光学分辨率光声显微成像（OR-PAM）是一种能够成像光学吸收对比度的新兴技术 体内 以细胞级分辨率和高灵敏度进行成像。本文提供了光声显微镜（OR-PAM）实验操作的可视化指南，包括系统配置、系统校准、典型实验流程 体内 实验步骤和功能成像方案。
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摘要
摘要
光学显微技术能够提供细胞和细胞器水平的重要信息，已被广泛认为是一种关键的生物医学技术。in vivo 三维（3-D）光学显微技术的主要手段——单光子/多光子荧光显微术和光学相干断层成像（OCT），分别对荧光和光学散射对比度表现出极高的灵敏度。然而，生物组织的光吸收对比度蕴含着关键的生理/病理信息，目前尚无法有效检测。
生物医学光声成像技术的出现催生了光学显微成像的一个新分支——光学分辨率光声显微成像（OR-PAM）1，该技术将光学辐照聚焦至衍射极限，从而实现细胞1甚至亚细胞2水平的横向分辨率。作为现有光学显微技术的重要补充，OR-PAM 至少带来了两项创新。首先也是最重要的一点，OR-PAM 能以极高的灵敏度（即 100%）检测光学吸收对比。将 OR-PAM 与荧光显微成像3或基于光散射的光学相干断层扫描（OCT）4（或两者同时）相结合，可全面获取生物组织的光学特性。其次，OR-PAM 将光学吸收编码为声波信号，不同于荧光显微和 OCT 中的纯光学过程，从而实现无背景干扰的检测。OR-PAM 中的声学检测减轻了光散射对信号衰减的影响，并自然消除了激发与检测之间可能存在的干扰（即串扰），而由于激发光谱与荧光光谱的重叠，这一问题在荧光显微成像中较为常见。
光学吸收成像特有的OR-PAM自发明以来已展现出广泛的生物医学应用，包括但不限于神经科学5, 6，眼科学7, 8，血管生物学9以及皮肤科学10在本视频中，我们讲授OR-PAM的系统配置与校准，以及相关实验操作流程 体内 功能性微血管成像
方案
1. 系统配置
- 光学照射
- 光学照射光源：半导体泵浦固体脉冲激光器（INNOSLAB, Edgewave）和染料激光器（CBR-D, Sirah）。
- 输出激光束（脉冲宽度：7 ns）通过一个聚光透镜（LA1131, Thorlabs）聚焦，穿过一个50-μm针孔（P50C, Thorlabs）。
- 针孔位置略偏离聚光透镜的焦点，以使针孔直径与基模光束直径匹配，实现有效的空间滤波。
- 滤波后的光束通过中性密度滤光片（NDC-50C-2M, Thorlabs）衰减，然后耦合进单模光纤（P1-460A-FC-2, Thorlabs）。
- 光纤输出端填充显微物镜（RMS4X, Thorlabs）的后孔径，从而在570 nm波长下实现约2.6 μm的衍射极限光学聚焦。
- 超声检测
- 超声换能器：中心频率50-MHz（V214-BB-RM, Olympus-NDT）。
- 超声换能器连接至自制的光声信号合束器11，用于超声检测，且与衍射极限的光学照射共轴对准。
- 在合束器底部研磨出一个球形空腔，形成声学透镜。该声学透镜在水中数值孔径为0.5，在50-MHz中心频率下产生43 μm的声学焦斑直径。
- 光学焦点与声学焦点共焦对准，以最大化检测灵敏度。
- 声学耦合
- 采用干式超声耦合方式，避免将实验动物浸入水中，而早期光声成像系统曾使用水浸法12。
- 在培养皿（直径9 cm）底部开设成像窗口，并用一种超声和光学透明的聚乙烯膜密封。
- 在聚乙烯膜与待成像物体之间涂抹超声耦合凝胶（Clear Image, SonoTech），将产生的光声波从样品耦合至培养皿，而培养皿内的去离子水进一步将声波传递至浸没的OR-PAM成像探头。
- 电子系统
