介绍了一种基于点击化学的方法，可对斑马鱼胚胎中炔烃标记的聚糖进行快速、无创且高效的标记。本研究对处于原肠胚形成晚期的斑马鱼胚胎外包层中的岩藻糖基化聚糖进行了成像。
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摘要
摘要
成像糖类 体内 最近通过使用生物正交化学报告策略，向细胞或生物体施加叠氮或炔基标记的单糖得以实现1, 2修饰后的单糖经糖类生物合成机制加工后，被整合到细胞表面的糖缀合物中。随后，生物正交的叠氮或炔基标签可与荧光探针共价结合用于成像，或与亲和探针结合用于富集及糖蛋白组学分析。本实验方案描述了通常用于斑马鱼胚胎中岩藻糖化糖链无创成像的操作步骤，包括：1）向单细胞期胚胎显微注射GDP-5-炔基岩藻糖（GDP-FucAl）；2）通过生物相容性的Cu(I)催化叠氮-炔基环加成反应（CuAAC），利用叠氮连接的荧光染料对斑马鱼胚胎外包层中的岩藻糖化糖链进行标记；3）共聚焦显微镜成像3此处所述方法可轻松拓展用于可视化其他类型的聚糖，例如含唾液酸的聚糖。4 和 N-N-乙酰半乳糖胺5, 6在斑马鱼及其他生物体的发育过程中。
方案
1. 卵的收集与去壳
- 收集斑马鱼卵并转移至35 mm培养皿中，尽可能吸除多余水体，随后加入含1 mg/ml Pronease E的E3胚胎培养基（5 mM NaCl，0.17 mM KCl，0.33 mM CaCl₂，0.33 mM MgSO₄，pH 7.0）。2·2H2O，0.33 mM MgSO₄4，pH = 7.4）以消化卵膜。
- 3–5 分钟后，将培养皿中的内容合并至一个盛有鱼水的烧杯中（每升蒸馏水中含 60 mg “Instant Ocean”）2O)，然后轻轻将卵转移到烧杯中，让卵“落入”水中。
- 用鱼水冲洗卵三次。大多数卵将从其卵膜中释放出来。
- 使用火焰抛光的玻璃巴斯德吸管，将去壳的卵转移至盛有E3胚胎培养基的琼脂糖包被培养皿中。
2. 使用 GDP-FucAl 进行显微注射
- 按照已报道的方案准备显微注射用培养皿7。
- 将去壳膜的卵转移至盛有E3胚胎培养基的注射培养皿中。
- 准备显微注射针，并加入2 μL注射溶液。该溶液包含20 mM化学酶法合成的GDP-FucAl8，以及作为示踪剂的Alexa Fluor 594-葡聚糖（5% w/v）或酚红上样染料（0.1% w/v），溶于0.2 M KCl中。作为阴性对照，将注射溶液中的GDP-FucAl替换为GDP-岩藻糖。
- 折断针尖并调节注射压力和持续时间，使注射液滴体积为1 nL9。
- 向卵中注射1 nL上述任一溶液。
- 将注射后的卵转移至涂有琼脂糖的培养皿中，培养皿内含E3胚胎培养基。
- 在28 °C下孵育卵，并在受精后3至4小时内移除未受精卵。
3. BTTES-Cu(I) 催化的点击化学反应
- 当胚胎发育至所需阶段（例如晚期原肠胚、组织分节期和早期幼虫期）时，用琼脂糖包被96孔板的底部。
- 向每个孔中加入92 μL E3胚胎培养基，随后加入4 μL Alexa Fluor-488叠氮化物（溶于H2O的2.5 mM储备液）、2 μL BTTES-CuSO4 6:1复合物，并轻轻振荡混匀。
- 使用火焰抛光的玻璃巴斯德移液管将胚胎转移至含有点击化学试剂的孔中。每个孔中的胚胎数量应少于五个。
- 加入2.5 μL新配制的抗坏血酸钠（溶于H2O的100 mM储备液）以启动点击反应3。各试剂的终浓度为：Alexa Fluor-488叠氮化物：100 μM；CuSO4：50 μM；BTTES：300 μM；抗坏血酸钠：2.5 mM。
- 反应3分钟后，加入2 μL浴铜灵磺酸盐（溶于H2O的50 mM储备液），这是一种生物相容性铜螯合剂，用于淬灭反应，然后立即加入100 μL E3胚胎培养基进行稀释。
- 将胚胎转移至玻璃培养皿中，并用15 mL E3胚胎培养基对处理后的胚胎清洗两次。
4. 成像
- 在 MatTek 玻璃底小室培养皿上滴加一滴超低熔点琼脂糖（1.2% (w/v)，溶于 E3 胚胎培养基），并将一个胚胎放入琼脂糖滴中。
- 将胚胎置于背侧或侧位，将培养皿置于冰上 5 分钟，使琼脂糖滴凝固。随后轻轻向培养皿中加入 E3 胚胎培养基，直至完全覆盖琼脂糖滴。
- 使用共聚焦显微镜依次采集荧光和明场图像。所有胚胎图像均以 5 μm 的步进间隔采集。复合图像使用 ImageJ 软件进行制作。
5. 典型结果
