采用脉动流灌注的离体、通气并插管小鼠肺脏的表征

摘要

以下方案概述了分离、通气并连接小鼠肺脏以测量稳态或脉动性肺血管压力-流量关系的过程，旨在量化血流、气流、气道变化及血管变化对右心室后负荷的影响。

摘要

分离、通气并插管的小鼠肺制备模型可实现对肺血管稳态和脉动压力-流量关系的测量，同时独立调控肺动脉血流速率、血流波形、气道压力和左心房压力。肺血管阻力通过多点稳态压力-流量曲线计算得出；肺血管阻抗则通过在不同频率下获得的脉动压力-流量曲线计算。目前临床上已认识到，阻抗相较于阻力更能准确反映右心室后负荷，因为它包含了血管顺应性的影响，而这种影响在肺循环中尤其不可忽略。阻抗的三个重要参数——零赫兹阻抗 Z₀、特征阻抗 Z_C 和波反射指数 R_W——分别反映了可供血流通过的远端动脉横截面积、近端动脉僵硬度以及上下游阻抗不匹配程度。在分离、通气并灌注的肺中所获得的所有结果均不受交感神经系统张力、容量状态及麻醉影响。我们已应用该技术量化肺栓塞和慢性缺氧对阻力和阻抗的影响，并利用 Z_C 的压力依赖性来区分血管活性药物和疾病的作用部位（即近端与远端）。此外，当该技术与基因工程小鼠品系的肺组织联合使用时，可明确分子水平缺陷对肺血管结构与功能的影响。

方案

在本实验方案中，我们展示了一种离体、通气且灌注的小鼠肺组织制备方法，该方法此前已被用于量化肺栓塞和慢性缺氧对肺血管脉动性压力-流量关系的影响（Tuchscherer, Webster, & Chesler, 2006; Tuchscherer et al., 2007）。简言之，将小鼠肺组织通过手术从周围组织中分离后，置于恒温灌流腔（IL-1；Harvard Apparatus，Holliston，MA）中，并通过呼吸机控制模块（VCM-R）配合计时器计数模块（TCM；Harvard Apparatus）进行通气。肺血管系统采用注射泵（Cole-Parmer，Vernon Hills，IL）灌注预热的含3.5% Ficoll的RPMI 1640细胞培养基，以产生稳定的流动波形；同时可并联使用高频振荡泵（Bose -Electro Force，Eden Prairie，MN）与注射泵协同工作，以生成脉动性的肺血管流动波形。采用压力传感器（P75，Harvard Apparatus）测量瞬时肺动脉压（PAP）和左心房压（LAP）。瞬时血流速率（Q）通过串联式流量计（Transonic Systems, Inc.，Ithaca，NY）测定。基于上述测量数据可推导出脉动性压力-流量关系，从而为肺血管生理学与病理学以及右心室后负荷提供深入见解。

1. 仪器设备：

1. 离体肺装置，包括小鼠呼吸机
2. 数据采集系统及装有 LabView 程序的计算机
3. 两个压力传感器和用于灌注液流速测量的流量计
4. 用于气道流速测量的压力传感器和流量计（气流传感器）
5. 高频振荡泵及装有 Win Test 程序的计算机
6. 支架/变焦显微镜、光源灯
7. 用于 IL-1 系统的高输出泵恒温水浴

2. 准备IL-1系统

1. 通过水浴加热至 37°C 的蒸馏水被循环注入 IL-1 系统内部。
2. 所有泵、换能器和 IL-1 插管通过洁净的管路连接，所有管路均用加热至 37°C 的蒸馏水冲洗。必须去除可能进入肺部并引起水肿的气泡。从振荡流泵到流量传感器以及从流量传感器到肺动脉插管的管路用 1% PBS 冲洗。
3. 通过关闭插管阀门、打开通向大气的阀门，然后按下 PLUGSYS 放大器上的自动调零按钮，对 P75 压力换能器进行调零。随后，关闭通向大气的阀门，并打开通向插管的阀门。
4. 润湿 IL-1 系统通气路径中的陶瓷多孔部件以提供湿度。

