只有通过断层扫描技术才能实现无损的体积可视化，其中最有效的方法是X射线显微计算机断层扫描（CT）。
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摘要
摘要
只有通过断层扫描技术才能实现无损体积可视化，其中最有效的方法是X射线显微计算机断层扫描（μCT）。
高分辨率显微计算机断层扫描（μCT）是一种非常灵活且精确的技术（分辨率达1-2微米），可用于离体生物样本的三维检测1, 2。与电子断层扫描相比，μCT可检测厚度达4厘米的样本。该技术仅需数小时的测量时间，而组织学方法则需数周。此外，μCT不依赖于二维体视学模型，因此可作为组织学方法的补充，在某些情况下甚至可取代组织学方法3, 4，后者既耗时又具有破坏性。μCT中的样本处理与定位操作简便，无需高真空或低温环境，从而避免了这些条件可能对结构造成的不利影响。样本被置于微焦点X射线源与探测器之间，进行180°或360°旋转；探测器包含闪烁体和高精度CCD相机。对每个角度采集一幅二维图像，随后利用多种可用算法之一重建整个三维体积5-7。三维分辨率随旋转步长的减小而提高。本视频方案展示了样本制备、固定、定位以及高分辨率成像的主要步骤。
方案
1. 样品制备
- 取出待检测组织后，可将矿化组织置于仪器中进行成像。对小鼠股骨进行成像时，应遵循以下步骤：
- 从妊娠18.5天（E18.5）的C57/Bl6胚胎中取下死后腿部组织。
- 使用环氧树脂或其他胶水密封聚苯乙烯移液器吸头（20–200 μl）的窄端，并将工作缓冲液（PBS或其他）填充至吸头中。
- 将腿部组织紧密地插入吸头中，并用Parafilm封膜密封另一端。
- 将移液器吸头放入合适的支架中，并按照第3章的方案进行操作。为观察小鼠胚胎腿部的股骨，仪器设置为40 kV和200 μA。为实现8 μm分辨率，需采集1000张投影图像，放大倍数为4倍。
- 非矿化组织需先进行固定和染色处理，以增强目标组织的X射线衰减能力，具体可采用多种现有方案之一8,9。对于大鼠肺组织及类似样本，其制备方案如下：
- 将非小细胞肺癌（NSCLC）NCI-H460细胞原位植入裸鼠肺部
- 植入后约4周可检测到肺部癌结节
- 处死大鼠，并立即用含肝素的生理盐水灌注
- 通过左心室注射稀释的Microfil染料溶液（Flowtech公司产品，2 ml 化合物溶液、3 ml 稀释剂和0.3 ml 固化剂）以标记支气管循环
- 取出大鼠的肺和心脏组织
- 将样本固定（参见方案第2章），通过将其紧密插入50 ml塑料离心管中实现固定
- 在管底放置浸有乙醇的纱布，以形成饱和乙醇气氛
- 将离心管用胶水固定或旋紧在仪器的支架上
- 继续设置成像参数（第3章）。为完整成像大鼠肺组织，X射线源设置为40 kV和100 μA。为达到16 μm分辨率，需在0.5倍放大条件下采集2500张投影图像。
2. 样品固定
在高分辨率下，测量过程中必须避免样品位置发生任何变化。为此，需将样品牢固地固定在与其尺寸匹配的塑料容器中。可使用聚苯乙烯移液器吸头、塑料巴斯德吸管或专门制作的塑料支架来实现固定。根据实验要求，样品可在空气中、乙醇或缓冲溶液中进行观察。图1展示了小鼠胚胎腿部在仪器中的典型固定方式及最终定位。
图 1. 胚胎小鼠后肢在微计算机断层扫描仪中的最终放置位置。
3. 设置采集参数：X射线电压和电流、CCD曝光时间
- 将样品放入样品 holder 中，然后置于仪器的旋转台上
- 以任意设定的电压和电流拍摄第一张 X 射线图像
- 如果图像过暗，应首先增加光子数量，即略微提高电流；如果仍不足，则应略微提高 X 射线光子的能量，即提高 X 射线管的电压
- 如果图像过亮，应首先降低电压，然后降低电流
- 可通过像素合并（binning）提高图像亮度。Binning 为 1 时，图像中每个像素的强度被单独记录；而 binning 为 2 时，则将每个 2×2 像素矩阵的强度求和。此时图像亮度约为 binning 1 时的 4 倍，但分辨率仅为原来的一半
- 在设定最佳亮度后，需优化相机的曝光时间，以在获得最佳对比度与控制实验合理时长之间取得平衡
- 可通过使用滤光片改善图像对比度，特别是对低吸收样品而言；滤光片可减少光子通量，尤其是低能量光子的通量
4. 样品放置
- 选择工作放大倍数。可选的放大倍数为 0.5x、4x、10x、20x 和 40x。随着放大倍数的增加，视场范围会减小。
- 通过调节X射线源与样品之间以及样品与探测器之间的距离，获得最佳分辨率和视场范围。增大源到样品的距离会减小视场范围并提高分辨率；而增大样品到探测器的距离则具有相反的效果。
在所有角度下，投影图像中均应包含需要以三维形式观察的整个区域。应通过在不同角度下旋转样品，并将样品尽可能靠近旋转轴来检查这一点。具体操作步骤如下：
- 在 0 度位置拍摄图像，然后将样品旋转至 -20 度。如果目标体积发生横向偏移，则应通过重新调整旋转轴的位置来校正。
- 校正后，将样品旋转至另一角度并再次校正位置，重复此过程，直至在 -90 至 90 度的所有角度下，感兴趣区域均位于图像范围内。
