我们介绍了光漂白方法，包括光漂白后荧光恢复（FRAP）和光漂白过程中的荧光丢失（FLIP），用于监测胚胎干细胞（ES细胞）中染色质蛋白的动力学。染色质蛋白动力学被认为是研究染色质可塑性的手段之一，在多能性细胞中其活性增强。
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摘要
摘要
光漂白后荧光恢复（Fluorescence Recovery After Photobleaching, FRAP）和光漂白过程中荧光丢失（Fluorescence Loss In Photobleaching, FLIP）技术能够以良好的空间和时间分辨率研究活细胞中蛋白质的动力学行为。本文介绍了如何在小鼠胚胎干细胞（ES细胞）中对染色质相关蛋白（包括H1和HP1）进行FRAP和FLIP实验。在FRAP实验中，将目的蛋白与绿色荧光蛋白（GFP）或其衍生物（如YFP、CFP、Cherry等）融合，并通过瞬时或稳定转染的方式导入细胞。在表达荧光蛋白的细胞中，使用高强度的聚焦激光对一个相对较小的感兴趣区域（ROI）进行漂白。激光波长的选择需与所用的荧光蛋白相匹配。激光照射会不可逆地淬灭该区域内荧光分子的信号，随后通过时间序列成像监测漂白区域荧光信号的恢复过程——该恢复由未漂白分子替换已漂白分子所介导。由此生成的荧光恢复曲线可提供有关蛋白质移动性的信息。若荧光分子完全静止不动，则不会观察到荧光恢复现象。作为互补方法，FLIP实验则对同一位置反复进行激光漂白，并在细胞其他荧光区域测量信号强度的变化。因此，FLIP实验检测的是荧光信号的衰减而非恢复，可用于评估蛋白质的移动性以及蛋白质在不同细胞区室之间的穿梭行为。瞬时结合是染色质相关蛋白的普遍特性。尽管在稳态下任一时刻大部分染色质蛋白均结合于染色质上，但这种结合是短暂的，大多数染色质蛋白在染色质上具有较高的周转率，停留时间通常为数秒量级。这些特性对于实现基因组表达的高度可塑性至关重要1。因此，利用染色质结构蛋白的GFP融合体进行光漂白实验特别适用于评估染色质可塑性，尤其是在胚胎干细胞（ES细胞）中，染色质蛋白（包括异染色质蛋白1（HP1）、连接组蛋白H1及核心组蛋白）的动态交换速率高于分化细胞2,3。
方案
1. 铺板 ES 细胞
T = 0 小时
MEF 铺板
- 使用明胶对活细胞成像用8孔μ-载玻片（ibidi；Munich, Germany）进行包被，或在腔室盖玻片（Lab-Tek；Rochester, NY）或玻璃底培养皿（MatTek；Ashland, MA）中进行包被。孵育5–30分钟，吸除未结合的明胶。
- 在250 μl含10%胎牛血清（FBS）的DMEM完全培养基中，每孔接种22,000个MEF细胞。将细胞置于组织培养孵箱（37°C，5% CO2）中培养。
T = 6 小时
ES 细胞接种
- 吸去 DMEM 培养基。
- 在每个经 MEF 包被的孔中，加入 15,000 个 R1 细胞/孔，总体积为 250 μl 的胚胎干细胞培养基 [添加 10% 胚胎干细胞级胎牛血清（FBS）、1 mM 丙酮酸钠、0.1 mM 非必需氨基酸、0.1 mM β-巯基乙醇和 1000 U/ml 白血病抑制因子（LIF）]，以使次日细胞融合度达到 30% 至 50%。
2. 转染ES细胞
T = 24 小时
瞬时转染
- 将每个孔中的 ES 细胞....
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讨论
与大多数现有技术（涉及从细胞群体或固定细胞中纯化染色质）不同，FRAP 实验可在活细胞中追踪染色质蛋白动态变化。我们发现染色质蛋白的动态性是染色质可塑性的一个良好指标。然而，由于该方法需要将目标基因与 GFP 融合，荧光标签的添加可能干扰蛋白功能。因此，在进行 FRAP 实验之前，必须严格验证融合蛋白是否与其天然对应物具有相同的性质和功能。理想的金标准是在基因敲除细胞系中利用 GFP 融合蛋白回补内源蛋白的功能。但基因敲除细胞系并非总是可获得，且在许多情况下，蛋白缺失并不表现出明确的表型。尽管如此，仍可通过比较融合蛋白与内源蛋白的亚细胞分布、表达水平以及结合伴侣等方式，验证其是否能够实现适当的局部替代。
验证后，必须将GFP融合蛋白转染至ES细胞中。我们发现TransIT在ES细胞中效果良好，转染效率可超过50%。瞬时转染操作简便，可直接进行后续实验；但稳定转染通常更为优越，因其可确保细胞在表达目标融合蛋白的情况下长期存活，并实现较低且均一的表达水平。其他将GFP标签用于蛋白标记的方法包括利用combineering技术在BAC中进行GFP基因标记10，或直接.......
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致谢
我们感谢 Meshorer 实验室的成员，特别是 Shai Melcer、Adi Alajem、Edupuganti Raghu Ram、Badi Sri Sailaja、Anna Mattout 和 Alva Biran，他们每天对光漂白实验提供了宝贵的建议和问题排查支持。EM 是约瑟夫·H·和贝尔·R·布劳恩生命科学高级讲师，得到以色列科学基金会（ISF 943/09）、以色列卫生部（6007）、欧盟（IRG-206872 和 238176）、以色列癌症研究基金会、希伯来大学内部应用医学基金以及以色列心理生物学研究所的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5671 | |
| 明胶 | Merck & Co., Inc. | 1.04078 | |
| Opti-MEM | GIBCO，由 Life Technologies 提供 | 31985 | |
| TransIT-LT1 | Mirus Bio LLC | MIR2300 | |
| 8孔 μ-载片 | ibidi | 80826 |
参考文献
- Phair, R. D. Global nature of dynamic protein-chromatin interactions in vivo: three-dimensional genome scanning and dynamic interaction networks of chromatin proteins. Mol Cell Biol. 24, 6393-6402 (2004).
- Meshorer, E.
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