本文描述了一种基于液体培养和分配表达荧光报告蛋白的C. elegans菌株的方法，该方法无需昂贵的分选设备。该策略可应用于多种可诱导的C. elegans基因，用于药物筛选或污染物的生物传感检测。
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摘要
摘要
高通量筛选（HTS）是鉴定生物过程化学调节剂的一种强大方法。然而，在基于细胞培养模型的筛选中鉴定出的许多化合物，通常在体内被发现具有毒性或药理学上无活性in vivo1-2。在整体动物模型中进行筛选有助于避免这些问题，并加速药物开发进程。
C. elegans 是一种适用于高通量筛选（HTS）的多细胞模式生物。其体型微小（<1 mm），可在液体中经济地培养和分配。此外，C. elegans 也是实验操作最为便捷的动物模型之一，能够快速而详细地鉴定药物的作用机制3。
我们描述了一种用于培养和分配荧光标记的秀丽隐杆线虫（C. elegans）的实验方案，可用于化学文库的高通量筛选，或检测能够改变特定基因表达的环境污染物。大量发育同步的线虫在液体培养基中培养后，经收集、洗涤并重悬于确定密度的溶液中。随后使用蠕动泵液体分配器将线虫加入黑色平底384孔板中。化学文库中的小分子或待测样品（如水、食物或土壤）可被加入含有线虫的孔中。体内实时荧光强度通过荧光酶标仪进行测定。该方法可适用于任何在C. elegans中具有合适报告基因的可诱导基因。许多可诱导的应激和发育相关的转录通路在C. elegans中已有明确定义，并且已有大量对应的绿色荧光蛋白（GFP）转基因报告品系4。当与适当的转基因报告系统结合时，本方法可用于筛选信号通路调节剂，或开发针对环境污染物的可靠生物传感检测方法。
我们展示我们的 秀丽隐杆线虫 培养与分液方案结合我们开发的高通量筛选检测方法以监测 秀丽隐杆线虫 cap ‘n’ collar 转录因子 SKN-1。SKN-1 及其哺乳动物同源物 Nrf2 在氧化应激和异生物质应激期间激活细胞保护基因5-10Nrf2 可保护哺乳动物免受多种与年龄相关疾病（如癌症、神经退行性疾病和慢性炎症）的侵害，并已成为主要的化学治疗靶点11-13我们的检测基于一种用于SKN-1靶基因的GFP转基因报告系统 gst-414，编码谷胱甘肽-S-转移酶6。 该 gst-4 报告基因也是一种生物传感器，可用于检测激活 SKN-1 的外源性和氧化性化学物质，能够识别丙烯酰胺和甲基汞等污染物的低浓度水平15-16.
方案
1. 细菌线虫食物的制备
第1天
- 向500 ml添加了50 μg/ml链霉素的TB培养基中加入5 ml饱和的E. coli OP50细菌培养液，在37°C、225 rpm条件下于摇床培养箱中过夜培养。
第2天
- 将过夜培养的细菌培养物分装至十个50 ml离心管中，在冷藏离心机中以2,500 rcf离心20分钟。
- 弃去LB肉汤，将每份菌体沉淀重悬于10 ml液体线虫生长培养基（NGM）中。在摇床中水平振荡15分钟以充分重悬细菌。配制NGM缓冲液的方法：将3 g NaCl加入1 L去离子水中，高压灭菌。冷却至55°C后，依次加入以下无菌溶液：1 ml 1 M CaCl2、1 ml 1 M MgSO4和25 ml 1 M磷酸钾，pH 6.0。
- 将细菌培养物在冷藏离心机中以2,500 rcf离心20分钟。
- 弃去NGM缓冲液，称量细菌沉淀。
- 加入与沉淀体积相等的NGM缓冲液重悬菌体，将3 ml细菌浓缩液分装至15 ml离心管中，于-20°C保存。
2. 大规模 C. elegans 液体培养
我们使用一种转基因品系 VP596 (dvIs19[pAF15(gst-4::GFP::NLS)];vsIs33[dop-3::RFP])，该品系携带两种荧光报告构建体：Pgst-4::GFP14 用于监测 SKN-1 活性，Pdop-3::RFP17 用作线虫数量归一化的标准。
第1天
- 混合150 ml NGM缓冲液、1.5 ml LB肉汤、150 μl 5 mg/ml胆固醇（溶于乙醇）和75 μl 100 mg/ml链霉素。将混合物过滤除菌后加入一个1升无菌烧瓶中。
