ampliPHOX 比色检测技术为微阵列提供了一种比荧光检测更经济的替代方案。该技术基于光聚合原理，可在几分钟内生成肉眼可见的固态聚合物斑点。随后通过一套简单而强大的软件对结果进行成像和自动解读。
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摘要
摘要
DNA 微阵列已成为一种强大的病原体检测工具。1-5 例如，已有大量研究展示了利用 DNA 微阵列对流感病毒进行分型和亚型鉴定的能力。6-11 在公共卫生和临床领域，通过 DNA 微阵列对流感病毒进行鉴定和亚型分类可用于早期检测、快速干预，并最大限度地减轻流感大流行的危害。目前，传统荧光检测法是最常用的微阵列检测方法。然而，随着微阵列技术逐步走向临床应用，1 若能以低成本且性能特征与荧光法相当的检测技术取代昂贵的仪器设备，将使微阵列检测更具吸引力并更具成本效益。
ampliPHOX 比色检测技术适用于科研应用，其检测限在传统荧光检测技术的一个数量级范围内11，其主要优势在于仪器成本比用于荧光微阵列检测的共聚焦微阵列扫描仪低约十倍。另一优势是仪器体积小巧，便于携带和灵活使用，而传统荧光检测设备则不具备这一特点。然而，由于聚合技术本身线性程度不及荧光检测，因此更适用于低密度微阵列应用，例如病原体检测微阵列，此类应用通常仅需判断特定序列是否存在（是/否结果）。目前，ampliPHOX 检测兼容的最高点阵密度为 ˜每阵列1800个点。由于点密度的限制，更高密度的微阵列不适用于ampliPHOX检测。
本文介绍了ampliPHOX比色检测技术，作为一种用于流感病毒检测与表征低密度微阵列（FluChip）的信号放大方法。尽管本实验方案以FluChip（一种DNA微阵列）作为ampliPHOX检测技术的具体应用实例，但任何包含生物素化靶标的微阵列均可采用类似方法进行标记与检测。微阵列的设计以及待捕获靶标的生物素化由用户自行完成。一旦生物素化靶标被捕获至阵列上，即可首先使用链霉亲和素-标签偶联物（ampliTAG）对阵列进行标记，从而开展ampliPHOX检测。随后在ampliPHOX Reader仪器的光照条件下，仅在含有ampliTAG标记靶标的区域发生单体溶液（ampliPHY）的聚合反应。所形成的聚合物可进一步用一种无毒溶液染色以增强视觉对比度，然后通过简单的软件包（ampliVIEW）进行成像与分析。整个FluChip检测流程从未经提取的样本到获得结果约需6小时，而上述ampliPHOX检测步骤可在约30分钟内完成。
方案
1. 使用 RT-PCR 进行样本扩增
- 使用Qiagen MinElute Virus Spin Kit结合QIAcube自动化核酸提取平台，从临床样本或病毒分离物中提取病毒RNA。以200 μl样本进行提取，最终洗脱体积为60 μl。提取物应储存于-70°C或更低温度下以备后续使用。
- 在无模板区域，按照制造商说明书在冰上配制RT-PCR主混合液。为在RT-PCR过程中引入生物素，使用生物素标记的dNTP混合物替代制造商提供的普通dNTP混合物。使用生物素化dNTP混合物的成本低于每检测1美元。也可采用其他引入生物素的方法，例如使用生物素标记的引物。添加引物混合物至以下终浓度：流感病毒A（Flu A）为1.0 μM，流感病毒B（Flu B）为1.0 μM，内参对照为0.14 μM。Flu A引物组扩增基质基因片段（1032 nt产物），Flu B引物组扩增非结构基因片段（811 nt产物）。每组FluChip引物中均包含一条5'端带磷酸基团的引物，以便在PCR后通过λ外切酶进行酶切消化，生成单链DNA。所获得的单链产物相较于双链产物显著缩短了杂交所需时间，从而大幅减少整个检测的总时长。上述引物混合物以及内参对照模板RNA可由InDevR公司向有需要的研究人员限量提供。
- 短暂涡旋混匀后，将18 μl主混合液分装至薄壁PCR管中。
- 将PCR管置于冰上转移至适合添加模板的工作区域，向每根反应管中加入2 μl模板。
- 将PCR管转移至热循环仪中，运行以下热循环程序：50°C逆转录30分钟，95°C酶失活/激活15分钟，随后进行40个PCR循环（95°C变性30秒，55°C退火30秒，72°C延伸1分钟），最后在72°C延伸10分钟。
2. RT-PCR 产物与低密度微阵列的杂交
- 为了为 FluChip 杂交制备单链 DNA，通过混合 1.0 μl λ 外切核酸酶、2.2 μl 配套反应缓冲液和 0.8 μl 无核酸酶水来配制酶消化混合液。上述体积适用于单个样品，但可根据需消化的样品总数按比例放大。从热循环仪中取出样品，向每个反应中加入 4 μl 已配制的混合液，以消化 PCR 产物的磷酸化链。将样品放回热循环仪，设定程序为 37 摄氏度孵育 15 分钟，随后 95 摄氏度孵育 10 分钟，以完成酶消化和热片段化步骤。
