本文介绍了一种从废弃的人类胎儿皮质组织中分离和培养神经干细胞的简单且可靠的方法。来源于已知人类神经系统疾病的人源组织培养物可用于病理性的细胞与分子过程的表征，并可作为评估药理学疗效的平台。
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本文内容
摘要
摘要
神经干细胞（NSCs）存在于皮质板发育过程中脑室区的神经上皮中。这些早期前体细胞最终产生中间前体细胞，并进一步分化为多种神经元和胶质细胞亚型，构成大脑皮层。利用废弃的正常胎儿组织分离并扩增人神经干细胞（即所谓的神经球），为直接研究正常人神经干细胞发育的功能特性提供了有效手段。 1-5该方法也可用于生成已知神经系统疾病来源的神经干细胞，从而为识别影响前体细胞增殖、迁移和分化的疾病机制提供机会 6-9我们致力于鉴定人类唐氏综合征神经干细胞中可能促进阿尔茨海默病表型加速发展的病理机制 10,11。两者均不 体内 否 体外 小鼠模型可以复制位于人类21号染色体上的相同基因组合。
本文采用一种简单且可靠的方法，从人工流产的人类胎儿皮层中分离唐氏综合征神经干细胞（NSCs），并在体外培养中进行扩增。该方法详细介绍了组织获取、基于有限解剖标志的组织解剖、细胞分选、细胞接种与传代等关键步骤。此外，我们还提供了一些基本方案，用于诱导人类神经干细胞向更具特异性的细胞亚型分化。
方案
1. 解剖及神经干细胞培养维持所需溶液与材料的准备
- 提前配制 100 ml 解离液（KNOCKOUT DMEM/F12，Invitogen），并冷藏保存。
- 提前配制 100 ml 培养基（Stem Pro NSC SFM，Invitrogen），并置于 37 °C 水浴中保温。
- 配制细胞冻存液（KNOCKOUT DMEM/F12 + 10% FBS + 5% DMSO），用于细胞的长期低温保存。
- 如需要，配制 4% 多聚甲醛（PFA）用于组织固定。
- 使用无菌、经高压灭菌的镊子和带柄的手术刀片进行解剖操作。
- 准备移液枪、10 ml 移液管和 40 μM 细胞滤器（BD Falcon 352340），用于细胞解离。
- 准备若干 10 cm 培养皿（BD）用于解剖操作，50 ml 离心管（BD）用于细胞解离，1.5 ml 离心管用于组织储存，以及冻存管（BD）用于细胞冻存。
2. 从人胎脑中分离人神经干细胞
- 在胎儿终止后立即获取有活性的组织对该实验的成功至关重要。对于择期手术，可提前安排取样时间，以尽量缩短胎儿死亡后的时间。妊娠产物应在手术后2小时内采集，而在择期手术中理想情况下可在数分钟内完成。胎儿组织常呈碎片状，但通常大脑的大部分区域仍保持完整，可通过肉眼识别。妊娠周龄（GA）的限制由法律规定，但本方案已在18至22周GA范围内成功应用。
- 将胎儿脑组织置于含有冰冻KNOCKOUT DMEM/F12溶液的10 ml培养皿中。通过解剖标志识别大脑皮层的不同区域。额叶和顶枕叶皮层的边界通过中央沟与外侧裂延伸线的交点确定。使用手术刀沿中央沟前方的额叶皮层及外侧裂边缘进行解剖，注意保持脑室完整且不受损伤。
- 去除分离出的额叶皮层组织中残留的血液和软脑膜。若样本质量足够好，建议将组织块分割为多个较小样本用于不同用途：部分用于切片（固定于4%多聚甲醛，PFA），部分用于蛋白质/mRNA检测（迅速冷冻于-80°C）。
- 将选定的脑组织块转移至50 ml离心管中，加入约为组织体积3倍的冰冻KNOCKOUT DMEM/F12溶液。使用10 ml移液管通过机械吹打轻柔地分散组织，直至组织完全破碎（通常吹打20–30次），然后通过40 μM细胞筛网（BD Falcon 352340）过滤，获得单细胞或接近单细胞的悬液。
- 将细胞悬液在室温下以2000 rpm离心5分钟，弃上清后用10 ml新鲜预温的培养基（Stem Pro NSC SFM）重悬细胞沉淀，并用血细胞计数板计数细胞数量。
- 向每个25 cm2培养瓶中加入5 ml预温的培养基，每瓶接种2×106个细胞。细胞在37°C、5% CO2培养箱中培养1周后进行分析。后续培养或实验中，每周更换一半培养基。
3. 神经干细胞的操控以进行进一步表征或实验