注意：在NGM缓冲液中添加1% LB肉汤有助于防止线虫黏附在玻璃器皿和塑料器皿上，但该浓度不足以支持细菌生长。 - 采用标准次氯酸盐法同步线虫18。可在单个15 ml离心管中用5 ml次氯酸盐溶液（3.75 ml无菌水、1 ml家用漂白剂和250 μl 10 N NaOH）处理最多0.5 ml的产卵成虫。用无菌水洗涤释放出的卵，并将其重悬于10 ml NGM缓冲液中。
- 用NGM缓冲液将卵样品稀释100倍（例如，100 μl加入10 ml中），分别计数三个5 μl等分试样中的卵数。将平均卵数乘以200,000（100倍稀释因子 × 2,000）以估算卵的总数。
- 将200,000至200万枚卵加入含NGM缓冲液的烧瓶中，在20°C、100 rpm条件下振荡培养。
第2天
- 加入虫卵至锥形瓶后至少16小时，用无菌血清移液管吸取约0.5 ml悬浮的线虫培养液。取三滴每滴5 μl的样品滴加至无菌培养皿盖上。将皿盖置于-20°C冰箱中冷冻1-2分钟以麻痹线虫。计数每5 μl中平均存活的孵化线虫数量，再乘以30,000（150 ml/5 μl），以估算孵化线虫的总数。
- 解冻一管冷冻保存的OP50菌液（见方案1.6），每50万条孵化线虫向线虫培养物中加入3 ml 50% OP50菌液。在20°C下以100 rpm振荡培养，线虫约51小时后将发育至L4幼虫期和年轻成虫期。细菌初始OD600应约为2.200。通过吸光度监测细菌量，若OD600降至0.900以下，需补充添加细菌。
3. 线虫收集与分配
第4天
- 使用无菌血清移液管将约 0.5 ml 悬浮的线虫培养物转移至标准 NGM 琼脂平板上。在体视显微镜下观察线虫，确保大多数为 L4 幼虫或年轻成虫。L4 幼虫在身体中部腹侧会有一个透明斑点，年轻成虫体型稍大，且无透明斑点。
- 将线虫培养物倒入无菌 50 ml 离心管中，并将离心管置于实验台上的试管架中。静置约 10 分钟，使线虫沉降。通过抽吸或移液去除上清液。
注意：此步骤对于去除未孵化的卵或发育不良的线虫非常重要，因为这些杂质的沉降速度比 L4 幼虫和年轻成虫更慢。 - 将所有线虫收集至一个 50 ml 离心管中，用含 1% LB 肉汤的 NGM 缓冲液（NGM+LB）清洗 3–4 次，以去除细菌。
注意：最好使用摆桶式离心机，以 500 rcf 离心 30 秒收集线虫，并更换为新鲜的 NGM+LB 缓冲液。 - 清洗后，用 NGM+LB 缓冲液将离心管补至 50 ml，并倒入定制的线虫分配烧瓶中。加入一个小的搅拌子并持续搅拌以保持线虫均匀悬浮。如上所述，计数三个 5 μl 液滴中的线虫数量，并用 NGM+LB 缓冲液稀释，直至每 5 μl 液滴含有 12–15 条线虫（约 2.5–3.0 条/μl）。
注意：至少需要约 20 ml（60,000 条线虫）的悬浮液，以填充分配烧瓶和分配卡匣的死体积。每块 384 孔板约需 35,000 条线虫，即 11.5 ml 悬浮线虫液。 - 装载一个 10 μl 分配卡匣，并用 70% 乙醇预润洗进行灭菌。随后用无菌水预润洗以去除乙醇。
- 将分配卡匣末端插入烧瓶中，位置应刚好位于搅拌子上方，且不干扰其运动。确保线虫在整个烧瓶中保持均匀悬浮。设置分配器以低速分配，并设置 2 次预脉冲。预润洗并运行至少 10 ml 的悬浮线虫液。根据需要快速填充各孔板，以防止线虫在管路中沉降。
- 用透气封口膜密封孔板。
- 将孔板置于培养箱内的摇床上，在适合实验的温度下培养。切勿叠放孔板。
4. 荧光分析
- 将目标板放入微孔板读数仪中，使用适当的发射和激发波长测量每个孔的荧光强度（本实验所用滤光片：GFP 485/20ex 528/20em；RFP 540/25ex 590/35em）。
- 计算 GFP/RFP 的比值，并以对照孔（不含激活化合物）的读数进行归一化，以确定不同处理条件下荧光强度的准确倍数差异。
5. 代表性结果：
我们的SKN-1检测采用了一种染色体整合的双报告基因菌株（VP596）。如图1所示，线虫数量与分配体积之间具有良好的相关性。如图2A和2B所示，在384孔板中，每个孔的总GFP和RFP荧光信号在孔间具有高度可重复性。如图2C所示，在384个孔中，未诱导的Pgst-4::GFP荧光与Pdop-3::RFP呈线性相关。当以GFP/RFP比值表示时，荧光信号在384孔板的各个孔之间表现出极高的可重复性（比较图2D与图2A中的变异系数），表明Pdop-3::RFP报告基因具有降低变异性的能力。如图3所示，在384孔板中，使用SKN-1激活型异生物质（38 μM 桃叶珊瑚素）诱导后，GFP相对于RFP的诱导效应显著且高度可重复。