- 所使用的定制流感病毒微阵列由 Applied Microarrays Inc.（亚利桑那州坦佩）在醛基功能化玻璃载片上打印而成。5'-氨基末端的捕获序列与优化的点样缓冲液混合，最终浓度为 20 μM（阳性对照序列除外，其额外具有 3'-生物素修饰，点样最终浓度为 500 nM）。采用非接触式点样方法，最佳点样直径为 300 μm，点中心间距为 700 μm。
- 从储存盒中取出微阵列，撕下保护膜，将一次性杂交腔室牢固地压合在微阵列周围。
- 将载片放入含有 110 ml 纯化水的清洗盒中，在 60–90 rpm 的振荡器上进行 5 分钟的杂交前清洗。用纸巾轻轻接触杂交腔室边缘，使水分通过毛细作用被吸除，从而干燥阵列。
- 将 22 μl 的 2× 杂交缓冲液与每个片段化的单链 DNA 产物混合，用移液器将 40 μl 杂交溶液加入微阵列腔室中。
- 将载片置于密闭的湿化室中，杂交 60 分钟。
- 从湿化室中取出载片，先在冲洗瓶中用 Wash Buffer D 短暂冲洗阵列，然后放入载片架中。通常每张阵列使用 2 ml Wash Buffer D 进行冲洗。将装有载片的载片架放入含有 110 ml Wash Buffer A 的清洗盒中，置于振荡器上以 60–90 rpm 振荡 1 分钟。
- 从 Wash Buffer A 中取出载片架，用 Wash Buffer D 短暂冲洗，将载片架转移至含有 Wash Buffer B 的清洗盒中，并以 60–90 rpm 振荡 5 分钟。
- 轻轻干燥每张载片上的阵列，并将干燥后的载片放入湿化室中，为 ampliPHOX 比色检测步骤做准备。
3. ampliPHOX：使用 ampliTAG 标记杂交产物和校准芯片
- 为每个待处理的芯片，混合 10 μl ampliTAG、20 μl 2x ampliTAG 缓冲液和 10 μl 纯化水。可根据样本总数按比例调整试剂体积。确保准备足够的标记混合液，以满足所有样本芯片和所需校准芯片的用量。所需校准芯片的数量取决于您是进行完整校准（用于新仪器或新批次试剂）还是仅进行仪器检查。进行完整校准时，应标记 3 张校准芯片；进行试剂检查时，仅需标记 1 张校准芯片。请注意，在标记校准芯片之前，应使其经过先前针对流感芯片所述的预杂交洗涤步骤。
- 将 40 μl 标记混合液转移至每张芯片，在密闭湿盒中反应 5 分钟。
- 在将芯片载玻片放入玻片架之前，立即用冲洗瓶中的 Wash Buffer D 冲洗芯片。将玻片架转移至含有 110 ml Wash Buffer C 的容器中，在 60–90 rpm 条件下振荡 5 分钟。
- 使用另一个装有纯化水的洗涤容器，连续进行三次短暂的水浸以去除盐残留。通过将擦拭纸轻轻接触孔边缘的方式将芯片干燥。
- 此时，微阵列已成功用 ampliTAG 标记，可继续进行 ampliPHOX 检测流程的后续步骤。标记后芯片的光活化与成像应在 24 小时内完成；若需延迟使用，可将额外芯片存放在避光的玻片盒中。
4. ampliPHOX：校准、信号放大与成像
- 打开 ampliPHOX 读取仪，并确保 ampliVIEW 软件已准备就绪以进行光激活。
- 使用校准芯片确定最佳光激活时间。除了下文简要介绍外，该操作步骤在 ampliPHOX 操作手册中也有详细说明。校准芯片包含一系列生物素化对照序列的稀释液，用于优化检测的灵敏度，目标是使软件判定为阳性信号的校准芯片行数最大化。
- 将 ampliPHY 从 4°C 取出，使其恢复至室温，并短暂涡旋混匀。用移液器向 ampliPHY 小瓶中加入 3 μl ampliPHY 增强剂，充分涡旋 10 秒。
- 将 40 μl ampliPHY 溶液均匀转移至含有 ampliTAG 标记阵列的微阵列孔中，确保无气泡产生。每次使用后需盖上 ampliPHY 小瓶盖。将微阵列玻片插入 ampliPHOX 读取仪的光激活仓中。
- 对于第一个校准阵列，在软件左侧面板的“时间”框中使用默认光激活时间，点击绿色“开始”按钮启动光激活。完成后取出阵列，用纯水冲洗以去除多余的 ampliPHY。此时部分点位上应可见清晰的聚合物形成。
- 让聚合物斑点干燥 2 分钟，然后在阵列表面滴加两滴 ampliRED，染色反应持续 2 分钟。
- 随后，迅速用纯水冲洗微阵列，并用擦拭纸干燥。
- 将微阵列插入 ampliPHOX 读取仪的成像仓中，点击“成像”选项卡中的“捕获新图像”按钮。图像捕获完成后，调整裁剪区域并保存图像。
- 在“分析”选项卡中，选择校准芯片模板及“自动定位”按钮以开始分析。软件将自动生成显示定量结果的“汇总记录”。根据这些结果，将第二个校准阵列的光激活时间调整 10 秒，并重复上述步骤。
- 确定最佳光激活时间后，可使用与校准阵列相同的信号放大和成像程序处理样本阵列。