3. 溶液

1. 配制体积分数为3.5%的Ficoll-RPMI溶液，并对培养基进行无菌过滤。过滤可确保培养基中无大颗粒物质，避免其意外栓塞肺部。使用无菌培养基还可降低肺部突发性水肿的发生概率。手术时准备一支10 ml注射器装满RPMI，每个实验组另准备一支60 ml注射器装满RPMI。将灌注液置于37 °C水浴中预热。
2. 按每100克小鼠体重500 IU的剂量准备1 ml肝素溶液（约为估计值）。肝素钠盐的活性为158 IU/mg。对于一只约25 g重的小鼠，取1.25 mg肝素钠盐与1 ml PBS溶液在小型微量离心管中混合。

4. 小鼠通气

1. 将戊巴比妥钠溶液按每公斤体重150 mg的剂量对小鼠进行腹腔注射后，通过用力夹捏其足掌来确认是否达到深度麻醉状态。若无反应，则将小鼠前肢用图钉固定于软木板上以保持术中稳定。注意：在整个实验过程中，需持续密切观察动物状态以监测麻醉深度。足部的图钉固定以及频繁的切口操作可作为有害刺激，若动物对此无反应，则表明其仍处于外科麻醉水平。
2. 用95%酒精喷洒胸部以浸湿毛发，使用直头镊子夹住颈部皮肤，用直剪剪出约1 cm的皮肤切口。
3. 暴露颈部内部后，清除所有白色腺体组织和浅层肌肉，寻找食管和气管。将食管和气管从两侧及后方的周围组织中分离出来。
4. 将小型弯头镊子插入气管下方，并在对侧夹住一段缝合线。将缝合线从气管下方穿过，并打一个松散的外科结。此时不要拉紧缝合线或打结。
5. 用小剪刀在气管上剪一个微斜的“V”形切口，注意不要完全切断气管。将软木板及小鼠移至加热的IL-1系统上。使用两把钝头镊子，分别夹住气管插管和“V”形切口下方的气管组织，然后将气管插管经“V”形切口滑入气管内。收紧环绕气管与气管插管的缝合线，以固定插管位置，随后打结。
6. 开始通气（吸气相50%，呼吸频率90次/分钟，含深吸气），使用室温空气进行通气。

5. 灌注通气小鼠

5.1. 进入右心室以注射肝素

1. 再次用酒精喷洒小鼠胸部，以重新润湿毛发。使用直头镊子和直剪刀去除肋骨上方胸部的所有皮肤。沿胸骨向上剪开。提起两侧皮肤，然后沿下肋骨边缘剪开皮肤。
2. 用镊子夹住胸骨末端的剑突，用直剪刀在膈肌上剪开一个小孔。用镊子夹住膈肌，将其从肋骨上剪下并移除。
3. 再次用左手镊子夹住剑突，使用球头弯剪沿胸骨向上剪开，并剪断肋骨，注意避免损伤肺、心脏或血管（可利用剪刀的球头端作为引导）。操作过程中可能会有出血，但只要剪刀刃紧贴胸骨，就不会剪到心脏和肺组织。
4. 夹住左侧肋骨，根据需要剪除部分肋骨以充分暴露心脏。缓慢向右心室注射 0.1 ml 肝素溶液。此步骤对防止肺部血栓形成至关重要，血栓会损伤内皮细胞并影响灌注效果。肝素必须在心脏仍在跳动时注射。

5.2. 插管主肺动脉

1. 使用镊子的背部（圆头端）轻轻将肺从肋骨壁推开，剪除其余的肋骨（左右两侧）。抓取肺组织本身会损伤 delicate 组织。剪刀尖端与肺组织的偶然接触也会造成损伤。
2. 将显微镜移至肺上方。剪除心脏表面的腺体和脂肪组织。用镊子将其从动脉和静脉上拉开，然后在组织处于张力状态下用弹簧剪刀剪除。
3. 使用另一把钝头镊子，从心脏顶部、左心房/心室下方由右向左 scooping，使镊子尖端滑入主动脉和肺动脉（PA）下方。操作时需小心——镊子不应受到阻力。使用钝头镊子可降低意外穿破肺动脉或主动脉的风险。
4. 一旦镊子尖端置于主动脉和肺动脉下方，取一段缝线并穿过。打一个松散的外科结。不要拉紧缝线或打结。
5. 可选步骤：使用角度剪刀切除下半身。沿肋骨和脊柱向下剪开；剪断主动脉和腔静脉会导致大量血液流出——使用棉签止血。将切除组织放入袋中以待处理。
6. 用10 ml注射器中的4 ml RPMI预充肺动脉插管。仔细检查所有管路是否无气泡。用蒸馏水或含有气泡的液体灌注肺会导致水肿。
7. 在右心室游离壁上剪一个小切口，插入肺动脉插管，方向朝下并向右。插管尖端应能透过透明的肺动脉壁可见。注入少量RPMI以确认位置正确。收紧围绕插管、主动脉和肺动脉的缝线并打结。注意，此时主动脉也已被结扎，因此在左心房插管完成前不应开始实际灌注。

