利用小鼠早期胚胎对组织特异性基因进行染色质免疫沉淀实验

摘要

我们展示了一种染色质免疫沉淀（ChIP）方法，用于鉴定小鼠胚胎组织中组织特异性基因表达启动期间或之后，组织特异性基因上的因子相互作用。该方案在正常胚胎发育过程中研究组织特异性基因激活时具有广泛的适用性。

摘要

染色质免疫沉淀（ChIP）是一种强大的工具，可用于鉴定在活细胞环境中发生的蛋白质与染色质之间的相互作用^1-3。该技术已在组织培养细胞中得到广泛应用，而在原代组织中的应用则相对较少。将ChIP应用于啮齿类动物的胚胎组织，尤其是在发育早期阶段，由于组织量有限以及胚胎中细胞和组织类型的异质性，操作较为复杂。本文介绍了一种利用胚胎第8.5天（E8.5）解离胚胎进行ChIP的方法。单个E8.5胚胎的剪切染色质可分成最多五份等分试样，从而为研究者提供足够的材料用于对照实验以及特定蛋白质与染色质相互作用的研究。

我们已利用该技术开始记录组织特异性基因表达程序建立过程中蛋白质与染色质之间的相互作用。由于胚胎中细胞类型的异质性，该技术的应用必然受到限制，因为检测结果无法区分这些蛋白质与染色质的相互作用是发生在所有细胞、某一细胞亚群，还是特定单一细胞类型中。然而，在组织特异性基因表达启动期间或之后研究组织特异性基因仍是可行的，原因有两点：第一，对组织特异性因子进行免疫沉淀必然能够富集该因子所表达的细胞类型中的染色质；第二，对与基因激活相关的转录共激活因子以及带有翻译后修饰的组蛋白进行免疫沉淀，应仅能在基因及其调控序列所在的、该基因正在或已经激活的细胞类型中检测到。该技术应适用于大多数组织特异性基因激活事件的研究。

在下述示例中，我们利用 E8.5 和 E9.5 小鼠胚胎检测了骨骼肌特异性基因启动子上的因子结合情况。体节是形成躯干和四肢骨骼肌的前体组织，在 E8.5–9.5 时期已存在^4,5。Myogenin 是骨骼肌分化所必需的一种调控因子^6–9。实验结果表明，在 E8.5 和 E9.5 胚胎中，myogenin 与其自身启动子存在结合。由于在此发育阶段，myogenin 仅在体节中表达^6,10，因此该结果说明，在 E8.5 胚胎的骨骼肌前体细胞中，myogenin 与其自身启动子的相互作用已经发生。

方案

1. 胚胎的分离

注意：所有涉及小鼠的操作均应遵循适当的动物护理与使用政策及规程

1. 在交配后的第二天早晨检查雌性小鼠是否存在交配栓，并通过将已交配的雌鼠转移到不同的笼子中，使其与种公鼠分离。观察到交配栓当天的中午被视为胚胎发育的0.5天（E0.5）。
2. 在E8.5（或根据需要选择其他发育阶段），采用经批准的实验方案处死小鼠。
3. 用70%乙醇润湿已处死动物的腹部，打开腹腔。沿着每侧子宫角可见呈“串珠状”排列的着床部位，提示有正在发育的胚胎（图1A）。使用剪刀取出两侧子宫角，分别切割各个着床部位以实现分离（图1B），并将它们放入含有室温（RT）解剖培养基（DMEM，10%胎牛血清，20 mM HEPES pH 7.4，60 μg/ml 青霉素，2 mM 链霉素）的100 mm培养皿中。
4. 使用镊子将每个胚胎及其周围的膜组织从子宫组织中取出（图1C），并置于新鲜的解剖培养基中。
5. 在体视显微镜下使用镊子分离单个胚胎。在此发育阶段，胚胎被壁层卵黄囊包围，后者与蜕膜组织接触，此外还包括脏层卵黄囊和羊膜。羊膜是一层透明的膜，直接与胚胎接触。脏层卵黄囊位于羊膜与壁层卵黄囊之间，在E8.5至E9.5的胚胎中可通过其上明显的血管结构轻易识别，这些血管为胚胎提供营养。将每个胚胎从其周围的膜结构中分离出来，并单独转移至含有解剖培养基的新培养板中，以去除多余的血液。不同胚胎....

讨论

在所述的染色质免疫沉淀（ChIP）实验方案中，我们证明了成肌调节因子 myogenin 与存在于单个 E8.5 和 E9.5 胚胎的骨骼肌前体组织中的 myogenin 启动子区域相结合。先前的研究已广泛表征了 myogenin 与含有 E box 序列的 DNA 区域的结合，最早始于对初始 体外 利用凝胶迁移实验 体外 翻译或细菌表达的肌源性生成素与放射性标记的DNA，后者编码靶基因调控序列的相关区域 ^11-20传统的染色质免疫沉淀研究已证明，在成肌作用的组织培养模型中，生肌素可结合至其自身的启动子区域 ^21-24然而，目前尚无证据表明在胚胎骨骼肌发育过程中，myogenin会结合到其自身的启动子上，尽管根据在myogenin缺陷型小鼠E15.5期舌组织中观察到的myogenin表达下调现象，人们可能会预测在胚胎发育后期存在此类结合。 ²⁵因此，数据表明 myogenin 与 myogenin 启动子之间的相互作用确实发生 体内该技术的一个明显应用是验证先前利用培养模型进行的组织特异性基因激活研究的生理相关性。更有趣.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
ChIP 测定试剂盒	Upstate, Millipore	17-295
II 型胶原酶	Invitrogen	17101015	用 1 × PBS 稀释
Dulbecco’s 改良伊格尔培养基 (DMEM)	GIBCO, by Life Technologies	12100-061	高葡萄糖含量
Dulbecco’s 磷酸盐缓冲液 1X (DPBS)	GIBCO, by Life Technologies	14190-144	不含氯化钙、不含氯化镁
胎牛血清 (FBS)	Mediatech, Inc.	35-010-CV
凝胶回收试剂盒	QIAquick	28704	50 次反应装
青霉素/链霉素储存液	GIBCO, by Life Technologies		5000 μg/ml 浓度
蛋白酶抑制剂混合物	Sigma-Aldrich	P8340
鲑鱼精子 DNA /Protein A 琼脂糖	EMD Millipore	16-157
myogenin 抗体	Santa Cruz Biotechnology, Inc.	sc-576
正常兔 IgG	EMD Millipore	12-370
Platinum PCR Supermix	Invitrogen	11306-016
GoTaq Q-PCR 预混液	Promega Corp.	A6001