液后继续操作，并对剩余样品重复此步骤。
7. 加入500 μl QG缓冲液洗涤离心柱。在室温下以14000 × g离心2分钟。弃去穿流液后继续操作。
8. 用700 μl PE洗涤缓冲液（试剂盒提供，按制造商说明加入乙醇）洗涤离心柱。在室温下以14000 × g离心1分钟。弃去穿流液后继续操作。
9. 重复离心步骤，以彻底去除离心柱中残留的PE缓冲液。弃去穿流液和收集管。
10. 通过加入60 μl EB缓冲液（试剂盒提供的洗脱缓冲液），将DNA从离心柱洗脱至新的EP管中。
11. 在室温下以14000 × g离心1分钟。所得洗脱DNA可保存于-20°C直至检测。回收产物的A₂₆₀读数通常显示浓度为90–120 ng/μl，每份样品总回收量约为6–7 μg。然而，这些样品的A_260/280比值通常 > 1.8，提示样品中可能存在RNA，因此实际回收的DNA含量可能较低。

9. 回收DNA的分析

1. SDS 可能会干扰 PCR Taq 聚合酶的活性。在进行 PCR 之前，应完全去除 SDS。将 DNA 置于冰上孵育以沉淀残留的 SDS，并在 4°C 下以 14000 × g 离心 1 分钟。将上清液转移至新的离心管中。强烈建议执行此步骤。
2. DNA 洗脱液可通过常规 PCR 或使用针对各待分析序列的特异性引物进行定量实时 PCR（Q-PCR）检测。每次 PCR 或 Q-PCR 反应可使用总 DNA 洗脱液中的 5–10 μl。输入对照的 PCR 可将 DNA 用量相比其他样品稀释 5–10 倍后进行。PCR 和 Q-PCR 的反应条件可能有所不同，但由于起始材料量有限，需要增加 PCR 循环次数。对于常规 PCR 检测，我们建议从 40 个循环开始，并根据需要进行调整。

10. 代表性结果

我们已使用该方案从E8.5和E9.5胚胎中进行了染色质免疫沉淀实验（图2）。结果表明，在E8.5和E9.5胚胎中，myogenin存在于其自身的启动子区域。染色质免疫沉淀纯化的DNA通过常规PCR（图2A）和定量实时PCR（图2B）进行分析。相比之下，在卵黄囊中未检测到myogenin与其启动子结合，而该组织中myogenin并不表达。干扰素-γ（IFNγ）启动子含有与myogenin结合位点匹配的序列，被用作阴性序列对照。正如预期，myogenin在所有检测的组织样本中均未结合IFNγ启动子。在E8.5和E9.5胚胎中，myogenin特异性地在体节中表达（图3；^6,10），而体节是骨骼肌的前体结构。因此，结果表明，在E8.5和E9.5时，myogenin特异性地结合于体节中的myogenin启动子区域。

图1. E8.5 胚胎的解剖。（A）分离的子宫角（上图；下图为更高倍数的放大图像）。（B）用剪刀剪开子宫角，以分离包含各个胚胎的独立植入位点。（C）解剖过程中从子宫组织中突出的胚胎。箭头指示仍被胚外组织覆盖的胚胎。（D）来自同一窝的两个 E8.5 胚胎。左侧胚胎尚未开始转位过程，右侧胚胎正在进行转位。最右侧为典型的 E9.5 胚胎。

图2. 染色质免疫沉淀（ChIP）实验显示，在E8.5和E9.5胚胎中，myogenin蛋白结合于其自身启动子区域。（上图）采用针对myogenin的抗体或非特异性IgG进行染色质免疫沉淀后，纯化DNA并取5 µl进行常规PCR分析。PCR引物用于扩增myogenin启动子的一段区域（相对于转录起始位点的-79至+69区域），该区域包含位于-12处的myogenin结合位点；另设引物扩增IFNγ启动子的一段区域，该区域包含一个位于转录起始位点上游约1075 bp处、与myogenin结合位点序列匹配的序列。所用IFNγ引物序列为5'-GCT GAC TCA AGA CCC CGA GGC-3'和5'-TGA GGA TGG GGC AGG AGG CC-3'。（下图）对与（上图）相同的样品进行定量实时PCR分析。数据以占输入DNA百分比（% of input）表示，误差线代表标准差（± standard deviation）。

图3. Myogenin 特异性表达于 E8.5 和 E9.5 胚胎的体节中。整体染色 原位 myogenin 杂交显示在体节中特异的 mRNA 表达。E8.5 图像中的比例尺为 200 μm. E9.5 图像中的比例尺 - 500 μm

讨论

在所述的染色质免疫沉淀（ChIP）实验方案中，我们证明了成肌调节因子 myogenin 与存在于单个 E8.5 和 E9.5 胚胎的骨骼肌前体组织中的 myogenin 启动子区域相结合。先前的研究已广泛表征了 myogenin 与含有 E box 序列的 DNA 区域的结合，最早始于对初始 体外 利用凝胶迁移实验 体外 翻译或细菌表达的肌源性生成素与放射性标记的DNA，后者编码靶基因调控序列的相关区域 ^11-20传统的染色质免疫沉淀研究已证明，在成肌作用的组织培养模型中，生肌素可结合至其自身的启动子区域 ^21-24然而，目前尚无证据表明在胚胎骨骼肌发育过程中，myogenin会结合到其自身的启动子上，尽管根据在myogenin缺陷型小鼠E15.5期舌组织中观察到的myogenin表达下调现象，人们可能会预测在胚胎发育后期存在此类结合。 ²⁵因此，数据表明 myogenin 与 myogenin 启动子之间的相互作用确实发生 体内该技术的一个明显应用是验证先前利用培养模型进行的组织特异性基因激活研究的生理相关性。更有趣...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
ChIP 测定试剂盒	Upstate, Millipore	17-295
II 型胶原酶	Invitrogen	17101015	用 1 × PBS 稀释
Dulbecco’s 改良伊格尔培养基 (DMEM)	GIBCO, by Life Technologies	12100-061	高葡萄糖含量
Dulbecco’s 磷酸盐缓冲液 1X (DPBS)	GIBCO, by Life Technologies	14190-144	不含氯化钙、不含氯化镁
胎牛血清 (FBS)	Mediatech, Inc.	35-010-CV
凝胶回收试剂盒	QIAquick	28704	50 次反应装
青霉素/链霉素储存液	GIBCO, by Life Technologies		5000 μg/ml 浓度
蛋白酶抑制剂混合物	Sigma-Aldrich	P8340
鲑鱼精子 DNA /Protein A 琼脂糖	EMD Millipore	16-157
myogenin 抗体	Santa Cruz Biotechnology, Inc.	sc-576
正常兔 IgG	EMD Millipore	12-370
Platinum PCR Supermix	Invitrogen	11306-016
GoTaq Q-PCR 预混液	Promega Corp.	A6001