三维光学分辨率光声显微成像

摘要

光学分辨率光声显微成像（OR-PAM）是一种能够成像光学吸收对比度的新兴技术 体内 以细胞级分辨率和高灵敏度进行成像。本文提供了光声显微镜（OR-PAM）实验操作的可视化指南，包括系统配置、系统校准、典型实验流程 体内 实验步骤和功能成像方案。

摘要

光学显微技术能够提供细胞和细胞器水平的重要信息，已被广泛认为是一种关键的生物医学技术。in vivo 三维（3-D）光学显微技术的主要手段——单光子/多光子荧光显微术和光学相干断层成像（OCT），分别对荧光和光学散射对比度表现出极高的灵敏度。然而，生物组织的光吸收对比度蕴含着关键的生理/病理信息，目前尚无法有效检测。

生物医学光声成像技术的出现催生了光学显微成像的一个新分支——光学分辨率光声显微成像（OR-PAM）¹，该技术将光学辐照聚焦至衍射极限，从而实现细胞¹甚至亚细胞²水平的横向分辨率。作为现有光学显微技术的重要补充，OR-PAM 至少带来了两项创新。首先也是最重要的一点，OR-PAM 能以极高的灵敏度（即 100%）检测光学吸收对比。将 OR-PAM 与荧光显微成像³或基于光散射的光学相干断层扫描（OCT）⁴（或两者同时）相结合，可全面获取生物组织的光学特性。其次，OR-PAM 将光学吸收编码为声波信号，不同于荧光显微和 OCT 中的纯光学过程，从而实现无背景干扰的检测。OR-PAM 中的声学检测减轻了光散射对信号衰减的影响，并自然消除了激发与检测之间可能存在的干扰（即串扰），而由于激发光谱与荧光光谱的重叠，这一问题在荧光显微成像中较为常见。

光学吸收成像特有的OR-PAM自发明以来已展现出广泛的生物医学应用，包括但不限于神经科学^{5, 6}，眼科学^{7, 8}，血管生物学⁹以及皮肤科学¹⁰在本视频中，我们讲授OR-PAM的系统配置与校准，以及相关实验操作流程 体内 功能性微血管成像

方案

1. 系统配置

1. 光学照射
   1. 光学照射光源：半导体泵浦固体脉冲激光器（INNOSLAB, Edgewave）和染料激光器（CBR-D, Sirah）。
   2. 输出激光束（脉冲宽度：7 ns）通过一个聚光透镜（LA1131, Thorlabs）聚焦，穿过一个50-μm针孔（P50C, Thorlabs）。
   3. 针孔位置略偏离聚光透镜的焦点，以使针孔直径与基模光束直径匹配，实现有效的空间滤波。
   4. 滤波后的光束通过中性密度滤光片（NDC-50C-2M, Thorlabs）衰减，然后耦合进单模光纤（P1-460A-FC-2, Thorlabs）。
   5. 光纤输出端填充显微物镜（RMS4X, Thorlabs）的后孔径，从而在570 nm波长下实现约2.6 μm的衍射极限光学聚焦。
2. 超声检测
   1. 超声换能器：中心频率50-MHz（V214-BB-RM, Olympus-NDT）。
   2. 超声换能器连接至自制的光声信号合束器¹¹，用于超声检测，且与衍射极限的光学照射共轴对准。
   3. 在合束器底部研磨出一个球形空腔，形成声学透镜。该声学透镜在水中数值孔径为0.5，在50-MHz中心频率下产生43 μm的声学焦斑直径。
   4. 光学焦点与声学焦点共焦对准，以最大化检测灵敏度。

讨论

在本视频中，我们详细介绍了光声显微镜（OR-PAM）的实验方案，包括系统配置、系统校准以及典型的实验操作流程。这种无需标记、无创的OR-PAM技术已实现对单个毛细血管水平的微血管功能与代谢研究，因而有望拓展我们对微循环相关生理与病理过程的理解。目前，Microphotoacoustics公司正在生产该OR-PAM系统。

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材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
自制声光束合器：
直角棱镜	Edmund Scientific	NT32-545
菱形棱镜	Edmund Scientific	NT49-419
硅油	Clearco Products	1000cSt
OR-PAM 系统	Microphotoacoustics