- 超声换能器检测到的光声信号由两级级联放大器（ZFL 500LN, Mini-Circuits）进行放大。
- 放大后的信号由14位数据采集（DAQ）板（CompuScope 14200, Gage Applied Sciences）以200 MS/s的采样率进行数字化。
- 扫描方案
- OR-PAM成像探头在水平面（x-y平面）上的二维（2-D）光栅扫描由个人计算机控制，计算机同时触发DAQ板和泵浦激光器。触发信号与DAQ板的时钟输出信号同步。
- 二维扫描器的快轴定义为横截面扫描方向（B扫描）。
- 通过沿慢轴移动成像探头，可采集一系列B扫描图像，从而构建三维体数据，该数据可直接以三维渲染方式显示，或以二维最大振幅投影（MAP）图像形式呈现。
2. 系统校准
- 使用脉冲回波超声和超声反射器确定声学焦平面的位置（即从触发信号到最大脉冲回波超声信号的时间延迟）。此步骤仅在构建光声显微成像系统（OR-PAM）时需执行一次。
- 最大化单模光纤的耦合效率。
- 在光学吸收物体（例如一段黑色胶带）表面涂抹超声耦合凝胶，并将其轻轻贴附于盛有去离子水的培养皿成像窗口下方。
- 将成像探头浸入水中，并清除声学透镜下方滞留的气泡。
- 调节成像探头，使吸收体产生的光声信号来自声学焦平面，可通过声学延迟时间进行判断。
- 调节显微物镜的垂直位置（即 z 方向位置），以最大化来自平面物体的光声信号幅度。信号幅度达到最大表明光学焦点在垂直方向上与声学焦点对齐。
- 调节显微物镜的水平位置（即 x 和 y 方向位置），直至目标产生的光声信号呈现对称分布。信号的对称性表明光学焦点在水平方向上与声学焦点对齐。
- 重复步骤 2.6 和 2.7，直至光声信号在对称性和幅度上均达到最优。
3. 一个示例性实验流程-体内 小鼠耳部血管的光声显微成像
- 裸鼠无需执行此步骤。通过腹腔注射麻醉剂混合液使动物麻醉[配方：1 ml 氯胺酮（100 mg/ml）、0.1 ml 赛拉嗪（100 mg/ml）和 8.9 ml 生理盐水；剂量：0.1 ml/10 g]。剃除耳部毛发，并使用 Surgi Cream（目录号：82565，American International Industries）进一步去除残留毛发，随后用去离子水清洁。请注意，此类脱毛处理可能轻微刺激皮肤血管，因此最好在计划实验前 24 小时进行。
- 开启光声激光系统，并检查系统准直情况。
- 使用吸入气体雾化的 3% 异氟烷对小鼠进行麻醉（典型气流速率为 1.0–1.5 l/min，具体取决于动物体重），并在整个实验过程中以 1% 异氟烷维持麻醉状态。建议使用医用级空气作为吸入气体，以维持小鼠正常的生理状态。
- 将小鼠转移至立体定位装置，并使用加热垫将其体温控制在 37 °C。
- 将小鼠耳朵展平于塑料板上，并在耳部表面涂抹一层超声耦合剂。避免在耦合剂中产生气泡。然后将耳朵置于成像窗口下方，缓慢抬高动物载物台，直至超声耦合剂接触聚乙烯膜底部。需保持轻柔接触，因为将耳朵压向膜可能影响耳部血流。
- 将脉搏血氧仪夹在小鼠腿部或尾部以监测其生理状态，并在眼睛上涂抹眼膏以防止干燥及激光意外损伤小鼠眼睛。
- 降低成像头，直至声学透镜浸入去离子水中，并清除声学透镜下方滞留的气泡。
- 检查激光能量密度，确保其符合美国国家标准协会13规定的激光安全标准。激光能量密度不得超过 20 mJ/cm2，当激光束聚焦于皮肤表面下 150 μm 时，相当于 80 nJ 的激光脉冲能量。
- 将激光设置为外触发模式并开始试扫描。调节成像头的 z 轴位置，直至最强光声信号来自声学焦平面。
- 设置正确的扫描参数并开始正式图像采集。
- 实验结束后，关闭激光器，将成像头从去离子水中提起，降低动物载物台以释放小鼠，用去离子水清洁小鼠耳朵，关闭麻醉系统和温度控制器，并将小鼠从立体定位装置上卸下。