- 在推荐的培养条件下，神经球通常在1至2周内形成，其神经干细胞直径范围为200至400 μm。此阶段的神经球可在37°C下使用含0.2 g/L EDTA的无钙镁Hanks平衡盐溶液（Hanks）消化15分钟，以获得单细胞悬液。细胞悬液在2000 rpm离心，用新鲜Hanks溶液洗涤，然后重悬于预温的培养基中进行传代培养。
- 为启动分化，将消化后的细胞以每张盖玻片（24 mm × 24 mm）1×105个细胞的密度接种于多聚-D-赖氨酸/层粘连蛋白1包被的盖玻片上。少突胶质细胞分化通过在KNOCKOUT DMEM/F12培养基（Invitrogen, Main, MD）+ 2% B27（50X, Invitrogen, Main, MD）+ 10 ng/ml bFGF + 100 ng/ml SHH + 10 ng/ml PDGF-AA中培养2天，随后更换为不含生长因子的相同培养基继续培养5天来实现。神经元分化通过在KNOCKOUT DMEM/F12 + 2% B27（50X）培养基中培养7天实现。星形胶质细胞分化则通过在KNOCKOUT DMEM/F12 + 1% FBS培养基中培养一周完成。
- 可通过预先形成的神经球消化所得的单细胞对神经干细胞进行基因转染。本文展示了通过电穿孔法将EGFP-C1质粒转染至神经干细胞。EGFP-C1质粒的电穿孔转染使用AMAXA Nucleofector试剂盒（小鼠神经干细胞，VPG-1004）及AMAXA Nucleofector电转仪（Lonza AAD-1001），按照厂家说明书操作。简言之，将5 μg DNA与1×106个细胞混合于100 μl转染缓冲液中，电脉冲处理后，将细胞重悬于神经干细胞维持培养基中继续培养。转染后3–4天，通过消化神经球启动转染细胞的分化，具体步骤同3.2所述。
4. 冻存神经干细胞及亚培养物
- 将离散的细胞悬液离心后重悬于冻存液中，细胞浓度为1×107个细胞/瓶/毫升。将细胞在-20°C预冷，再转移至-80°C缓慢冷冻，随后转入液氮中长期保存。
- 将细胞在37°C水浴中快速解冻，用预热的DMEM/F12+10%血清重悬进行洗涤，离心去除冻存液后，再将细胞重悬于预热的培养基中。
5. 代表性结果：
在妊娠18周时，从正常胎儿中分离的神经干细胞按照所述方法进行培养，一周后可见具有圆形、光滑边界且大小相对均一的神经球（图2A）。这些神经球可转染EGFP-C1或其他构建体，并在荧光显微镜下进行观察（图2B）。已建立的神经球随后用EDTA消化并接种于包被的盖玻片上，形成分散的单细胞。根据相应方案诱导分化的细胞用4%多聚甲醛固定，并用不同细胞类型特异性标记物进行染色。多向分化潜能表现为表达神经元标志物（图2C、D，罗丹明）、星形胶质细胞标志物（图2E、F，罗丹明）以及少突胶质细胞标志物（图2G、H，罗丹明）。未进行EGFP电穿孔的细胞同样可分化为不同类型细胞，并用不同细胞特异性标记物染色。其多向分化潜能表现为表达神经元标志物（图3A、B，荧光素）、星形胶质细胞标志物（图3C，罗丹明和图3D，荧光素）以及少突胶质细胞标志物（图3E、F，罗丹明）。
图 1. 从废弃的人类胎儿脑组织中分离神经干细胞的实验流程示意图
图2. 未分化与已分化的人类神经细胞的培养 体外（A）神经球在相差显微镜下显示光滑、圆形的边界，在培养超过1周后呈现快速生长。（B）可通过转染实现多种质粒和构建体的导入。转染EGFP-C1后3天，多个细胞在荧光素免疫染色和荧光显微镜下显示出绿色荧光蛋白的表达。将转染EGFP-C1的神经球解离后，在不同条件下分化为神经元（C，D）、星形胶质细胞（E，F）和少突胶质细胞（G，H），并在罗丹明荧光下观察。同时，在荧光素荧光下可见转染后EGFP阳性细胞。转染细胞（白色箭头）与未转染细胞（白色箭头）无法区分。细胞核使用Hoechst33342染色。比例尺为 200 μm 对于 A， 100 μm 对于 B 和 25 μm 用于 C-H。
图3. 未转染的神经球在不同条件下解离并分化为神经元（A, B，荧光素）、星形胶质细胞（C，罗丹明；D，荧光素）和少突胶质细胞（E, F，罗丹明）。细胞核用 Hoechst33342 染色。A–F 的比例尺为 25 μm。
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讨论
