响应 Wnt 信号通路在 Xenopus 外胚层中荧光蛋白的极性转位

摘要

非洲爪蟾胚胎外胚层已成为研究细胞极性的理想模型。本文描述了一种检测方法，用于评估外胚层细胞中荧光蛋白的亚细胞分布。该实验方案将有助于解答与信号通路空间调控相关的问题。

摘要

细胞极性是真核细胞的一种基本特性，在胚胎发育过程中受到内在和外在因素的动态调控 ^{1, 2}其中一个参与该调控的信号通路是Wnt通路，该通路在胚胎发生过程中多次被利用，并且对人类疾病具有重要意义^{3, 4, 5}该信号通路的多个分子组分以空间限制的方式协同调控信号传导，但其潜在机制尚未完全阐明。 非洲爪蟾 胚胎上皮细胞是研究各种信号蛋白亚细胞定位的优良体系。荧光融合蛋白在其中表达 非洲爪蟾 通过RNA显微注射获得胚胎后，制备外胚层外植体，并利用落射荧光显微技术评估蛋白质定位。本实验方案中，我们描述了Diversin的亚细胞定位方法；Diversin是一种细胞质蛋白，已被证实参与信号转导及细胞极性的决定。^{6, 7} 在……中可视化 非洲爪蟾 外胚层细胞用于研究Wnt信号转导⁸共表达Wnt配体或Frizzled受体可改变与红色荧光蛋白（RFP）融合的Diversin的分布，并以极化方式将其招募至细胞膜 ^{8, 9}。这一点 离体 该方案将是一项有用的补充 体外 培养的哺乳动物细胞研究，其中信号传导的空间调控与完整组织不同，且更难以分析。

方案

1. 体外 受精作用 非洲爪蟾 卵

1. 在实验前12小时，向雌性青蛙注射人绒毛膜促性腺激素（400单位/只），然后采集其卵子。
2. 将卵子放入少量（0.5–1 ml）1× Marc's 修饰林格液（MMR）中¹⁰使卵子受精 体外 用一小块解剖出的睾丸组织。2–3 分钟后，加入 0.1× MMR 液以完全覆盖卵子表面。20 分钟后，用 3% 半胱氨酸盐酸盐溶液（用氢氧化钠调节至 pH 8）去除卵胶膜。卵子用 0.1× MMR 洗涤三次，然后置于低温培养箱（13℃）中保存° C）用于注射。
3. 受精卵培养至2-4细胞期。注射时，将胚胎转移至含有3% Ficoll和0.5× MMR的溶液中。

2. RNA 显微注射

1. 使用 mMessage mMachine 试剂盒（Ambion）从线性化 DNA 模板合成 RNA，并用无 RNase 水稀释至储存浓度 0.1–1 μg/μl。注射用 RNA 的最佳剂量需通过预实验确定。Diversin-RFP、膜标记物 GFP-CAAX 和 Frizzled 8 的 RNA 注射剂量为每次 0.1–1 ng。
2. 注射针由毛细管使用拉针仪制备，随后用磨针仪修整。每次注射前，需用水校准每根注射针，确保每次注射释放 10 nl 液体。
3. 进行注射时，将胚胎置于塑料培养皿中，放入含 3% Ficoll 和 0.5× MMR 的大液滴内。使用 Narishige 微注射仪将 1 μl RNA 溶液吸入注射针中，向 8 细胞期胚胎的动物极卵裂球内注射 10 nl RNA，重复 2–3 次。注射后的胚胎转移至 12 孔板的一个孔中。

3. 准备外胚层外植体

1. 当注射后的胚胎发育至早期原肠胚阶段时，将其转移至已涂有1%琼脂糖的3 cm塑料培养皿中的0.6 × MMR溶液中。使用镊子手动去除卵黄膜。利用钨针和毛细环从胚胎上切取外胚层外植体。
2. 将外胚层外植体转移至玻璃小瓶中，用含3.7%甲醛的磷酸盐缓冲液（PBS）固定30分钟。固定后的外植体用PBS洗涤三次（每次10分钟）。在第三次洗涤液中加入DAPI以染色细胞核。
3. 将外植体置于载玻片上。在载玻片上粘贴两条透明胶带，将外植体置于两条胶带之间。由于外植体的外表面具有色素，因此应使外植体的内侧面朝向显微镜物镜。加入两到三滴20 μl的封片液（含25 mg/ml DABCO抗荧光淬灭剂的70%甘油PBS溶液）¹¹，然后加盖盖玻片。

4. 荧光显微镜下对外植体进行成像

1. 使用配备适当滤光片的蔡司 Axioplan 荧光显微镜观察样品。
2. 利用 Apotome 附件拍摄图像，以从多个独立的外植体中可视化特定层面。

5. 冷冻切片

冷冻切片是观察细胞内荧光蛋白分布的一种替代方法，更适用于免疫染色。在发育第10期，胚胎用Dent固定液（20% DMSO，80%甲醇）固定1–2小时，用PBS洗涤后，包埋于15%鱼胶/15%蔗糖溶液¹¹中。将包埋的胚胎在干冰上迅速冷冻，并在Leica冷冻切片机上进行切片。横切面将包含继承了注射RNA及其翻译蛋白产物的外胚层细胞。切片可保留荧光信号，可用特异性抗体进行免疫染色，再用荧光标记的二抗孵育。细胞核用DAPI染色。封片剂与上文所述相同。成像方法亦同上文所述。

6. 代表性结果：

图1. Frizzled 受体将 Diversin 招募至细胞膜。 表达 Frizzled 8 (Xfz8) 和 Div-RFP RNA 的外胚层细胞显示 Div-RFP 定位于细胞膜，而非中心体（通过γ-微管蛋白共染色揭示）。实验示意图位于上方；下方显示典型的横截面图像。

讨论

我们已使用上述方案对 Diversin 的亚细胞定位进行了表征。在动物极外植体中，Diversin-RFP 位于细胞核附近，并在冰冻切片中与中心体标志物 γ-微管蛋白（g-tubulin）共定位（图1）。一旦确定了蛋白质的亚细胞定位，便可构建缺失突变体，以确定负责该亚细胞定位的蛋白结构域是否必要且充分。通过该方法，已将 Diversin 的中心体定位结构域定位于蛋白的中部及羧基末端结构域，这两个区域均含有卷曲螺旋（coiled-coil）基序⁸。

该相同方案可用于研究信号转导引起的蛋白质定位变化。我们发现，分泌型Wnt蛋白可促使Div-RFP重定位至细胞膜附近的点状结构，而Fz8则将Div-RFP招募至细胞膜上的斑块区域（图1）。我们进一步发现，羧基末端结构域本身对于膜招募并非必需，但对于极性膜招募是必需的。

综上所述，上述实验方案将有助于在用特定生长因子或信号蛋白刺激细胞后，开展蛋白质-蛋白质相互作用以及蛋白质向不同细胞区室定位的多种研究。