通过代谢标记与生物正交点击化学对斑马鱼胚胎中的聚糖进行成像

摘要

介绍了一种基于点击化学的方法，可对斑马鱼胚胎中炔烃标记的聚糖进行快速、无创且高效的标记。本研究对处于原肠胚形成晚期的斑马鱼胚胎外包层中的岩藻糖基化聚糖进行了成像。

摘要

成像糖类 体内 最近通过使用生物正交化学报告策略，向细胞或生物体施加叠氮或炔基标记的单糖得以实现^{1, 2}修饰后的单糖经糖类生物合成机制加工后，被整合到细胞表面的糖缀合物中。随后，生物正交的叠氮或炔基标签可与荧光探针共价结合用于成像，或与亲和探针结合用于富集及糖蛋白组学分析。本实验方案描述了通常用于斑马鱼胚胎中岩藻糖化糖链无创成像的操作步骤，包括：1）向单细胞期胚胎显微注射GDP-5-炔基岩藻糖（GDP-FucAl）；2）通过生物相容性的Cu(I)催化叠氮-炔基环加成反应（CuAAC），利用叠氮连接的荧光染料对斑马鱼胚胎外包层中的岩藻糖化糖链进行标记；3）共聚焦显微镜成像³此处所述方法可轻松拓展用于可视化其他类型的聚糖，例如含唾液酸的聚糖。⁴ 和 N-N-乙酰半乳糖胺^{5, 6}在斑马鱼及其他生物体的发育过程中。

方案

1. 卵的收集与去壳

1. 收集斑马鱼卵并转移至35 mm培养皿中，尽可能吸除多余水体，随后加入含1 mg/ml Pronease E的E3胚胎培养基（5 mM NaCl，0.17 mM KCl，0.33 mM CaCl₂，0.33 mM MgSO₄，pH 7.0）。₂·2H₂O，0.33 mM MgSO₄₄，pH = 7.4）以消化卵膜。
2. 3–5 分钟后，将培养皿中的内容合并至一个盛有鱼水的烧杯中（每升蒸馏水中含 60 mg “Instant Ocean”）₂O)，然后轻轻将卵转移到烧杯中，让卵“落入”水中。
3. 用鱼水冲洗卵三次。大多数卵将从其卵膜中释放出来。
4. 使用火焰抛光的玻璃巴斯德吸管，将去壳的卵转移至盛有E3胚胎培养基的琼脂糖包被培养皿中。

2. 使用 GDP-FucAl 进行显微注射

1. 按照已报道的方案准备显微注射用培养皿⁷。
2. 将去壳膜的卵转移至盛有E3胚胎培养基的注射培养皿中。
3. 准备显微注射针，并加入2 μL注射溶液。该溶液包含20 mM化学酶法合成的GDP-FucAl⁸，以及作为示踪剂的Alexa Fluor 594-葡聚糖（5% w/v）或酚红上样染料（0.1% w/v），溶于0....

讨论

成像生物分子 体内 在本视频中，我们展示了如何通过向单细胞期斑马鱼胚胎显微注射GDP-FucAl，并利用BTTES介导的生物相容性铜催化叠氮-炔环加成反应（CuAAC）进行第二步荧光染料偶联，从而实现对斑马鱼胚胎包被层中岩藻糖基化糖链的标记，该方法为其在天然环境中的生物学活性研究提供了关键见解。³在2-3分钟内即可实现稳定的标记，标记的聚糖最早在2.5 hpf即可被检测到。重要的是，单次给予GDP-FucAl可在96 hpf时仍产生可检测的炔烃依赖性荧光信号。该方法可进一步扩展至多色延时成像实验，通过两次连续的CuAAC反应监测炔烃标记的岩藻糖苷在发育中斑马鱼体内的转运过程。然而，由于点击化学试剂组织穿透深度有限，标记仅局限于胚盘的外包层。通过对经GDP-FucAl代谢处理的胚胎进行固定和通透化处理，亦可实现对内部体部结构的标记。由于根据斑马鱼命运图谱，可在囊胚期（4 hpf）至原肠胚形成初期（5.3 hpf）之间将炔烃标记的供体胚胎细胞移植至未标记的受体胚胎中^{10, 11}利用这种操作，可能使我们能够追踪这些聚糖在胚胎发育过程中特定谱系中的分布情况。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
五水合硫酸铜(II)	Sigma-Aldrich	203165
Alexa Fluor 488 叠氮化物	Invitrogen	A10266
葡聚糖，Alexa Fluor 594 标记	Invitrogen	D-22913
(+)-L-抗坏血酸钠	Sigma-Aldrich	A7631
浴铜灵二磺酸钠	Acros Organics	164060010
玻璃底微型培养皿	MatTek Corp.	P35G-1.5-14-C