目前有多种培养新鲜组织并建立人类细胞系的方法。传统上，新鲜组织被获取后立即进行培养，以生成中枢神经系统中的多种细胞类型。然而，这种方法明显受限于可获取样本的数量，而对于人类样本而言，通常数量非常有限。由于操作程度最小，新鲜培养的神经细胞能够提供最可靠的实验体系，从而将长期培养可能带来的假象降至最低。有限的样本供应促使人们发展出第二种方法，即通过插入不同的癌基因来建立永生化的人类细胞系12, 13。这种方法的问题在于，癌基因对细胞的改造可能会改变细胞本身的特性。此外，建立人类细胞系的部分初衷是希望实现细胞移植并用于治疗多种人类疾病。而永生化细胞系则可能增加癌变风险。这类细胞系的优势在于其高度均一性，能够表现出脑区固有的多种神经元和胶质细胞表型，并且易于大量培养。为了克服潜在的癌基因相关局限，研究人员已采用多种方法来培养原代人类神经干细胞。大多数方法基于使用EGF和bFGF对细胞进行调控，并结合贴壁培养或悬浮培养技术。这些不同方法所获得的神经干细胞纯度各不相同14。Svendsen等人报道了一种通过切割形成的神经球并保持细胞间接触的方式来培养神经干细胞的方法（15），可在短时间内高效获得大量神经干...
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致谢
本工作部分得到了美国国立卫生研究院（National Institutes of Health）的资助：HD054347 和 NS063997-01 项目资助 VLS。本工作还部分得到了纽约州卫生部通过帝国州干细胞基金（Empire State Stem Cell Fund）提供的合同号 #C024324 对 VLS 的资助。此处表达的观点仅为作者个人观点，不一定反映帝国州干细胞委员会、纽约州卫生部或纽约州政府的观点。VLS 是多丽丝·杜克临床科学家发展奖（Doris Duke Clinical Scientist Developmental Award）获得者。我们还感谢 Timothy Vartanian 教授惠赠 Anti-O1 和 Anti-O4 抗体。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 敲除型DMEM/F12 | Invitrogen | 12660-012 | 解离培养基 |
| Stem Pro NSC SFM | Invitrogen | A10509-01 | 培养培养基 |
| 胎牛血清 | Invitrogen | 10091-148 | 冻存培养基 |
| Hanks溶液（-Ca2+, -Mg2+） | Invitrogen | 14175-095 | 解离培养基 |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | 冻存培养基 |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 431788 | 解离培养基 |
| 多聚甲醛 | Sigma-Aldrich | 158127 | 固定液 |
| bFGF | R&D Systems | 234-FSE | 分化培养基 |
| SHH | R&D Systems | 1845-SH | 分化培养基 |
| PDGF-AA | R&D Systems | 221-AA | 分化培养基 |
| B27 | Invitrogen | 17504-044 | 分化培养基 |
| 小鼠抗MAP2抗体 | Sigma-Aldrich | M2320 | 1:200 |
| 兔抗DCX抗体 | Cell Signaling Technology | 4604s | 1:200 |
| 兔抗GFAP抗体 | Dako | Z0334 | 1:200 |
| 兔抗S100B抗体 | Dako | Z0311 | 1:200 |
| 兔抗O1抗体 | Timothy Vartanian教授惠赠* | 1:50 | |
| 兔抗O4抗体 | Timothy Vartanian教授惠赠* | 1:50 | |
| 40μm细胞筛 | BD Biosciences | 352340 | |
| * Timothy Vartanian，医学博士，哲学博士，美国纽约威尔康奈尔医学院神经病学与神经科学系 |
参考文献
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