- 样本阵列图像捕获完成后，可创建适用于特定阵列布局的模板，例如本文所述的流感病毒阵列布局。ampliVIEW 软件能够执行自动图像分析，并为每个样本生成流感亚型鉴定结果。
5. 代表性结果：
图1. ampliPHOX比色检测方法的示意图。（A）生物素标记的目标DNA与芯片上每个位点杂交，（B）与ampliTAG结合。（C）随后加入ampliPHY溶液，（D）经光照形成可见的聚合物斑点。（E）生成的聚合物斑点再用无毒染料染色以增强对比度。
图 2. （A）流感低密度微阵列布局。序列 1-7 和 10-13 靶向甲型流感病毒，序列 8 和 9 靶向乙型流感病毒。（B）ampliPHOX 图像与（C）2009 年新发 H1N1（“猪流感”）样本的荧光图像，两种方法显示相同的检测模式。
图3. 从左至右分别为甲型流感病毒H3N2、人源H1N1、2009年新型H1N1（猪源）以及阴性样本的代表性ampliPHOX检测图像。三种亚型在芯片上均呈现出肉眼可辨的特异性信号模式。请注意，在阴性样本中仅可见MS2内参对照信号，表明RT-PCR扩增未受抑制。
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讨论
本文介绍的ampliPHOX比色检测技术是一种快速、低成本的单色荧光检测替代方法，适用于低密度微阵列应用。如图1所示，该检测原理基于光引发剂标记物（1B）的使用。在含有单体的溶液（1C）存在下，光照会促使光引发剂（ampliTAG）仅在标记区域（1D）触发聚合反应。尽管本研究以用于流感病毒鉴定与分型的DNA微阵列为例进行展示，但该技术可拓展用于检测微阵列上捕获的任何生物素化产物。例如，我们先前基于光聚合检测的研究曾采用不同的试剂化学体系，在核酸和抗体微阵列上均实现了验证12。其他研究者也已证明基于光聚合系统的抗体及蛋白质检测应用的概念可行性。在这些案例中，所采用的试剂化学体系不同，需使用惰性气体进行吹扫处理13,14。
流感低密度微阵列的示意图及代表性图像如图所示 图2如图2A所示，该阵列包含一个空间标记/点样对照（红色）和14种独特的捕获序列（蓝色），每种序列均三点重复点样。这些捕获序列为氨基末端合成短链（˜25 个碱基的寡核苷酸，设计用于捕获在遗传上代表特...
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披露
所有作者均为营利性机构 InDevR 公司的员工。InDevR 正在将本文所述的 ampliPHOX 技术进行商业化。
致谢
InDevR 感谢美国国立卫生研究院/国家过敏与传染病研究所（NIH/NIAID）U01AI070276 和 R43AI077112 项目对本工作的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Qiagen MinElute 病毒离心柱试剂盒 | Qiagen | 57704 | 单次 60 μl 洗脱 |
| QIAcube | Qiagen | 9001292 | 可选 |
| ABI 9800 快速热循环仪 | Applied Biosystems | 4441166 | |
| Qiagen OneStep RT-PCR 试剂盒 | Qiagen | 210210 | 试剂盒中的 dNTPs 未使用 |
| 2x 点样缓冲液 | InDevR Inc. | MI-5007 | |
| 生物素标记的 dNTP 混合物 | InDevR Inc. | MI-5009 | |
| λ 外切核酸酶 | Epicentre Biotechnologies | LE032K | 2500 U，10 U/μl |
| FluChip 引物混合物 | InDevR Inc. | N/A | 尚未上市销售 |
| 旋转摇床 | Madell Technology | ZD-9556-A | |
| 清洗槽 | InDevR Inc. | MI-4002 | |
| 清洗架 | InDevR Inc. | MI-4003 | |
| 2x 杂交缓冲液 | InDevR Inc. | MI-5004 | |
| 校准芯片 | InDevR Inc. | AP-5006 | |
| 洗涤缓冲液 A-D | InDevR Inc. | MI-5005 | |
| ampliRED | InDevR Inc. | AP-5004 | |
| ampliTAG | InDevR Inc. | AP-5001 | |
| 2x ampliTAG 缓冲液 | InDevR Inc. | AP-5002 | |
| ampliPHY, ampliPHY 增强剂 | InDevR Inc. | AP-5003 |
参考文献
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