- 若需重复成像，将小鼠放入环境温度设定为 37 °C 的培养箱中。待小鼠自然苏醒后送回动物饲养设施。否则，按照动物实验规程实施安乐死并妥善处理。
4. 血红蛋白总浓度和氧饱和度的功能性光声显微成像
- 氧合血红蛋白（HbO2）和脱氧血红蛋白（HbR）是血红蛋白的两种主要形式，也是可见光谱范围内主要的内源性光声信号来源。HbO2 和 HbR 具有不同的光学吸收光谱，因此可通过光谱分辨来定量血红蛋白的总浓度（HbT）和氧饱和度（sO2）5。以下是两条选择 sO2 测量合适光学波长的建议：
- 应选择在血红蛋白吸收光谱的 Q 波段内（即 550–600 nm）的波长，以确保足够的信噪比和足够的组织穿透深度。
- 推荐选择 HbO2 与 HbR 吸收系数差异显著的波长（例如以 HbR 为主的 561 nm 和以 HbO2 为主的 578 nm）。
除了sO2外，HbT还可通过将[HbR]与[HbO2]相加计算得出，或在血红蛋白摩尔消光系数光谱的等吸收点波长（例如530 nm、545 nm、570 nm和584 nm）14处直接测量，因为在这些波长下HbR和HbO2具有相等的摩尔消光系数。
5. 代表性结果：
图1显示了通过双波长（561和570 nm）光声显微成像技术（OR-PAM）对活体裸鼠耳部成像所获得的血管解剖结构及血氧饱和度（sO2）。对该感兴趣区域（图像尺寸：10 mm × 10 mm；步长：2.5 μm × 5 μm）进行双波长sO2测量的典型图像采集时间约为80分钟。
图1. 体内 光学分辨率光声显微成像。裸鼠耳部（A）总血红蛋白浓度的MAP图像（在570 nm处获取），显示血管解剖结构，以及（B）血红蛋白氧饱和度的MAP图像（在561 nm和570 nm处获取）。（C）为（A）图中框选区域的放大图。（A）图中的比例尺同时适用于（A）和（B）。
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讨论
在本视频中，我们详细介绍了光声显微镜（OR-PAM）的实验方案，包括系统配置、系统校准以及典型的实验操作流程。这种无需标记、无创的OR-PAM技术已实现对单个毛细血管水平的微血管功能与代谢研究，因而有望拓展我们对微循环相关生理与病理过程的理解。目前，Microphotoacoustics公司正在生产该OR-PAM系统。
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披露
所有实验动物操作均按照圣路易斯华盛顿大学医学院动物研究委员会批准的实验动物方案进行。
致谢
作者感谢Lynnea Brumbaugh博士对本文手稿的仔细审阅。本工作由美国国立卫生研究院基金R01 EB000712、R01 EB008085、R01 CA134539、U54 CA136398以及5P60 DK02057933资助。汪立宏教授在Microphotoacoustics, Inc.和Endra, Inc.拥有经济利益，但这些公司未参与本研究的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 自制声光束合器： | |||
| 直角棱镜 | Edmund Scientific | NT32-545 | |
| 菱形棱镜 | Edmund Scientific | NT49-419 | |
| 硅油 | Clearco Products | 1000cSt | |
| OR-PAM 系统 | Microphotoacoustics |
参考文献
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