5.3. 左心房插管

1. 在左心室下部切开一个切口，并插入左心房（LA）插管，方向朝上。沿此方向插入时可能需要轻微压力以打开二尖瓣。当插管尖端到达正确位置时，将顺利通过并牢固固定，无需缝合。

5.4. 开始灌注

1. 使用10 ml注射器手动以每分钟0.3 ml的速度灌注RPMI，直至流出管路中可见RPMI（与无色的PBS相比呈微粉红色）。若流出管路中无液体流动，请重新调整左心房插管的位置。若经重新调整后仍无法获得流出液，则检查肺动脉是否存在泄漏。肺动脉的泄漏或撕裂无法修复，此时应终止实验。
2. 通过IL-1系统将60 ml注射器连接至肺动脉插管，开始以1 ml/min的速度灌注灌注液，检查是否有泄漏，并确保肺组织变白，这表明RPMI正在置换肺内的血液。以低流速灌注两分钟。

6. 测量脉动性和稳态肺压力-流量关系

1. 进行脉动流研究时，首先根据先前实验的结果，在 WinTest 程序中将振荡泵活塞位移设定为各频率所需的水平。由于肺部结构和力学特性存在个体差异，需针对每只小鼠调整位移。将稳态流设定至所需水平。打开通向振荡泵的阀门，并在运行振荡流程序（Wintest 程序）前立即开始记录数据。打开数据文件，在 Excel 中绘制实验测得的流量（Q）。通过调整 Wintest 程序中各频率下的振荡泵活塞位移，使 Q_max 和 Q_min 达到预期值。
2. 进行稳态流试验时，关闭通向振荡泵的阀门。若该阀门保持开启，振荡泵会起到电容作用，削弱不同流速之间的变化。在每个流速下至少采集 10 秒数据，或直至肺动脉压力变化不超过 5%。
3. 无论是进行脉动流还是稳态流测量，均应在数据采集前以恒定压力重新进行通气。数据采集结束后应立即恢复通气。
4. 注意观察气道管路中是否出现 RPMI 液体，这是发生水肿的迹象，一旦发现应终止实验。同时，切勿让 RPMI 液体进入气道压力或流量传感器，以免损坏传感器。

7. 代表性结果：

代表性稳态结果：

在离体肺实验装置中，研究者不仅能够独立控制肺血流量 Q，还能独立控制气道压 P_air 和左心房压 LAP。这种设置具有优势，因为 Q、P_air 和 LAP 会影响肺血管系统及由此产生的肺动脉压 PAP。另一个优点是所获得的结果不受交感神经系统张力¹、容量状态和麻醉²的影响。

图1显示了在P_air 固定且LAP固定或变化的情况下，由阶梯式改变Q所引起的PAP变化。需要注意的是，在离体肺准备中，LAP套管通常连接到将灌注液引向废液容器的管路。在此管路存在时，由于泊肃叶流动，LAP与Q呈线性关系。然而，可以通过手动调节出口和废液容器的高度，以提供一个恒定的非零LAP，或者可以移除管路，使LAP为零且与Q无关。