图1展示了我们的两步标记策略的工作流程。图2显示了通过BTTES介导的CuAAC反应在受精后9.5小时（hpf）对斑马鱼胚胎进行标记的结果。BTTES是一种基于三（三唑基甲基）胺的配体，当其与原位生成的Cu(I)配位时，可显著加速CuAAC反应，并能在活体系统中快速促进环加成反应，且无明显毒性。在完成3分钟的点击反应后，我们即可检测到经GDP-FucAl处理的胚胎中强烈的标记信号（图2，左侧面板）。而显微注射了GDP-岩藻糖的对照组胚胎仅检测到背景荧光（图2，右侧面板）。
图1. 标记斑马鱼胚胎包被层中岩藻糖基化聚糖的策略。
图2. 通过BTTES-Cu(I)催化的点击化学反应在斑马鱼胚胎发育过程中对岩藻糖基化聚糖进行体内成像。在单细胞阶段的斑马鱼胚胎中微量注射单剂量的GDP-FucAl，随后让其发育至9.5 hpf。然后将胚胎与BTTES-Cu(I)催化的Alexa Fluor 488-叠氮化物反应。使用共聚焦显微镜对反应后的胚胎进行成像。Alexa Fluor 488荧光的最大强度z投影图像（上图）；明场图像（下图）。比例尺：100 μm。
故障排除
| 问题 | 原因 | 解决方法 |
| 胚胎看起来不健康 | 显微注射溶液中含有污染物 | 核苷酸糖的纯度应高于85%。请检查来源。 |
| 反应后无标记信号 | 铜离子浓度低于30 μM | 加入胚胎时需注意避免因添加过量E3胚胎培养基而稀释反应体系，当铜离子浓度低于30 μM时，反应速率会显著下降。 |
| 反应后胚胎死亡 | 胚胎操作不当 | 确保移液管经过火焰抛光，且反应容器内壁覆盖有一层极薄的0.5%琼脂糖。 |
| 图像出现斑点状背景 | 加入胚胎前试剂未充分混匀 | 按照推荐顺序依次加入试剂，并确保在加入胚胎前点击化学试剂已充分混匀。 |
| 图像显示胚胎受损 | 剧烈振荡在反应过程中损伤了胚胎 | 胚胎加入溶液后，轻轻振荡不超过10秒。 |
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讨论
成像生物分子 体内 在本视频中，我们展示了如何通过向单细胞期斑马鱼胚胎显微注射GDP-FucAl，并利用BTTES介导的生物相容性铜催化叠氮-炔环加成反应（CuAAC）进行第二步荧光染料偶联，从而实现对斑马鱼胚胎包被层中岩藻糖基化糖链的标记，该方法为其在天然环境中的生物学活性研究提供了关键见解。3在2-3分钟内即可实现稳定的标记，标记的聚糖最早在2.5 hpf即可被检测到。重要的是，单次给予GDP-FucAl可在96 hpf时仍产生可检测的炔烃依赖性荧光信号。该方法可进一步扩展至多色延时成像实验，通过两次连续的CuAAC反应监测炔烃标记的岩藻糖苷在发育中斑马鱼体内的转运过程。然而，由于点击化学试剂组织穿透深度有限，标记仅局限于胚盘的外包层。通过对经GDP-FucAl代谢处理的胚胎进行固定和通透化处理，亦可实现对内部体部结构的标记。由于根据斑马鱼命运图谱，可在囊胚期（4 hpf）至原肠胚形成初期（5.3 hpf）之间将炔烃标记的供体胚胎细胞移植至未标记的受体胚胎中10, 11利用这种操作，可能使我们能够追踪这些聚糖在胚胎发育过程中特定谱系中的分布情况。
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
本工作部分得到了美国国立卫生研究院（GM093282 资助 P.W.；3U54AI057158-06S1 资助 R.D.S.）以及阿尔伯特·爱因斯坦医学院启动资金的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 五水合硫酸铜(II) | Sigma-Aldrich | 203165 | |
| Alexa Fluor 488 叠氮化物 | Invitrogen | A10266 | |
| 葡聚糖，Alexa Fluor 594 标记 | Invitrogen | D-22913 | |
| (+)-L-抗坏血酸钠 | Sigma-Aldrich | A7631 | |
| 浴铜灵二磺酸钠 | Acros Organics | 164060010 | |
| 玻璃底微型培养皿 | MatTek Corp. | P35G-1.5-14-C |
参考文献
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重印与许可
