本文介绍了一种从废弃的人类胎儿皮质组织中分离和培养神经干细胞的简单且可靠的方法。来源于已知人类神经系统疾病的人源组织培养物可用于病理性的细胞与分子过程的表征，并可作为评估药理学疗效的平台。
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本文内容
摘要
摘要
神经干细胞（NSCs）存在于皮质板发育过程中脑室区的神经上皮中。这些早期前体细胞最终产生中间前体细胞，并进一步分化为多种神经元和胶质细胞亚型，构成大脑皮层。利用废弃的正常胎儿组织分离并扩增人神经干细胞（即所谓的神经球），为直接研究正常人神经干细胞发育的功能特性提供了有效手段。 1-5该方法也可用于生成已知神经系统疾病来源的神经干细胞，从而为识别影响前体细胞增殖、迁移和分化的疾病机制提供机会 6-9我们致力于鉴定人类唐氏综合征神经干细胞中可能促进阿尔茨海默病表型加速发展的病理机制 10,11。两者均不 体内 否 体外 小鼠模型可以复制位于人类21号染色体上的相同基因组合。
本文采用一种简单且可靠的方法，从人工流产的人类胎儿皮层中分离唐氏综合征神经干细胞（NSCs），并在体外培养中进行扩增。该方法详细介绍了组织获取、基于有限解剖标志的组织解剖、细胞分选、细胞接种与传代等关键步骤。此外，我们还提供了一些基本方案，用于诱导人类神经干细胞向更具特异性的细胞亚型分化。
方案
1. 解剖及神经干细胞培养维持所需溶液与材料的准备
- 提前配制 100 ml 解离液（KNOCKOUT DMEM/F12，Invitogen），并冷藏保存。
- 提前配制 100 ml 培养基（Stem Pro NSC SFM，Invitrogen），并置于 37 °C 水浴中保温。
- 配制细胞冻存液（KNOCKOUT DMEM/F12 + 10% FBS + 5% DMSO），用于细胞的长期低温保存。
- 如需要，配制 4% 多聚甲醛（PFA）用于组织固定。
- 使用无菌、经高压灭菌的镊子和带柄的手术刀片进行解剖操作。
- 准备移液枪、10 ml 移液管和 40 μM 细胞滤器（BD Falcon 352340），用于细胞解离。
- 准备若干 10 cm 培养皿（BD）用于解剖操作，50 ml 离心管（BD）用于细胞解离，1.5 ml 离心管用于组织储存，以及冻存管（BD）用于细胞冻存。
2. 从人胎脑中分离人神经干细胞
- 在胎儿终止后立即获取有活性的组织对该实验的成功至关重要。对于择期手术，可提前安排取样时间，以尽量缩短胎儿死亡后的时间。妊娠产物应在手术后2小时内采集，而在择期手术中理想情况下可在数分钟内完成。胎儿组织常呈碎片状，但通常大脑的大部分区域仍保持完整，可通过肉眼识别。妊娠周龄（GA）的限制由法律规定，但本方案....
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讨论
目前有多种培养新鲜组织并建立人类细胞系的方法。传统上，新鲜组织被获取后立即进行培养，以生成中枢神经系统中的多种细胞类型。然而，这种方法明显受限于可获取样本的数量，而对于人类样本而言，通常数量非常有限。由于操作程度最小，新鲜培养的神经细胞能够提供最可靠的实验体系，从而将长期培养可能带来的假象降至最低。有限的样本供应促使人们发展出第二种方法，即通过插入不同的癌基因来建立永生化的人类细胞系12, 13。这种方法的问题在于，癌基因对细胞的改造可能会改变细胞本身的特性。此外，建立人类细胞系的部分初衷是希望实现细胞移植并用于治疗多种人类疾病。而永生化细胞系则可能增加癌变风险。这类细胞系的优势在于其高度均一性，能够表现出脑区固有的多种神经元和胶质细胞表型，并且易于大量培养。为了克服潜在的癌基因相关局限，研究人员已采用多种方法来培养原代人类神经干细胞。大多数方法基于使用EGF和bFGF对细胞进行调控，并结合贴壁培养或悬浮培养技术。这些不同方法所获得的神经干细胞纯度各不相同14。Svendsen等人报道了一种通过切割形成的神经球并保持细胞间接触的方式来培养神经干细胞的方法（15），可在短时间内高效获得大量神经干.......
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致谢
本工作部分得到了美国国立卫生研究院（National Institutes of Health）的资助：HD054347 和 NS063997-01 项目资助 VLS。本工作还部分得到了纽约州卫生部通过帝国州干细胞基金（Empire State Stem Cell Fund）提供的合同号 #C024324 对 VLS 的资助。此处表达的观点仅为作者个人观点，不一定反映帝国州干细胞委员会、纽约州卫生部或纽约州政府的观点。VLS 是多丽丝·杜克临床科学家发展奖（Doris Duke Clinical Scientist Developmental Award）获得者。我们还感谢 Timothy Vartanian 教授惠赠 Anti-O1 和 Anti-O4 抗体。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 敲除型DMEM/F12 | Invitrogen | 12660-012 | 解离培养基 |
| Stem Pro NSC SFM | Invitrogen | A10509-01 | 培养培养基 |
| 胎牛血清 | Invitrogen | 10091-148 | 冻存培养基 |
| Hanks溶液（-Ca2+, -Mg2+） | Invitrogen | 14175-095 | 解离培养基 |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | 冻存培养基 |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 431788 | 解离培养基 |
| 多聚甲醛 | Sigma-Aldrich | 158127 | 固定液 |
| bFGF | R&D Systems | 234-FSE | 分化培养基 |
| SHH | R&D Systems | 1845-SH | 分化培养基 |
| PDGF-AA | R&D Systems | 221-AA | 分化培养基 |
| B27 | Invitrogen | 17504-044 | 分化培养基 |
| 小鼠抗MAP2抗体 | Sigma-Aldrich | M2320 | 1:200 |
| 兔抗DCX抗体 | Cell Signaling Technology | 4604s | 1:200 |
| 兔抗GFAP抗体 | Dako | Z0334 | 1:200 |
| 兔抗S100B抗体 | Dako | Z0311 | 1:200 |
| 兔抗O1抗体 | Timothy Vartanian教授惠赠* | 1:50 | |
| 兔抗O4抗体 | Timothy Vartanian教授惠赠* | 1:50 | |
| 40μm细胞筛 | BD Biosciences | 352340 | |
| * Timothy Vartanian，医学博士，哲学博士，美国纽约威尔康奈尔医学院神经病学与神经科学系 |
参考文献
- Gage, F. H., Ray, J., Fisher, L. J. Isolation, characterization, and use of stem cells from the CNS. Annu. Rev. Neurosci. 18, 159-192 (1995).
- Vescovi, A. L., Snyder, E. Y. Establishment and properties of neural stem cell clones: plasticity in vitro and ....
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重印与许可
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