典型脉动结果：

尽管该系统可生成任意的脉动流波形，但我们通常在频率为 f = 1、2、5、10、15 和 20 Hz 时生成形式为 Q = 3 + 2 sin (2fπt) ml/min 的血流，以评估肺血管的线性化阻抗（图2：上图）。根据测得的肺动脉压（PAP）、左心房压（LAP）和血流（Q），通过傅里叶变换将每个设定正弦血流频率下的 ΔP = PAP-LAP 和 Q 的一个完整正弦周期分解为一系列正弦谐波，从而计算肺血管阻抗的幅值（Z）和相位（θ）。压力变换与血流变换的比值得到肺血管阻抗 PVZ = FFT (ΔP)/FFT(Q)，其包含幅值 Z 和相位 θ。输入阻抗 Z₀、特征阻抗 Z_C 和波反射指数 R_W 均由阻抗幅值计算得出。具体而言，Z₀ 由所有频率下 0 阶谐波（f = 0 Hz）处 Z 的平均值确定；Z_C 由 1 阶最小值（5 Hz）至 20 Hz 范围内 Z 的平均值确定；R_W 则按公式 (Z₀-Z_C)/(Z₀+Z_C) ³ 计算。

图1. 不同LAP与P_air组合下，稳态流动波形（第一行）及相应压力（第二行：PAP、P_air、LAP）随时间的变化。最下一行为PAP与Q的关系曲线。（A）和（B）中，由于连接了流出管道，LAP随Q的增加而升高，随Q的减少而降低。在（C）中移除了该管道，因此LAP保持恒定且与Q无关。（D）和（E）中通过手动调节出口管道高度，使LAP维持在较高水平，但仍与Q无关。P_air分别设定为吸气末（A、C、D）或呼气末（B、E）压力。

图 2. 脉动流波形 Q（上图）和相应压力（下图：PAP、LAP 和 P_air）随时间变化。根据这些脉动性肺压力-流量关系可计算出 PVZ，其反映右心室总后负荷。

讨论

手术中的关键步骤

在将肋骨从肺部剥离时，必须格外小心。肺部在充气过程中必须完全暴露，并且不受周围组织的阻碍，但同时在分离过程中不能受损。可使用镊子的钝端等扁平物体将肺部与胸壁分开，以便剪刀能够清晰地进行切割。另一个关键步骤是在肺动脉和主动脉周围放置缝合线。使用钝头直镊可降低刺破肺动脉的风险。手术过程中的最后一个关键步骤是插管的放置。如果插管位置过高，位于大血管离开心脏平面的上方，则可能导致插管牵拉肺动脉或肺静脉。如果左心房内的插管位置过低，则可能阻塞流入左肺的血流，导致更多血流进入右肺，从而升高肺动脉压（PAP），并加速右肺水肿的发展。

数据采集过程中的关键步骤

应尽快完成稳态流动的数据采集，尤其是高流速条件下，以尽量减少肺血管系统暴露于高流体剪切应力的情况。根据我们的经验，高剪切应力会导致肺水肿。此外，剪切应力的快速升高也可能引起肺水肿。在稳态流动条件下，每分钟流速增加6 ml/min不会引发水肿。在特定条件下，可实现超过5 ml/min的稳态流速而不会产生水肿。我们已成功对...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1 ml 注射器	Fisher Scientific	14-829-10F
10 ml 注射器	Fisher Scientific	14-823-2A
60 ml 注射器	Fisher Scientific	13-689-8
含 GLN 6/PK 的 RPMI 培养基	Fisher Scientific	MT10040CV
瓶顶滤器	Fisher Scientific	09-761-57
Ficoll PM 70	Sigma-Aldrich	F2878-100g
肝素	Sigma-Aldrich
Y27632	Sigma-Aldrich	Y0503
带角度球状虹膜剪刀	Fine Science Tools	14109-09
Vannas 弹簧剪刀 - 4 mm 刀片	Fine Science Tools	15018-10
精细虹膜剪刀 - 直型	Fine Science Tools	14106-09
Dumont #5/45 镊子	Fine Science Tools	11251-35
Dumont 医用生物学镊子	Fine Science Tools	11254-20
Lauda E100 ECO-line 003	VWR international	相当于 Lauda-Brinkmann E-103, 62400-922
IL-1 离体灌注小鼠肺系统	Harvard Apparatus	739904
用于 PLUGSYS 模块的 P75 血压换能器	Harvard Apparatus	730020
TS410 流量模块	Transonic	TS410
ME 4 PXN 精密 PXN 在线流量传感器	Transonic	ME 4 PXN
Cole-Parmer 多通道注射泵	Cole-Parmer	EW-74900-20
Nembutal 50MG/ML 20ML 小瓶	Amatheon