图 1. 线虫数量与分配体积的关系。将线虫稀释至约 2/μl 后，分配至 24 孔板中，使用体视显微镜进行人工计数。每种体积重复 8 个孔，N = 8。
图2. 分配至384孔板中的线虫总荧光信号具有可重复性。将线虫稀释至约2.5/μl，每孔加入30 μl至384孔板的每个孔中。所有孔的GFP（A）和RFP（B）荧光信号变异系数低于9%。（C）GFP荧光与RFP荧光高度相关。（D）计算GFP与RFP的比值后，变异系数降低至6%以下。（A、B和D）实线表示均值，虚线表示均值上下三个标准差。
图3. Pgst-4::GFP 的激活具有强效性和一致性。将约75条L4期线虫分配至384孔板的所有孔中，并在每隔一列中加入38 μM 胡桃醌。孵育21小时后检测GFP和RFP荧光强度。所有对照孔（1.0）和胡桃醌处理孔（8.9）的平均相对荧光比值以实线标出。对照组均值上方三个标准差及胡桃醌组均值下方三个标准差以虚线标出。
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讨论
我们介绍了一种用于培养和分装大量转基因线虫的方法。用于培养线虫的设备是进行分子克隆实验的实验室中的常规设备，而液体处理和荧光检测设备则是处理大量微孔板的实验室中的标准设备。其他分装大量活体 C. elegans 的方法需要昂贵的颗粒分选设备19。利用 Pgst-4::GFP 检测方法可用于筛选帽“n”颈样转录因子的小分子调节剂，并检测环境和食品样品中的外源性物质及氧化性污染物14,16。目前已有多种稳定且可诱导的转基因GFP报告系统，适用于多种信号通路和环境刺激4，因此本方法应可用于开发针对多种通路的调节剂，并检测广泛类型的污染物。
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
C. elegans 的转基因品系由秀丽隐杆线虫遗传学中心（明尼苏达大学，明尼苏达州，明尼阿波利斯）提供。本研究工作由美国国立卫生研究院（NIH）R21基金项目NS0667678-01资助，项目负责人为KS。所有作者均参与了数据的收集、分析与解释。CKL、KS和KPC参与了论文的撰写与修改。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| LB 肉汤 | Research Products International Corp. | L24066 | |
| 优质肉汤 | Research Products International Corp. | T15100 | |
| Synergy HT 多功能微孔板读板仪 | BioTek | 滤光片：GFP 485/20ex 528/20em；RFP 540/25ex 590/35em | |
| MicroFlo Select 分液器 | BioTek | ||
| 线虫分装瓶 | Southern Scientific Inc., Micanopy, FL | 定制组装 (352) 284-2531 | |
| 384 孔微孔板 | Greiner Bio-One | 5678-1209 | |
| 透气封板膜 | Nalge Nunc international | 241205 | |
| (5-羟基-对-萘醌)胡桃醌 | Acros Organics | 121640010 | 胡桃醌溶于 DMSO |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D-5879 | |
| C. elegans 转基因品系 | 作者’s 实验室 | VP596 | Pgst-4::GFP 和 Pdop-3::RFP |
参考文献
- Simeonov, A. Quantitative high-throughput screen identifies inhibitors of the Schistosoma mansoni redox cascade. PLoS Negl Trop Dis. 2, e127-e127 (2008).