5. 高分辨率断层图像
- 测量过程中，样品每次旋转一个小角度，每个角度采集一幅投影图像。图像总数需在期望的分辨率与测量时间及文件大小之间进行权衡。如图2所示，每幅投影图像均包含样品中所有切片相互叠加的信息，因此无法揭示样品的三维结构。
图 2。大鼠肺部在旋转角度为 0°（A）、45°（B）和 90°（C）时的投影图像。
- 只有在获取至少 -90 至 90 度范围内的投影图像后，才能进行样品体积的重建。重建过程耗时在 10 分钟到 2 小时之间，具体取决于所使用的软件和投影数量。同样，三维图像的最终质量是在期望的分辨率、所需花费的时间以及最终文件大小之间权衡的结果。
6. 图像尺度校准
重建图像中的像素级别（值）对该图像而言是唯一的。为了比较两幅不同的图像，必须为每幅图像施加一个唯一的强度标度。
- 使用与样品相同的实验条件，对标准模体进行一次断层扫描
- 利用模体获得的数值重新校准样品图像。最常用的尺度是亨氏（或CT）尺度。对于4倍放大倍率，将背景值15,000（对应水或PBS）替换为0，将骨组织的最大值35,000替换为标准的亨氏值3000。其他像素值根据上述界限通过线性插值或外推获得。
7. 图像处理与分析
获得高分辨率图像后，必须使用图像分析软件提取相关信息。所使用的软件包必须能够处理非常大的文件（最大可达 20Gb）。
8. 典型结果
图3显示了一只C57/Bl6小鼠在胚胎发育第18.5天（E18.5）时股骨的图像，此时距矿化过程启动已过去四天。矿化层清晰可见（呈白色），而在此制备样本中软组织不可见。我们共采集了1000张投影图像，线性放大倍数为4倍，最终分辨率为8微米。对图1所示的体渲染图像进行仔细分析后显示，骨体积分数（矿化组织所占骨体积的比例）为0.18，骨矿密度为723 mg/cm3。这些数值使我们能够将该结构与其他发育阶段的骨骼进行比较。
图 3. 小鼠胚胎股骨三维图像的不同表现形式。图中显示了横断面（横截面）（A）、矢状面（内侧-外侧）切面（B）以及体积渲染的截图（C）。
图4显示了一只12周龄雌性裸鼠（RNU）的肺部三维图像，该小鼠通过原位移植了非小细胞肺癌（NSCLC）NCI-H460细胞。共采集了2500张投影图像，线性放大倍数为0.5倍，最终分辨率达到16微米。图像中可见Microfil染色的血管结构（可分辨至20微米直径）。图像分析显示，移植后4周形成了多个癌性结节，占据肺部总体积的显著比例（17%）。大部分肺部染色信号位于肿瘤的外周区域。值得注意的是，如图4B所示，多个血管也存在于结节内部，根据初步分析，其体积约占结节总体积的3%。
图4. 大鼠肺部生长的癌结节的三维图像。展示了容积渲染的快照（A）和通过该容积的切面（B）。癌结节以箭头标示。
视频 1. 图 1 中小鼠股骨的容积渲染。 点击此处观看视频。
视频 2. 图 2 中大鼠肺部的容积渲染。 点击此处观看视频。
视频 3. 肺部连续切片。结节在大多数切片中表现为灰色区域。点击此处观看视频
讨论
C57/Bl6 小鼠在胚胎发育第18.5天（E18.5）时，已处于矿化过程启动后的第四天。在此发育阶段，未来的骨组织由多层矿化的类骨质构成，如图3所示，结构清晰可见。需要强调的是，矿化组织可使用不同仪器在较低分辨率下进行观察，此类仪器对样品处理的要求较低。本实验方案（以及所用的显微CT仪器）除了提供更高分辨率外，还为用户提供了最大程度的灵活性，以选择最适合测量的几何参数。
图4的结果显示，在原位肺癌动物模型中，人非小细胞肺癌可诱导血管募集和新生血管形成。我们认为，在测量过程中肺组织既未发生移动，其形状也未发生改变。操作者在进行断层扫描时应特别注意避免此类变化。对于某些样品，尤其是较软的组织，必须设计特殊的固定装置，以在测量期间完全固定样品。然而，由于肿瘤周围存在大量造影剂渗漏，导致无法对周围血管进行可靠定量。因此，图像边缘区域受到染色剂污染，这在视频2和视频3中尤为明显。我们无法避免这种溢出，但有关癌结节的有用信息（包括其大小、形状以及内部血管的存在）并未受到影响。我们可以明确得出结论：至少对于本研究中所观察的支气管循环而言，周围血管参与了肿瘤的灌注，且肿瘤内部也存在一定程度的灌注。
致谢
研究在以色列魏茨曼科学研究所的欧文和切尔纳·莫斯科维茨纳米与生物纳米成像中心进行。
我们感谢 Orna Yeger 在设计和实施本实验方案过程中提供的帮助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 在图像采集过程中，我们使用了由美国康科德Xradia公司生产的MICRO XCT-400微焦点X射线断层扫描系统。 | |||
| 图像采用ImageJ（NIH，美国）、Avizo（VSG，法国）和MicroView（通用电气，美国）软件包进行处理和分析。也可使用其他任何可用的图像分析软件替代。 |
参考文献
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