ampliPHOX比色法检测为流感的DNA芯片

摘要

ampliPHOX比色法检测技术是作为一种廉价的替代芯片荧光检测。 ampliPHOX聚合的基础上，产生的固体聚合物点，在短短几分钟内肉眼可见。结果将被自动成像和解释一个简单但功能强大的软件包。

摘要

DNA芯片已成为一个病原体检测的有力工具^。1-5例如，已被证明的能力类型和亚型流感病毒的例子很多^。6-11识别和亚型流感DNA芯片应用在公共健康和诊所，以便及早发现，迅速介入，并最大限度地减少流感大流行的影响。传统的荧光是目前最常用的基因芯片检测方法。然而，由于基因芯片技术对临床使用过程，取代昂贵的仪器，成本低的检测技术表现出相似的性能特点，荧光将使芯片检测更具吸引力和成本效益。

ampliPHOX比色法检测技术是用于研究中的应用，和传统荧光¹¹的幅度内之一为了一个近似的10倍仪器成本较低的优势，比焦荧光微阵列芯片扫描仪需要与主要的检测限，检测。另一个优点是体积小巧，仪器的可移植性和灵活性允许不同于传统的荧光仪器。因为聚合技术是不是天生荧光检测线性的，但是，它是最好的适合密度较低的芯片应用中存在一定的顺序是/没有答案所需，如病原体检测阵列。目前最大的现货密度与ampliPHOX检测兼容〜1800点/阵列。由于现场密度的限制，高密​​度微阵列不适合ampliPHOX检测。

在这里，我们目前作为一个信号放大方法对流感病毒的检测和表征（流感集成电路芯片）开发的低密度芯片ampliPHOX比色法检测技术。虽然这个协议使用一个特定的应用程序，任何芯片，结合生物素化的目标，可以标记，并以类似的方式检测ampliPHOX检测流感集成电路芯片（DNA芯片）。被捕获的芯片设计和生物素化的目标是用户的责任。一旦阵列上已捕获生物素化的目标，ampliPHOX检测可以进行与链霉亲和标签的共轭（ampliTAG）的数组，第一个标记。 （ampliPHY）使用ampliPHOX读者仪器，聚合单体溶液的光曝光后只发生在含有ampliTAG标记的目标地区。聚合物形成一种无毒的解决方案，以改善视觉对比度，成像和使用的一个简单的软件程序包（ampliVIEW）分析，随后可沾上。从整个联合国提取样本流感集成电路芯片检测结果可在约6个小时，和上面所述的ampliPHOX检测步骤，可以在大约30分钟完成。

方案

1。用RT - PCR样品扩增

1. 提取病毒RNA的临床物质或病毒隔离QIAcube全自动核酸提取平台一起使用Qiagen公司MinElute病毒自旋套件。拔牙是200μL标本与最终洗脱体积60μL。商店提取物在-70 ° C或较低，以供日后使用。
2. 在模板中自由区，准备上冰的RT - PCR扩增预混，根据制造商的协议。在RT - PCR技术结合生物素，使用制造商提供的dNTP混合液进行生物素化的dNTP混合物。使用生物素化的dNTP混合物的成本低于1美元/检测。也可用于替代方法，如使用生物素标记的引物生物素掺入。甲型流感混合添加引物的最终浓度为1.0μM，1.0微米流感乙，和内部控制的0.14微米。甲型流感引物放大矩阵基因片段（1032 NT产品），流感乙引物扩增非结构性的基因片段（811 NT产品）。每个流感集成电路芯片引物包含一个5'磷酸基团，以方便通过的lambda以下PCR扩增的核酸外切酶消化产生的单链DNA的引物。由此产生的单链的产品需要更短的双链等效杂交倍，并大大缩短了整体检测时间。一个预先准备好这些引物的混合物以及内部控制模板RNA可从InDevR感兴趣的研究人员在有限的基础。
3. 简要涡和分发18μL成薄壁PCR管的主结构。
4. 转让冰管到一个合适的工作区模板此外，并添加到每个反应管中加入2μl模板。
5. PCR管转移到热循环，并运行以下的温度曲线:逆转录50 ° 30分钟，激活酶失活/ 95 C ° 15分钟，30秒40 PCR周期为9....

讨论

这里介绍ampliPHOX比色法检测技术是一种快速，廉价的替代单一的颜色，密度更低的芯片应用荧光检测。示意图如图1所示，检测原理的基础上使用了光引发剂的标签（1B） 。含有一种单体溶液（1C）的存在，光线照射引起的光引发剂（ampliTAG），只有在标示的地区引发的聚合反应（1D）。虽然表现为流感的识别和亚型的DNA阵列，该技术可以扩展到检测到任何一个芯片上捕获生物素化的产品。作为一个例子，我们在使用不同的试剂化学聚合检测早期的工作表明，核酸和抗体为基础的^阵列，12人也显示为一个聚合为基础的系统的抗体和蛋白质为基础的应用的概念证明。在这种情况下，需要清除的惰性气体，利用不同的试剂化学^品 。13,14

流感低密度基因芯片和有代表性的图像的原理可以看出， 在图 2 。如图2a所示，该数组包含一个空间标记/斑点控制（红色）和14个独特的捕获序列（蓝色），发现一式三份。捕获序列氨基酸终止合成短（〜25 MER）的寡核苷酸，捕捉流感目标基因的特定类型或亚型的流感的代表。捕获的序列设.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
试剂/设备	制造商	目录＃	评论
Qiagen公司MinElute病毒自旋套件	Qiagen公司	57704	单60μL洗脱
QIAcube	Qiagen公司	9001292	可选
ABI 9800快速热循环仪	美国应用生物系统公司	4441166
Qiagen公司OneStep RT - PCR检测试剂盒	Qiagen公司	210210	不使用的试剂盒dNTPs
2X合模缓冲区	InDevR公司	MI - 5007
生物素标记的dNTP混合液	InDevR公司	MI - 5009
LAMBDA核酸外切酶	震中生物技术	LE032K	2500 ü，10U/μl
流感集成电路芯片引物组合	InDevR	N / A	尚未可供出售
轨道摇床	Madell技术	ZD - 9556 - A
洗箱	InDevR公司	MI - 4002
清洗架	InDevR公司	MI - 4003
2倍的杂交缓冲液	InDevR公司	MI - 5004
校准芯片	InDevR公司	AP - 5006
洗净缓冲器公元	InDevR公司	MI - 5005
ampliRED	InDevR公司	AP - 5004
ampliTAG	InDevR公司	AP - 5001
2X ampliTAG缓冲器	InDevR公司	AP - 5002
ampliPHY，ampliPHY增强剂	InDevR公司	AP - 5003