- Giacomotto, J., Segalat, L. High-throughput screening and small animal models, where are we. Br J Pharmacol. 160, 204-216 (2010).
- Artal-Sanz, M., de Jong, L., Tavernarakis, N. Caenorhabditis elegans: a versatile platform for drug discovery. Biotechnol J. 1, 1405-1418 (2006).
- WormBase [Internet]. , Available from: http://www.wormbase.org (2012).
- An, J. H., Blackwell, T. K. SKN-1 links C. elegans mesendodermal specification to a conserved oxidative stress response. Genes Dev. 17, 1882-1893 (2003).
- Choe, K., Przybysz, A., Strange, K. The WD40 repeat protein WDR-23 functions with the CUL4/DDB1 ubiquitin ligase to regulate nuclear abundance and activity of SKN-1 in Caenorhabditis elegans. Mol Cell Biol. 29, 2704-2715 (2009).
- Hasegawa, K. Acrylamide-responsive genes in the nematode Caenorhabditis elegans. Toxicol. Sci. 101, 215-225 (2008).
- Tullet, J. M. A. Direct inhibition of the longevity-promoting factor SKN-1 by insulin-like signaling in C. elegans. Cell. 132, 1025-1038 (2008).
- Oliveira, R. P. Condition-adapted stress and longevity gene regulation by Caenorhabditis elegans SKN-1/Nrf. Aging Cell. , Forthcoming (2009).
- Park, S. -K., Tedesco, P. M., Johnson, T. E. Oxidative stress and longevity in Caenorhabditis elegans as mediated by SKN-1. Aging Cell. 8, 258-269 (2009).
- Hayes, J. D., McMahon, M., Chowdhry, S., Dinkova-Kostova, A. T. Cancer chemoprevention mechanisms mediated through the Keap1-Nrf2 pathway. Antioxid Redox Signal. , (2010).
- Kwak, M. K., Kensler, T. W. Targeting NRF2 signaling for cancer chemoprevention. Toxicol Appl Pharmacol. 244, 66-76 (2010).
- Leiser, S. F., Miller, R. A. Nrf2 signaling, a mechanism for cellular stress resistance in long-lived mice. Mol Cell Biol. 30, 871-884 (2010).
- Link, C. D., Johnson, C. J. Reporter transgenes for study of oxidant stress in Caenorhabditis elegans. Methods Enzymol. 353, 497-505 (2002).
- Vanduyn, N., Settivari, R., Wong, G., Nass, R. SKN-1/Nrf2 inhibits dopamine neuron degeneration in a Caenorhabditis elegans model of methylmercury toxicity. Toxicol Sci. , (2010).
- Hasegawa, K. A rapid and inexpensive method to screen for common foods that reduce the action of acrylamide, a harmful substance in food. Toxicol Lett. 175, 82-88 (2007).
- Chase, D. L., Pepper, J. S., Koelle, M. R. Mechanism of extrasynaptic dopamine signaling in Caenorhabditis elegans. Nature Neuroscience. 7, 1096-1103 (2004).
- Hope, I. A. C. elegans, a Practical Guide. , Oxford University Press. (2005).
- Pulak, R. Techniques for analysis, sorting, and dispensing of C. elegans on the COPAS flow-sorting system. Methods Mol Biol. 351, 275-286 (2006).
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